MRC LMB 結晶化設備は、医学研究議会 (イギリス) によってサポートされている親切です。我々 は彼らのサポートの LMB のメンバーに感謝: オルガ Perisic (PNAC)、トニー · ウォーン、Fusinita ・ ヴァン ・ デン耳鼻咽喉科とパット ・ エドワーズ (構造学)、スティーブ ・ Scotcher と他のメンバー機械研修会のニール グラントそしてジョー ウェストモーランド (視覚効果)、ポール ・ ハートとトム(IT) プラット。我々 はまたステファンズにジョージとドナルド Ogg (Alphabiotech、スティーブ ・ エリオット (Tecan、英国)、ミッチェル スチュアートとヘザー Ringrose (ハミルトン ロボット、イギリス)、ポール雪解け、ロバート ・ ルイスと Joby ジェンキンス (TTP Labtech、英国)、ポール · リアドン (Swissci AG、スイス連邦共和国) に感謝したいと思います英国)、ニール ・ ウィリアムズ (Markem Imaje、英国)、グラハム ・ ハリス (クリーブランド庁) 技術的なヘルプ。

1. 2 つの完全自動システム (第一次選考)
<ol><li>
システム 1: 72 96 ウェルの結晶化プレートの準備はスクリーニング キット (LMB 板) でいっぱい
	<ol>
<li>手順を実行する前にシステムのロボットが初期化され、制御ソフトウェアが開いていることを確認します。チラー チューブ冷却キャリアのメイン プログラムが開始する前に約 30 分を入れます。</li>
		<li>プレート シーラーのモーターを備えられた SBS キャリアのテスト プレートを配置します。プレート シーラーを実行し、フィルムが正しく適用されることを確認します。プレート シーラーが準備ができていることを確認する 2 回以上このテストを繰り返します。</li>
		<li>20 L の脱イオン水を液体ハンドラーのメイン コンテナーに追加します。小さなコンテナー (20% エタノールの解決の洗浄) からカップリング挿入を外し、メインのコンテナーに挿入を接続します。</li>
		<li>インク ジェット プリンターのタッチ スクリーンに適切なスクリーン名 (表 1) を入力します。開くし、カルーセルの回転をトリガーするカルーセル ドアを閉じます。最初のスタックがそれ自身を示すときは、ドアを開きます。</li>
		<li>22 の結晶化プレートをそれぞれ 1 列向きを持つ最初のスタックは完全に読み込むをします。完全に同じ方法で次の 2 つのスタックをロードします。</li>
		<li>4 番目のスタックの最も高い位置で残り 6 プレートをロードします。カルーセルのドアを閉じます。</li>
		<li>冷凍機の表示は 14 ° c. を示すことを確認します。ゆっくりと繰り返し 1 分選択したスクリーニング キットを反転します。次に、液体ハンドラーのフロント パネルを開きます。</li>
		<li>管を開き、標準の 96 ウェル レイアウト(A1、A2)によると冷却キャリア内に配置します。各管に配置するとキャリアで、同じ 96 ウェル レイアウト トレイにその蓋を配置します。</li>
		<li>クロス チェック チューブ位置し、すべてのチューブが、レベルでキャリアに定住しました。フロント パネルを閉じます。</li>
		<li>液体ハンドラー ソフトウェアの 'スタートアップ' ウィンドウで '実行メンテナンス' を選択し、フラッシュのプログラムを開きます。液体分注チップの外側を洗浄するシステムから 20% エタノールをフラッシュするプログラムを実行します。</li>
		<li>フラッシュが完了すると、「スタートアップ」に戻るには、[キャンセル] をクリックします。'既存のプロセスの実行'、'あなたの選択を開始' をクリックします。「MRC キット調剤' プログラムをを開きます。入力 '18' 'インスタンス' 構成の画面し、プログラムを実行します。</li>
		<li>最初の 4 つのプレート、ラベル、いっぱい、密封システムを監視します。</li>
		<li>すべて 72 プレートを準備し、カルーセルで再配置するは、小さな容器に主なコンテナーからカップリング挿入を切り替えます。'フラッシュを開始' プログラムを実行 (手順 1.1.10 参照)。</li>
		<li>チを切り、空を破棄スクリーニング キット チューブ。カルーセルから 72 準備板を慎重に取り外します。誤って充填が不十分な密閉型またはプレートを破棄します。10 ° c. ですぐに使用できるプレートを保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
システム 2: 設定の 20 LMB プレートの 1 つのサンプルから結晶化液滴 (100 nL タンパク質 + 100 nL 条件)
	<ol>
<li>まず、システムのロボットが、ナノリッター ディスペンサーは、オープン ソフトウェアで初期化されます、液体ハンドラーのメソッド マネージャーが開いていることを確認します。チューブ冷却キャリアをオンに、メイン プログラムが開始する前に約 15 分。</li>
		<li>プレート シーラーのモーターを備えられた SBS キャリアのテスト プレートを配置します。プレート シーラーを実行し、プレートを適切にシールされていることを確認します。テスト プレート シーラー 3 回。</li>
		<li>ナノリッター ディスペンサー テスト プレートで試験溶液の 100 nL 液滴を設定するを実行します。顕微鏡下で水滴が正しく設定されていることを確認します。ナノリットル ディスペンサー ソフトウェアを閉じて、デッキからストリップ ホルダー ・ ブロックを削除します。</li>
