この作品は、YMにバロウズウェルカムの研究者賞で、エール大学からMDへのブラウン - コックスポストドクトラルフェローシップでサポートされていました。

材料： <ul><li>タンパク質試料 - リゾチーム（50 mg / ml）を</li><li>ドロップ24ウェルトレーハンギング</li><li>シッティングドロップ24ウェルトレー</li><li> Microbatchの結晶化96ウェルトレー</li><li>結晶化ソリューション（どちらか市販または自家製） </li><li>シリコングリース</li><li>ルアーロックせずに5 mLの注射器</li><li>シリコーンカバースライド</li><li>光学シールテープ</li><li>パラフィン</li><li>低保持のヒントと0.1〜2μLマイクロピペット</li><li>ピンセット</li><li>プロのワイプ</li></ul> 1。ハンギング/ドロッププロシージャを座って。 <ol><li>初期画面のために一つの試験条件のスパース行列不完全な階乗のメソッドを利用する市販のスクリーンを使用することができます。スパース行列の不完全要因加算法は、電圧値と高分子のための既知の結晶化条件（カーターとカーター、1979; Cudney ら、1994;。Jancarikと金、1991;。Jancarikら 、1991）から選択される。結晶化条件がすでにわかっている場合は、狭い画面はオリジナルのヒットの周りに沈殿剤濃度とpHを変化させること、組み立てることができます。最も一般的に成功した沈殿は硫安が続くポリエチレングリコール（PEG）、である。結晶化に使用したすべての記録された高分子の沈殿剤の約60％をこれら2つの沈殿剤は、アカウント（。ギリランドら 、1994;キンバーら、2003;。。らページ、2003）。 </li><li>あなたの結晶化溶液を調製。通常、これらの条件は、沈殿剤、ある種の塩とpHを設定するには、バッファから結合されます。場合によっては添加剤は、目的のタンパク質のために特別に追加される可能性があります。すべてのストック溶液を0.22μmのフィルターを使用してフィルタリングする必要があります。ストック溶液の一部は、（50％PEGは、グリセリン、PEG - MME、など）非常に粘性のあるかもしれない。 <ul><li> 0.6 1.5 mLの、0.8、1.0、1.2、1.4、0.1 M NaOAc pHは4.0、4.3、4.6と4.9の1.6 M NaClをそれぞれを（24ソリューションの合計）の準備</li></ul></li><li>あなたのタンパク質サンプルを解凍し、氷上に置きます。目的のタンパク質は、（もしそうなら、4℃で保存）/解凍サイクルを凍結する敏感でない限り、タンパク質の株式は、-80℃で保存してください。典型的なタンパク質の濃度は高濃度が通常より良い結果を与えることで、50〜50 mg / mLの範囲内である。 </li><li> 000xg / 4、サンプル15min/18をスピン° C - いくつかのタンパク質は、解凍工程の後に部分的に集約し、沈殿する傾向がある。これらの凝集体は、したがって、完全なスピンがダウンして、あなたのサンプル中の唯一の可溶性分子を持って確保するタンパク質分子の残りの非晶析出を促進することができます。トレイを設定するまで、氷上に蛋白質を保つ。 </li><li> UV分光光度計を用いて280nmでの吸光度からタンパク質濃度を決定する。タンパク質濃度は、吸光度測定値と蛋白質の吸光係数から計算することができます。 ：吸光係数はExpasyウェブサイト上のProtParamツールを使用して計算することができます<a href="http://ca.expasy.org/tools/protparam.html">http://ca.expasy.org/tools/protparam.html</a> </li><li> 24ウェルハング/トレイの設定のスキーム（図2B）によると沈殿剤溶液500μLをドロップトレイに座っての井戸を埋める。