		<li>次に、カスタム デザインのプレート ホルダーに挿入 (代表の結果を参照してください: 結晶デバイス開発、LMB) 条件 (表 1) 揮発性試薬の最高の相対量を用いた LMB プレート。プレートから粘着フィルムを削除します。</li>
		<li>液体ハンドラーの前面パネルを開き、最初のスライド キャリアの後ろのデッキで封印されていないプレートを置き (スライド キャリアが引き出されるアクセスの容易さのため)。</li>
		<li>カバー、SBS アルミ蓋付きプレート。キャリアの後部の左上隅に向かって蓋を蓋の反対側の角に穏やかな圧力を適用することによって解決します。</li>
		<li>開封、スライド キャリアに読み込む作業から最も少なく揮発性の条件を同じ方法で残りの 19 のプレートをカバーします。マイクロ チューブ冷却キャリアが 4 ° c と緑色のライトによって示されるように、カバーを外します。</li>
		<li>蛋白質のサンプル (表 2) の (少なくとも) 440 μ L を含むマイクロ チューブの蓋をカットします。この液体検知システムの妨げとなりますのでサンプルには、メニスカスの上の泡はありませんを確認します。マイクロ チューブ冷却キャリアの位置 1 にチューブを置きます。</li>
		<li>プレート移動アダプター キャリアの前に液体ハンドラー デッキに PCR プレートを配置します。フロント パネルを閉じます。</li>
		<li>デッキをロードした後ナノリットル ディスペンサー デッキはストリップ ホルダー ・ ブロックのクリアと 50 μ L チップ スタックの後ろにキャリアがアルミ SBS 蓋の明確であるを確認します。</li>
		<li>液体ハンドラーのメソッド管理 ' インターフェイス 'セットアップ プレート' を選択します。両方のシステムの初期化を監視し、実行のパラメーターを入力します。(プロンプト、数字および準備を手伝ってチップ管理システム) のメソッド管理インターフェイスのガイドラインに従ってください。</li>
		<li>必要なすべてのコンポーネントの準備が整ったと、プロセスを開始することを再確認してください。</li>
		<li>モニター システム ナノリッター ディスペンサーはその後最初のプレートとプレートのシーラーで滴をセットとしては、プレートをシールします。</li>
		<li>すべて 20 プレートを結晶滴で準備し、自動的にスライド式のキャリアに戻ると、フロント パネルを開くし、プレートを慎重に取り外します。プレートが結晶化のそれらを格納する前に密封されて正しくことを確認します。</li>
		<li>ストレージの液体ハンドラーの左側にそれらを積み重ねる前に 20% エタノール溶液と SBS の蓋をきれい。PCR プレートと、チューブを破棄します。</li>
		<li>マイクロ チューブ冷却キャリアを切り、結露を拭きします。さらに結露を吸収するクーラーの表面の上にペーパー タオルを残します。キャリア カバーを交換し、フロント パネルを閉じます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 条件の最適化
<ol><li>
注射器ベースの液体ハンドラー: 結晶化プレート (4 コーナー方法) の貯水池に濃度の 2 つの線形グラデーションを作成します。
	<ol>
<li>液体ハンドラーはオープン ソフトウェアで初期化されて最初を確認します。</li>
		<li>'グラデーション' タブ: 必要なプログラムを開き、貯水池 (表 3) の結晶化プレート型と最終巻を選択。[イソプロパノール] > 10 %v/v と [警視庁] > 20 %v を含むソリューションを使用する場合/v は、3,000、6,000 から 'max ショット集」の高度な設定を引き下げるべき
</li>
		<li>注射器を準備します。各注射器 (ダウン先の尖った端) にピストンを配置、注射器の背面をロボットの頭の下に指定の溝に挿入します。注射器を (プログラムが正しく接続されているすべての必要な注射器でのみ開始) 位置でロックを時計回りにねじる。</li>
		<li>谷を準備します。ステンレス製のフレームを削除し、谷を挿入します。左側の 4 つの位置は、4 コーナー A、B、C、D. (表 3、0.5 mL のデッド ボリュームが表示されているボリュームに追加された) の各シリンジのソリューションに必要なボリュームを表示する '設定' タブにスイッチに対応します。彼らのそれぞれの谷にコーナー ソリューションを注ぎ、デッキ (デッキの前面にある 2 つの磁石の位置に保持するフレーム) にフレームを置きます。には既にデッキに置かれるとき、谷にソリューションを注ぐには、この手順を続行する方法です。
</li>
		<li>モーターを備えられた SBS キャリアの結晶化プレートを配置します。</li>
		<li>「吸引」をクリック、(ピストンを途中で止まって) ときに完了するこの手順を待ちます。</li>
		<li>'実行'] タブに切り替えて、プログラムを実行します。</li>
		<li>プログラムを修了すると、設定タブに戻り、[削除]: システムが残ったソリューションから注射器をパージし、ピストンをわざわざ持ち上げます。'削除' の代わりに '削除' があります; これは同じ注射器でより多くのソリューションを吸引する準備ができて下の位置でピストンを残しています。
</li>
		<li>注射器をそれらを反時計回りに回して取り外します。</li>
		<li>注射器と適切な箱に谷を破棄 (または脱イオン水とし、再利用するため 20 %v/v エタノール溶液で洗浄し)。</li>
		<li>プレート シール、高粘性溶液が混合されているとき、1,000 rpm 3 分または 10 分のマイクロ プレート ミキサーに置きます。プレートはナノリッター ディスペンサーに結晶化液滴を設定可能です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
添加剤のスクリーニング プロトコル (結晶化液滴添加物画面であらかじめ塗りつぶさ 96 ウェルの結晶化プレートを設定) 1
	<ol>
<li>まず、初期濃度 10% (分 vol. 15 mL 液体ハンドラーと添加物の画面上にコンテナーから状態を転送するとき) 増加した試薬の状態を準備します。</li>
		<li>液体ハンドラーが動作するように準備ができていることを確認します。プログラム「一枚板の添加剤追加画面」を開く (貯水池ボリュームを入力: '72 μ').プロンプト、フィギュアやロボットは、選択した内容に従って動作するように準備ができていることを確かめるとチップ管理システム (必要な 12 x 1,000 μ L ヒント) ヘルプします。
</li>
		<li>-20 ° C の定温器から添加物の画面を取得し、そのアルミ シールをすぐに (プレート ホルダーを使用) を削除、液体ハンドラーのデッキ プレートを配置します。プログラム (プレートはキャリアのフロント左にある A1 コーナーに) 縦レイアウトに従って動作します。条件を満たしたを配置もできます。プログラムを実行します。</li>
		<li>プレートの貯水池が入力されている後は、マイクロ プレート シェーカーにし、プログラムを実行します。再利用の脱イオン水と 20% エタノールを状態のコンテナーをすすいでください。</li>
		<li>
ナノリッター ディスペンサーで水滴を設定します。まず、開封結晶化プレート (プレート ホルダーを使用します)。その後、ストリップ ホルダー ・ ブロックの最初の位置に帯プレートと 8 もタンパク質。制御ソフトウェアの 'セットアップ' タブにはデッキ上の各コンポーネントの実際の位置が表示されます。それぞれを読み込む必要なドロップ サイズ (表 4) によると蛋白質のサンプルを有する帯板のも。液滴を準備するプログラムを実行します。
</li>
		<li>プログラムを修了すると、デッキからプレートを削除し、すぐにそれを封印 (プレート シーラー、3 インチ幅の粘着テープを使用)。適切な箱にストリップを破棄します。</li>
		<li>サイズ、形状を評価し、保管する前に顕微鏡下で水滴の中心します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
添加剤のスクリーニング プロトコル (再使用可能な添加物スクリーン 96 ウェルの結晶化プレートにおける結晶化液滴を設定) 2
	<ol>
<li>まず、添加物の画面を準備: 40 分間室温で解凍に対応する冷凍の 96 ウェル細胞培養プレートを残します。その後、2 分間 1,000 x g で添加物の画面を遠心分離機します。</li>
		<li>条件 (分 vol. 15 mL 液体ハンドラーと添加物の画面上にコンテナーから状態を転送するとき) を準備します。</li>
		<li>条件で 96 ウェルの結晶化プレートの貯水池を埋めます。液体ハンドラーのプロトコル 1 として同じ道を進む、2.2.2、ステップしますが、貯水池のボリュームの '80 μ L' を入力してください。</li>
		<li>デッキ (結晶化プレートと 8 よくタンパク質ストリップ ストリップ ホルダー ・ ブロック、表 4の最初の位置に、添加物の画面を含むプレート) の 3 つのコンポーネントを持つナノリッター ディスペンサーで水滴を設定します。</li>
		<li>アルミニウム シート、スクリーンを含む細胞培養プレートを密封し、-20 ° C の定温器に戻ってそれを置きます。</li>
		<li>サイズ、形状を評価し、保管する前に顕微鏡下で水滴の中心します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

LifeArc は、次の項目を製品化したので、我々 はここに、競合する商業的な関心を状態: 96 ~ と 48 ウェルの MRC プレート、MRC 掛かるドロップ シール、モーフィアス、Pi、オングストローム、LMB の結晶化画面。

1-準備と板に格納されている最初のスクリーンの使用
スクリーニング キットは、貯蔵中にいくつかのチューブで光沈殿や相分離が発生するため、プレートに調剤されて前に混合する必要があります。画面が 2 つのキット (2 x 48 管) で構成される 2 番目のキットの最初の管は冷却のキャリアの E1 の場所に配置されます。画面 4 キット (4 x 24 管) で構成される場合、2 番目のキットの最初のチューブ、C1 の場所に配置されます、3 番目のキットの最初の管の挿入位置が E1、4 キットの最初の管場所 G1 に配置されます。その冷却のキャリアでチューブを挿入中、蓋は、次の標準的な 96 ウェル風景レイアウト トレイに配置されます。よく番号が蓋の上に製造業者によって示され、以来、これはすべての管は、正しい順序で配置されている場合をクロス チェックできます。これはまた板の減らされた数を入力するときにチューブに正しい蓋を置き換えるのに役立ちます。
あらかじめ入力されているプレートは 10 ° C、フリーズおよびシールの劣化状況と問題を引き起こす可能性のある 4 ° c の記憶を避けるために妥協に格納します。プレート保存通常顕著な結露内側の面のシールの数ヶ月まで。これは、これらは比較的高濃度の揮発性試薬 (表 1) の条件を含んでいる LMB05、LMB06、LMB09、LMB10 プレートのより少なく本当です。シールの内側に結露の量が少ないシール効率が低下し、プレートを封印しながら井戸間の交差汚染を引き起こすことができます。初期冷房時の結露を防止し、一晩 4 ° C の冷たい部屋に格納されている、断熱ピクニック クーラーにカルーセルからプレートを最初に転送できます。非常に遅い冷却シール ウエル内で温度勾配の開発を最小限に抑え、結露を減少し、したがって全体15。さらに、プレートが 10 の ° C の定温器に保存されている社内カスタム SBS ポリスチレン蓋 (図示せず) 各スタックの上部プレートに配置されます。