ウェルの縁の周りにシリコーングリースのリングを作成します。リングは良くはシールされているように空気の圧力上昇を防ぐための小さなギャップを持つ必要があります。座っ滴で、よくは（図2A）テープで封印されているため、グリースの必要はありません。 </li><li>カバースライドを取り、凝縮した空気スプレーで掃除、またはワイププロ - ダストが結晶化ドロップの解釈を容易にし、汚染を除去する避ける。ドロップ、カバースライドを座ってするために使用されていません。その代わり、よくは、タンパク質と沈殿剤とを混合されている棚を含んでいます。 </li><li>カバースライドでタンパク質試料とリザーバー溶液の等量を置く。タンパク質と沈殿剤の異なるボリュームを最適化プロセスの一部として試されることがあります。希薄なタンパク質サンプルのために望ましいことができ、結晶の核生成や成長を遅らせるために平衡後降下、でタンパク質の正味濃度の沈殿剤の結果よりも多くのタンパク質を使用する。ドロップソリューション内の他の不揮発性の物質も、同じ要因によって濃縮される。カバースライド上にタンパク質とリザーバー溶液をピペッティングするときに、気泡の形成を避けるために非常に注意してください。これは多くの場合空気​​がピペットから吹き出される場合に発生します。 <ul><li>カバーのスライドの中央に0.02 M NaOAcのpHを4.9に50 mg / mLのリゾチームのロード2μLをし、そのためにリザーバー溶液2μLを加える。懸滴。 </li><li>ドロップ座り：荷重棚の中心から50 mg / mLのリゾチーム溶液2μLをし、そのためにリザーバー溶液2μLを加える。 </li></ul></li><li>静かにカバーをスライドして反転し、井戸の上にグリースをリングの上に下に置く。 prにグリースにやさしく空気が溝に沿って井戸から脱出できることを押し下げイベントの空気の圧力の井戸で蓄積し、よく密封してください。ウェル内の空気の圧力上昇は、よくシール性を損なう、カバースライドを上げることができます。シッティングドロップ法では、光学的に透明な透明テープは井戸をカバーするために使用されます。したがって、このメソッドはシールですべての行/列に行われます。 </li><li>トレイが完了するまで次のウェルに移ります。 </li><li>セットアップ時にトレイを確認してください - ダスト粒子や他の汚染を排除するタンパク質結晶の偽陽性の識別を減らすことができます。 </li><li>あなたの実験を文書化するスコアリングシートを使用してください。 </li><li>一般的に4 ° Cと室温との間で、目的の培養温度でトレイを置きます。 20 ° Cは、最も一般的に成功しています。静かにトレイを処理し、どんな揺れを避けるために注意してください。インキュベーターの扉を開いたり閉じたりしながら注意してください。移転やインキュベーション中に、振動や温度変化は、結晶成長を防止または否定的に結晶品質に影響を与える可能性があります。物質を吸収するショック（例えばパッキンの泡）が結晶トレイの下に詰め物として使用することができます。 </li><li>結晶のトレイは、次の日を確認して、数日ごとに、常に注意してトレイを処理。トレイ特定のスコアリングシート内の任意の調査結果とドロップの形態を文書化します。結晶が時折はるかに早く（ほとんどすぐに）以降（最大で数ヶ月に！）表示されますが、結晶は、通常、表示に2-5日かかる。結晶化条件が特定されており、結晶の成長速度がわかれば、それは結晶が出現し、彼らの最終的な大きさの少なくとも半分に成長するまでトレイをそっとしておくのが最善の方法です。トレーが邪魔されないままにしておくと、それ故に大きな結晶の小さい数字を生成、結晶核生成のイベントの数を減らすことができます。 </li></ol> 2。手順をMicrobatch： <ol><li>タンパク質試料と沈殿剤の調製は、前述の通りである。 </li><li>エアスプレー、ほこりや他の大きな粒子を避けるために、新しいmicrobatchトレイ。 </li><li> microbatchトレイで、高3ミリメートル（井戸をカバーするだけの十分な）にパラフィン油をいっぱいに。油のアクセスを削除します。 </li><li>よく充填済み油にタンパク質溶液（50 mg / mLのリゾチーム）の1μLをロードする - 井戸の底（図2A）に直接ソリューションをピペッティングすることを確認してください。 </li><li>ドロップは、蛋白質の液滴で十分とヒューズの底に沈むことを確認 - よくトレイのセットアップ方式（図2B）によると中に沈殿剤溶液の1μLをロードする。 </li><li>トレイが完了するまで次のウェルに移動します。 </li><li>吊り下げ/シッティングドロップの手順のステップ11から14に従ってください。 </li></ol> 3。代表的な結果： 結晶化は通常、X線結晶構造解析のボトルネックと呼ば​​れています。沈殿条件のスパース行列不完全な階乗の画面は、通常、それらの大きな単結晶の中で、タンパク質の凝集と沈殿の多くの異なったタイプを生成します。タンパク質や沈殿剤濃度が高すぎる場合、1つは、明確な形と大きさ（アモルファス降水量）と茶色の問題を見ることができます。解決策が不飽和のされている場合、ドロップはしばしば降水量のあらゆる種類の完全に明確で欠いているだろう。図3は、降水現象と結晶（デッサウら 、2006）のためのいくつかの例を示しています。より詳細な解釈を持つより多くの降水現象は、次のURLで参照することができます<a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。タンパク質の結晶化の原理。 タンパク質の結晶化の原理。蒸気拡散実験（）で沈殿剤と蛋白質の等容量はドロップに存在しています。水が出て拡散すると平衡はドロップとリザーバー溶液との間で達成されるまで、沈殿剤やタンパク質濃度の両方が倍増されます。バッチ晶析では（B）沈殿剤と蛋白質の濃度は、実験中に変化しません。指して - タンパク質は不飽和のまま、結晶が、ポイントBを形成することができます - タンパク質の核生成が起こり、結晶が形成し始めたと溶液中のタンパク質の濃度は飽和状態に低下します。ポイントC - タンパク質は沈殿するが、結晶は依然として大​​きくなることがあります。キャピラリー差し込ま-ゲルを使用して（C）透析結晶化。塩は、ゲルのプラグを介して（および/または沈殿剤拡散タンパク質試料に）タンパク質試料から拡散するように結晶が現れます。 <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。典型的なタンパク質の結晶化実験の概要。 ハンギングドロップ蒸気拡散、シッティングドロップ蒸気拡散、およびmicrobatchタンパク質の結晶化のための（A）の手順。それぞれのケースでは、濃縮されたタンパク質試料の少量をprecipitanの等しいまたはより小さいボリュームと混合され、T溶液と平衡化させた。 （B）鶏リゾチーム、24ウェルトレーの結晶は塩化ナトリウムの様々な濃度（沈殿剤）とし、種々のpHにおいて緩衝剤として0.1 M酢酸ナトリウム（ - 4.9 4.0）と設定されています。 <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。タンパク質結晶化実験の典型的な成果。 （A）アモルファス沈殿。タンパク質や沈殿剤（または両方）を高濃度にある時。 （B）相分離。高濃度で一定の沈殿剤と混合したときにタンパク質や洗剤は、別のフェーズに分けることができます。 （C）AtCSN7のロッド状のタンパク質の結晶は、ポリエチレングリコール8000及び酢酸マグネシウム（デッサウら 、2006）で得られた。 （D）リゾチームの結晶は、1.0 M NaClと酢酸ナトリウムのpHを4.9に得られた。 （E）飽和滴の下で、通常はクリアのまま。モシェデッサウによる写真撮影。