あらかじめ入力されたお皿のセット全体は、小説、水溶性、蛋白質のサンプルに対して大規模な初期画面として使用できます。また、少ない板は特定の要件に合わせて選択できます。たとえば、LMB15 および LMB19 は、膜タンパク質サンプル26,27の具体的策定の画面または LMB20 回折データ28の実験段階を容易にする重い原子を配合した画面 (また見なさい:<a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">モーフィアス蛋白質結晶化画面の定式化</a>)。
2. 結晶化液滴を設定
2 システムを使用している場合最初スクリーニング大量の揮発性試薬キットを処理する必要があります。これは SBS の蓋は、蓋処理とプレート シールに影響を与えることができるゴムの結露を防ぎます。SBS 蓋に、彼らは最初に配置する必要があります理由は、プレートの上部にある隙間のビットは、(プロトコル1.2.6 の手順を参照してください)。PCR プレートの井戸の中の蛋白質のデッド ボリュームが比較的寛大な (0.8 μ L、表 2を参照してください伝説)。8 よくストリップ (表 4) でタンパク質を個別にナノリッター ディスペンサーを使用するとき寛大なデッド ボリュームも同様に、採用に注意してください。小さいのデッド ボリュームが動作可能性があります、ただし、いくつかのサンプルは、ヒントに従う、ロボットのキャリブレーションが少し不正確になる可能性があります、部屋は通常、等より暖かいかもしれません。すべてサンプル損失をアプローチを統合するために寛大なデッド ボリューム カバーに します。
さらに実験の小型化に有効に最近の動向と、それゆえ結晶化条件スクリーニングに必要なサンプル量を削減できる、対応する技術29,30 を統合することにより.しかし、更なる小型のいくつかの側面には、31液滴の蒸発および微結晶32の操作など、慎重に検討が必要があります。
最後に、(球面上井戸) の結晶化液滴を設定するとき遠心 (2,000 rpm、1 分) プレートをルーチンの最後のステップとして統合されること。一貫性のあるサイズと遠心分離に起因する液滴の形状再現性の問題33,34を減らすことができます。確かに、中心の滴は全体のプレートのようになります必要な焦点距離として顕微鏡を用いた実験の後で評価を緩和します。
3. 4 コーナー方法の利点
4 コーナー方法の最も重要な利点は、そのシンプルさ、エラーを最小限に抑え、容易に簡単な自動化されたプロトコルです。たとえば、4 コーナー ソリューションは、次の同じレイアウト液体ハンドラーのデッキに常に配置されます。また、すべてのプログラムは、固定比率は、ソリューション (図 3) に基づいています。 高濃度で高粘度にすることができますソリューションの自動処理に 4 コーナー ソリューションの手動準備お勧めします。ほとんど液体クラスの最適化のための最小要件と液体ハンドラーの型で可能な比較的迅速かつ正確な調剤/吸引できます。それにもかかわらず、いくつかのコーナーのソリューションはすぎる粘性液体システムが効率的に動作する搭載ロボットの可能性があります。これは、我々 は肯定的な変位 (図 3 b) と液体ハンドラーを選んだ理由です。
濃度の 2 の線形グラデーションに加えて便利な方法で、一定濃度の 3 番目のコンポーネント (つまりバッファー/添加剤のセット) をテストできます。このため、比較的大量に変化する成分を除く適切に高い濃度でコーナー ソリューションのコア セットの最初に準備します。その後、この成分を含む溶液が最終濃度を調整する追加されます。たとえば、一連の 4 コーナー ソリューションの 50 mL は、当初よりも 10% 高い濃度で用意しています。このコア セットし、4 の 5 の小さなサブセットに分割されます。最後に、サブセットごとに、異なるバッファー pH 液量の 10% が追加されます。
4 フォーマットおよび添加物スクリーンの種類
画面は、彼らが定期的に使用されていないので-20 ° C (図 4) で通常格納され、揮発性/不安定な化合物を含みます。ディープ ウェル ブロック (井戸で 1 mL) に格納されている冷凍添加物スクリーンを使用は、完全に室温で解凍するすべての添加剤溶液の 12 〜 24 時間かかるので早く計画されなければなりません。また、利用者が多数の交差汚染の問題を引き起こし、同じ添加物画面を共有します。最後に、ディープ ウェル ブロックの高さ、それら不適当ほとんどナノリットル ディスペンサー。これらの問題を回避する便利なソリューションとして画面に転勤させるディープ ウェル ブロックからロープロファイル プレート (図 4)。
歴史的には、さまざまな (単一濃度) と 1 つの試薬を含む添加剤の画面は、非常に人気のある35,36をされています。ただし、添加物37または単一添加剤濃度の異なる38で発見の数が減少のミックスを統合する添加物スクリーンの他のタイプを開発されています。最後に、補完的なアプローチは、結晶化39,40前にサンプルに添加剤の効果を調べるためです。
5 その他の考慮事項
をお勧め:ほとんどの画面にはあるいは有毒有害物質が含まれておよびプロトコル中にそれ故に十分な個人的な保護を用いなければなりません。同様に、ロボットの可動と、(ロボットのほとんどは、緊急停止ボタン/システムを持っている) が、プログラムの実行中に手動で干渉しようときに特にに、怪我につながる可能性があります。関与する、正規の技術的な複雑さのためチェック ロボット、画面とプログラムの以前の特徴テスト サンプルは、再現性の高いレベルで継続のために重要。