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	<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , (1999).</li><li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments.">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li><li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth.">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li><li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+(CSN7).">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li><li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Macromolecule+Crystallization+Database,+Version+3.0:+new+features,+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data.">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li><li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+matrix+sampling:+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins.">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li><li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li><li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+mining+crystallization+databases:+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens.">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li><li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+growth+of+proteins,+nucleic+acids,+and+viruses+in+gels.">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallization of biological macromolecules. , (1999).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li><li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics:+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome.">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

この記事では、タンパク質の結晶化のための一般的な現在のプロトコルを説明し、実証する。マルチステップの手順でそれ以来、いくつかの考慮事項は次のことに注意一つのニーズがあります。非常に少量（0.5-2μL）で作業する場合、蒸発による減少の乾燥は大きな懸念事項です。したがって、それは十分に制御された環境（低空気の流れと、高湿度と厳しい温度制御）で動作するように、?...

<table><tbody><tr><td>Lysozyme</td><td></td><td>Sigma-aldrich</td><td>L6876-1G</td></tr><tr><td>24 well VDX Plate</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-142</td></tr><tr><td>24 well Cryschem Plate</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-158</td></tr><tr><td>Dow Corning Vacuum Grease</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-510</td></tr><tr><td>Siliconized glass circle coverslides</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-231</td></tr><tr><td>100% paraffin oil</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-411</td></tr><tr><td>1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-511</td></tr><tr><td>96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate)</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-098</td></tr></tbody></table>

protein crystallization for x-ray crystallography

彼らがどのように機能するか推測する生体高分子の三次元構造を使用すると、現代生物学の最も重要な分野の一つである。原子分解能構造の可用性は、タンパク質の機能の深さとユニークな理解を提供し、そして生きている細胞の内部の仕組みを解明するのに役立ちます。これまでに、蛋白質構造データバンク（RCSB - PDB）のエントリの86％がX線結晶学を用いて決定された巨大分子の構造です。 結晶解析に適した結晶を得るために、高分子（例えばタンパク質、核酸、タンパク質 - タンパク質複合体やタンパク質 - 核酸複合体）が均一にまで精製する必要がある、またはできるだけ近い均一になるまで。準備の均一性は高解像度（;マクファーソン、1999 Bergfors、1999）に回折する結晶を得るための重要な要素です。 結晶は、過飽和に高分子をもたらす必要があります。サンプルは、したがって、高分子の凝集または沈澱（通常は20〜50 mg / mL）を起こすことなく可能な限り高い濃度に濃縮する必要があります。沈殿剤にサンプルを導入することは、溶液から成長する大型の三次元結晶をもたらすことができます溶液中でのタンパク質結晶の核形成を促進することができます。蒸気拡散とバッチの結晶化：結晶を取得する2つの主なテクニックがあります。蒸気拡散、沈殿剤と蛋白溶液の混合物を含むドロップで純粋な沈殿剤とチャンバー内に封入されている。ドロップと沈殿剤の浸​​透圧は（図1A）等しくなるまで水蒸気は、ドロップから拡散する。均衡が達成されるまで滴の脱水は、理想的に相図の結晶核のゾーンで、タンパク質と沈殿剤の両方の遅い濃度を引き起こします。バッチ法は、沈殿剤の適切な量（図1B）とを混合タンパク質によって核のゾーンに直接タンパク質をもたらすに依存しています。このメソッドは、通常ドロップのうち水の拡散を防ぐために、パラフィン/鉱物油の混合物の下に実行されます。 ここでは、石油のもとでのバッチ結晶化に加えて、ドロップやシッティングドロップを吊り下げ、蒸気の拡散のための実験装置の二種類のデモンストレーションを行います。

Crystallization is usually referred to as the bottleneck of X-ray crystallography. A sparse matrix incomplete factorial screen of precipitating conditions typically produces many different types of protein aggregation and precipitation, among them large single crystals. If the protein or precipitant concentrations are too high one can see brown matter with no distinct shape and size (amorphous precipitation). When the solution is undersaturated, the drop will often be completely clear and devoid of any kind of precipitat...

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Protein Crystallization for X-ray Crystallography

分子の3次元構造がどのように分子の機能のユニークな理解を提供します。ニア原子分解能で構造決定のための主要な方法は、X線結晶です。ここで、我々はX線結晶構造決定に適している任意の高分子の三次元結晶を得るための現在の方法を示しています。

X -線結晶構造のためのタンパク質の結晶化

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

protein-crystallization-for-x-ray-crystallography

Research

JoVE Journal

Biology

63.4K ビュー.  Yale University. 分子の3次元構造がどのように分子の機能のユニークな理解を提供します。ニア原子分解能で構造決定のための主要な方法は、X線結晶です。ここで、我々はX線結晶構造決定に適している任意の高分子の三次元結晶を得るための現在の方法を示しています。

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Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize proteins, DNAs, RNAs, and their complexes can however not be predicted. Employing a broad variety of conditions is a way to increase the yield of quality diffraction crystals. Two fully automated systems have been developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, England, MRC-LMB) that facilitate crystallization screening against 1,920 initial conditions by vapor diffusion in nanoliter droplets. Semi-automated protocols have also been developed to optimize conditions by changing the concentrations of reagents, the pH, or by introducing additives that potentially enhance properties of the resulting crystals. All the corresponding protocols will be described in detail and briefly discussed. Taken together, they enable convenient and highly efficient macromolecular crystallization in a multi-user facility, while giving the users control over key parameters of their experiments.

Automated systems and protocols for the routine preparation of a large number of screens and nanoliter crystallization droplets for vapor diffusion experiments are described and discussed.

MRC 分子生物学研究所高分子結晶化のプロトコルを自動

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

生化学

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in their largest dimension, which used to represent a challenge. We present two alternative workflows for the structure determination of protein microcrystals by X-ray crystallography with a particular focus on crystals grown in vivo. The microcrystals are either extracted from cells by sonication and purified by differential centrifugation, or analyzed in cellulo after cell sorting by flow cytometry of crystal-containing cells. Optionally, purified crystals or crystal-containing cells are soaked in heavy atom solutions for experimental phasing. These samples are then prepared for diffraction experiments in a similar way by application onto a micromesh support and flash cooling in liquid nitrogen. We briefly describe and compare serial diffraction experiments of isolated microcrystals and crystal-containing cells using a microfocus synchrotron beamline to produce datasets suitable for phasing, model building and refinement.
These workflows are exemplified with crystals of the Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin produced by infection of insect cells with a recombinant baculovirus. In this case study, in cellulo analysis is more efficient than analysis of purified crystals and yields a structure in ~8 days from expression to refinement.

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

A protocol is presented for X-ray crystallography using protein microcrystals. Two examples analyzing in vivo-grown microcrystals after purification or in cellulo are compared.

タンパク質結晶の微結晶化および<em&gt;セルロで</em&gt;回折

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We describe a versatile microfluidic chip that enables the production of crystals by the efficient method of counter-diffusion. The convection-free environment provided by the microfluidic channels is ideal for crystal growth and useful to diffuse a substrate into the active site of the crystalline enzyme. Here we applied this approach to the CCA-adding enzyme of the psychrophilic bacterium Planococcus halocryophilus in the presented example. After crystallization and substrate diffusion/soaking, the crystal structure of the enzyme:substrate complex was determined at room temperature by serial crystallography and the analysis of multiple crystals directly inside the chip. The whole procedure preserves the genuine diffraction properties of the samples because it requires no crystal handling.

A versatile microfluidic device is described that enables the crystallization of an enzyme using the counter-diffusion method, the introduction of a substrate in the crystals by soaking, and the 3D structure determination of the enzyme:substrate complex by a serial analysis of crystals inside the chip at room temperature.

酵素の結晶化と構造決定:多用途マイクロ流体チップにおける連続結晶学による基質複合体

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins on-chip with the dialysis method and allowing in situ single-crystal or serial crystallography experiments at room temperature. The protocol details the fabrication process of the microchips, the manipulation of the on-chip crystallization experiments and the treatment of the in situ collected X-ray diffraction data for the structural elucidation of the protein sample. The main feature of this microfabrication procedure lies on the integration of a commercially available, semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane in between two layers of the chip. The molecular weight cut-off of the embedded membrane varies depending on the molecular weight of the macromolecule and the precipitants. The device exploits the advantages of microfluidic technology, such as the use of minute volumes of samples (&#60;1 &#181;L) and fine tuning over transport phenomena. The chip coupled them with the dialysis method, providing precise and reversible control over the crystallization process and can be used for investigating phase diagrams of proteins at the microliter scale. The device is patterned using a photocurable thiolene-based resin with soft imprint lithography on an optically transparent polymeric substrate. Moreover, the background scattering of the materials composing the microchips and generating background noise was evaluated rendering the chip compatible for in situ X-ray diffraction experiments. Once protein crystals are grown on-chip up to an adequate size and population uniformity, the microchips can be directly mounted in front of the X-ray beam with the aid of a 3D printed holder. This approach addresses the challenges rising from the use of cryoprotectants and manual harvesting in conventional protein crystallography experiments through an easy and inexpensive manner. Complete X-ray diffraction data sets from multiple, isomorphous lysozyme crystals grown on-chip were collected at room temperature for structure determination.