スループット:指示として 4,000 に 8,000 LMB のプレートが生産システム 1 年間 (および最初のスクリーニングのためのユーザーによってその後採用)。悪化し蒸発開始されます予想売り上げ高が 4-5 ヶ月後、いくつかの条件として、はるかに低い 10 の ° C であらかじめ入力された板の大量在庫に合わせられない。小-中規模の所41オートメーション プロトコルへの異なるアプローチを実施しています。
の格納と実験を評価する:水滴の準備ができたら、プレート、ルーム 4 または 18 ° C (± 0.5 ° C の最大偏差) 厳しく制御された温度で低振動の棚に格納されます。実験は、冷や光の源の顕微鏡を使用して評価されます。様々 な自動イメージング システムのすべての側面を慎重に検討する必要があります 1 つしかし、市販されている: プレートをスキャンするために必要な速度が高いスループットを十分でしょうか?結晶以外のオブジェクトはオート フォーカスを妨げるか。結果として得られる画像の品質は (特に水滴の周囲) のスポットの非常に小さい結晶に十分でしょうか。42,43,44
結晶化条件の比較:当初得られた結晶の性質について注意深い調査の後の傾向と類似点<a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB 画面データベース</a>または45C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Web ツール</a>を使用して、条件間で分析ができます。

さらに原子レベルで生物学と疾患のメカニズムの私達の理解を進めるため、その後薬物探索1への合理的なアプローチを支援するために、x 線結晶構造解析が広く適用されます。このため、精製、蛋白質、DNA、RNA、その他配位子およびその錯体の濃縮 (2-50 mg/mL) 高分子サンプルは、フォームの傾向を命じた三次元格子結晶化2,3 を試験的 ,4。X 線を回折する高品質の結晶が得られるとき、結晶構造は原子分解能5,6の近くで解決できるかもしれない。重大に、新しいサンプルを結晶化条件を予測できず、高品質結晶の収量が通常非常に低い。根本的な理由は、興味の多くのサンプルが結晶化 (通常は数日) の対応するタイム スケールでそれらを不安定にさせる挑戦の生化学的特性を持っていることです。最後に、プロセスは、サンプルとサンプルのバリエーションを生産し、彼らの精製と結晶化7、8を最適化するために必要な時間によって合成されます。
結晶化条件のサンプルの溶解度を低減する共沈剤とソリューションであり、条件は頻繁にまたバッファーおよび添加物を含みます。何百ものような試薬、サンプルの完全性 (蛋白質、核酸の展開など) と干渉する性向が低いので結晶化実験のパラメーターを変更する適しています。結晶化試薬の組み合わせの数百万のテストは可能ではない、様々 な戦略9配合 - 多くのスクリーニング キットにはいくつかのテスト,10 - は小型の試験やプロトコル自動で可能です。このような観点で最も従順の技術はおそらく特殊な結晶化プレート11で実装された結晶化条件 (25 250 μ L) を含む貯水池の上の小さな井戸の上に座って 100 200 nL 水滴と水蒸気拡散,12. 蛋白質のサンプルと条件は頻繁に 200 の合計ボリュームの 1:1 の比率で結合 nL 上井戸における液滴を設定するとき。代替技術や下油バッチ13など脂質キュービック相14 (最新のものは膜貫通タンパク質に特に適用されるプレートで実装可能なロボット ナノリットル タンパク質結晶化非常に悪い水で溶ける)。
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">MRC LMB に結晶化設備</a>は 2000 年代初頭に開始され、2005年15で私達の自動化されたプロトコルの初期の概要が発表されました。タンパク質結晶化への歴史的導入が発表され、またロボット ナノリットルの利点の概要のアプローチ (その後、日常的な実験への新しいアプローチ).高分子結晶化以来、さまざまな (最適) の初期条件を採用、非常にほとんど、あるいは全く役立つ事前情報が本質的に確率過程品質回折結晶16の収量を高めます。その上、大初期画面のしばしば見落とされる利点はサンプルと多くの場合結晶の最適化の必要性を大幅に削減します。もちろん、1 つはまだ後でいくつかの初期条件の最適化を続行する必要があります。通常、試薬の pH 濃度は体系的に調査します。多くの試薬は、さらに結晶化のパラメーターを変更する最適化された条件に組み入れることもできます。確かに、1 つは作りたてのサンプルの結晶化を試みる必要があります、それゆえ対応するプロトコルなりません簡単で利用可能ないつでも。
ここで、2 つは完全に MRC LMB (システム 1 と 2) で設計されたシステムを自動化し、対応するプロトコルの記述に完全に。これらの 2 つのシステムの主な用途は初期座ってドロップ結晶化プレートを用いた蒸気拡散によってスクリーニングです。システム 1 は、液体ハンドラー、株式板に自動化されたカルーセル、プレートの分類のためのインク ジェット プリンタと接着プレート シーラーを統合します。システム 1、72 96 ウェル プレート、市販のスクリーニング キット (試験管に 10 mL の開始ボリュームから貯水池に転送条件の 80 μ L) でいっぱい、ラベルおよびシールします。プレートは、利用可能なユーザーにいつでも (初期画面と呼ばれる 'LMB プレート') として 10 ° C の定温器に保存されます。
システム 2 は、粘着プレート シーラー、ナノリッター ディスペンサー液体ハンドラーを統合します。システムの蒸気拡散実験の滴 (100-1,000 nL) に座って 2 は条件を組み合わせることによって生成され、20 の 48 または 96 ウェル プレートの上井戸にサンプルは事前条件でいっぱい。これは 1,920 の選考条件は試験的システム 2 で 20 LMB プレートを使用する場合を意味します。