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This paper details the fabrication protocol of microfluidic chips developed for on-chip protein crystallization with the dialysis method and in situ X-ray diffraction experiments. The microfabrication process makes it possible to integrate a semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane with any molecular weight cut-off, between two layers of the chip.

In Situ X線回折研究のためのマイクロダイアルシスによるチップ上のタンパク質の結晶化

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

化学

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since cryogenic temperatures are non-physiological and may prevent, deter, or even alter protein structural dynamics, a robust method for routine X-ray diffraction experiments at room temperature is highly desirable. The crystal-on-crystal device and its accompanying hardware and software used in this protocol are designed to enable in situ X-ray diffraction at room temperature for protein crystals of different sizes without any sample manipulation. Here we present the protocols for the key steps from device assembly, on-chip crystallization, optical scanning, crystal recognition to X-ray shot planning and automated data collection. Since this platform requires no crystal harvesting nor any other sample manipulation, hundreds to thousands of protein crystals grown on chip can be introduced into an X-ray beam in a programmable and high-throughput manner.

This contribution describes how to set up protein crystallization on crystal-on-crystal devices and how to perform automated serial data collection at room temperature using the on-chip crystallization platform.

室温でのオンチップ結晶化と大規模シリアル回折

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug discovery. To date, X-ray crystallography remains the most successful method for solving three-dimensional protein structures at atomic resolution. With recent advances in serial crystallography, either using X-ray free electron lasers (XFELs) or synchrotron light sources, protein crystallography has progressed to the next frontier, where the ability to acquire time-resolved data provides important mechanistic insights into the behavior of biological molecules at room temperature. This protocol describes a straightforward high-throughput (HTP) workflow for screening crystallization conditions through the use of a 96-well dialysis plate. These plates follow the Society for Biomolecular Screening (SBS) standard and can be easily set up using any standard crystallization laboratory. Once optimal conditions are identified, large quantities of crystals (hundreds of microcrystals) can be produced using the dialyzer. To validate the robustness and versatility of this approach, four different proteins were crystallized, including two membrane proteins.

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

The presented protocol describes a straightforward approach for screening protein crystallization conditions and crystal growth using a 96-well high-throughput dialysis plate. The use of dialyzer tubes for the large-scale growth of microcrystals is also demonstrated for serial crystallography and MicroED applications.

マイクロダイアリシス による ハイスループットタンパク質結晶化

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

タンパク質結晶化のためのハイスループットスクリーニング

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into an ordered lattice amenable to diffraction remains challenging. The crystallization of biomolecules is largely experimentally defined, and this process can be labor-intensive and prohibitive to researchers at resource-limited institutions. At the National High-Throughput Crystallization (HTX) Center, highly reproducible methods have been implemented to facilitate crystal growth, including an automated high-throughput 1,536-well microbatch-under-oil plate setup designed to sample a wide breadth of crystallization parameters. Plates are monitored using state-of-the-art imaging modalities over the course of 6 weeks to provide insight into crystal growth, as well as to accurately distinguish valuable crystal hits. Furthermore, the implementation of a trained artificial intelligence scoring algorithm for identifying crystal hits, coupled with an open-source, user-friendly interface for viewing experimental images, streamlines the process of analyzing crystal growth images. Here, the key procedures and instrumentation are described for the preparation of the cocktails and crystallization plates, imaging the plates, and identifying hits in a way that ensures reproducibility and increases the likelihood of successful crystallization.