ロボットは選択した条件の最適化にも個別に使用され、対応する半自動化されたプロトコルについても説明します。4 コーナー方法17を日常的に利用して、最適化画面を生成します。対応するプロトコルは最初 4 ソリューション ('A、B、C、および D') のマニュアルの準備を要求します。(2 主な結晶化剤の濃度の 2 つの線形グラデーションは結晶化プレートの貯水池に直接は自動的に生成されます。このため、注射器ベースの液体ハンドラーは異なる比率で 4 コーナー ソリューションを分配します。
条件をさらに最適化するには、可能性のある結果の結晶18の特性を高める添加物スクリーン採用できます。添加剤のスクリーニングのため 2 つの方法があります: 液滴 (プロトコル 1) を設定する前に結晶化プレートの貯水池に分配される添加物から始まるプロトコルと添加物の画面が分配される別のプロトコル直接に水滴 (プロトコル 2)。
自動の高分子の結晶化を容易にする MRC LMB で開始された他の有用な開発はまた掲載されています。基本的には、結晶化プレートとふたを積み重ね可能な社会の生体分子スクリーニング (SBS) などの関連するデバイスはシステム 2 を使用して、条件の蒸発を最小限にします。
簡潔にするため、ユーザーが基本機能とナノリッター ディスペンサー、インク ジェット プリンター、および接着剤板シーラーのメンテナンスに精通していることが想定されます。ロボットのデッキ プレートが配置されている限り、そのよく A1 (A1 コーナー) はプレート キャリアの左後ろの方。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Robots&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO&amp;reg;</td><td>Tecan</td><td>n/a</td><td>Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microlab&amp;reg; STAR&amp;trade;</td><td>Hamilton</td><td>n/a</td><td>Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE&amp;trade; technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.</td></tr><tr><td>Mosquito&amp;reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dragonfly&amp;reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Adhesive plate sealer</td><td>Brandel</td><td>n/a</td><td>Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).</td></tr><tr><td>Inkjet printer 9232</td><td>Markem-Imaje</td><td>n/a</td><td>Integrated to System 1. Touchscreen interface.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Crystallization screens&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen&amp;trade; 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td></tr><tr><td>Crystal Screen 2&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td></tr><tr><td>Wizard&amp;trade; Classic 1</td><td>Rigaku</td><td>1009530</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td></tr><tr><td>Wizard&amp;trade; Classic 2</td><td>Rigaku</td><td>1009531</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; Ammonium Sulfate</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-211</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; PEG/LiCl</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-217</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td></tr><tr><td>Quick Screen&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-221</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; Sodium Chloride</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-219</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; PEG 