著者スポットライト:タンパク質結晶構造解析のための結晶ヒットを得るためのハイスループットスクリーニング(英語)  

This protocol details high-throughput crystallization screening, ranging from the 1,536 microassay plate preparation to the end of a 6 week experimental time window. Details are included about the sample setup, the imaging obtained, and how users can perform analyses using an artificial intelligence-enabled graphical user interface to quickly and efficiently identify macromolecular crystallization conditions.

タンパク質結晶構造解析のためのクリスタルヒットを得るためのハイスループットスクリーニング(英語)

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

タンパク質の自動結晶化とリアルタイムデータ収集

Crystallization and In Situ Room Temperature Data Collection Using the Crystallization Facility at Harwell and Beamline VMXi, Diamond Light Source

Protocols for robotic protein crystallization using the Crystallization Facility at Harwell and in situ room temperature data collection from crystallization plates at Diamond Light Source beamline VMXi are described. This approach enables high-quality room-temperature crystal structures to be determined from multiple crystals in a straightforward manner and provides very rapid feedback on the results of crystallization trials as well as enabling serial crystallography. The value of room temperature structures in understanding protein structure, ligand binding, and dynamics is becoming increasingly recognized in the structural biology community. This pipeline is accessible to users from all over the world with several available modes of access. Crystallization experiments that are set up can be imaged and viewed remotely with crystals identified automatically using a machine learning tool. Data are measured in a queue-based system with up to 60&#176; rotation datasets from user-selected crystals in a plate. Data from all the crystals within a particular well or sample group are automatically merged using xia2.multiplex with the outputs straightforwardly accessed via a web browser interface.

著者スポットライト:医薬品開発のためのタンパク質構造解析の進歩 

We present a protocol for the crystallization of proteins using the crystallization facility in the Research Complex at Harwell and subsequent in situ X-ray crystallographic data collection from crystals within the plates at Diamond&#39;s Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline. We describe sample requirements, crystallization protocols, and data collection guidelines.

X -線結晶構造のためのタンパク質の結晶化

要約

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MRC 分子生物学研究所高分子結晶化のプロトコルを自動

タンパク質結晶の微結晶化および

酵素の結晶化と構造決定:多用途マイクロ流体チップにおける連続結晶学による基質複合体

In Situ X線回折研究のためのマイクロダイアルシスによるチップ上のタンパク質の結晶化

室温でのオンチップ結晶化と大規模シリアル回折

マイクロダイアリシスによるハイスループットタンパク質結晶化

タンパク質結晶構造解析のためのクリスタルヒットを得るためのハイスループットスクリーニング(英語)

タンパク質結晶構造解析のためのクリスタルヒットを得るためのハイスループットスクリーニング(英語)

タンパク質結晶構造解析のためのクリスタルヒットを得るためのハイスループットスクリーニング(英語)

Harwellの結晶化施設とダイヤモンド光源Beamline VMXiを用いた結晶化とその場室温データ収集

X -線結晶構造のためのタンパク質の結晶化

要約

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MRC 分子生物学研究所高分子結晶化のプロトコルを自動

タンパク質結晶の微結晶化および

酵素の結晶化と構造決定:多用途マイクロ流体チップにおける連続結晶学による基質複合体

In Situ X線回折研究のためのマイクロダイアルシスによるチップ上のタンパク質の結晶化

室温でのオンチップ結晶化と大規模シリアル回折

マイクロダイアリシス による ハイスループットタンパク質結晶化

タンパク質結晶構造解析のためのクリスタルヒットを得るためのハイスループットスクリーニング(英語)

タンパク質結晶構造解析のためのクリスタルヒットを得るためのハイスループットスクリーニング(英語)

タンパク質結晶構造解析のためのクリスタルヒットを得るためのハイスループットスクリーニング(英語)

Harwellの結晶化施設とダイヤモンド光源Beamline VMXiを用いた結晶化とその 場 室温データ収集

マイクロダイアリシスによるハイスループットタンパク質結晶化

Harwellの結晶化施設とダイヤモンド光源Beamline VMXiを用いた結晶化とその場室温データ収集