6000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-213</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; MPD</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-215</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td></tr><tr><td>MemFac&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-114</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td></tr><tr><td>PEG/Ion&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-126</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td></tr><tr><td>Natrix&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td></tr><tr><td>Crystal Screen Lite&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-128</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td></tr><tr><td>Custom Lite screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td></tr><tr><td>Wizard&amp;trade; Cryo 1</td><td>Rigaku</td><td>1009536</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td></tr><tr><td>Wizard&amp;trade; Cryo 2</td><td>Rigaku</td><td>1009537</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td></tr><tr><td>JBS1</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-101L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td></tr><tr><td>JBS2</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-102L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td></tr><tr><td>JBS3</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-103L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td></tr><tr><td>JBS4</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-104L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td></tr><tr><td>JBS5</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-105L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td></tr><tr><td>JBS6</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-106L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td></tr><tr><td>JBS7</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-107L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td></tr><tr><td>JBS8</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-108L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td></tr><tr><td>JBS9</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-109L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td></tr><tr><td>JBS10</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-110L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td></tr><tr><td>Index&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13</td></tr><tr><td>SaltRX&amp;trade; 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td></tr><tr><td>SaltRX&amp;trade; 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td></tr><tr><td>MemStar&amp;trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-21</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td></tr><tr><td>MemSys&amp;trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-25</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td></tr><tr><td>JCSG-plus&amp;trade; Suite</td><td>Qiagen</td><td>130720</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16</td></tr><tr><td>MORPHEUS&amp;reg; screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-46</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17</td></tr><tr><td>Pi minimal screen</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-127</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18</td></tr><tr><td>Pi-PEG screen</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-128</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19</td></tr><tr><td>MORPHEUS&amp;reg; II screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-91</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20</td></tr><tr><td>LMB crystallization screen&amp;trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-98</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additive screens&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT additive screen</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-138</td><td>Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td></tr><tr><td>MORPHEUS&amp;reg; additive screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93-500</td><td>Frozen in 96-well deepwell block (500 &amp;micro;L per well).</td></tr><tr><td>ANGSTROM additive screen&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100</td><td>Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td></tr><tr><td>MORPHEUS&amp;reg; additive screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93</td><td>Frozen in 96-well cell culture Costar&amp;reg; plate with V-shaped wells (100 &amp;micro;L per well).</td></tr><tr><td>ANGSTROM additive screen&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100-FX</td><td>Frozen in 96-well cell culture Costar&amp;reg; plate with V-shaped well (100 &amp;micro;L per well).</td></tr><tr><td>HIPPOCRATES additive screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS&amp;reg; III).</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well MRC 2-drop plate</td><td>Swissci</td><td>MRC 96T-UVP</td><td>Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80&amp;nbsp; &amp;micro;L. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.</td></tr><tr><td>48-well MRC 1-drop plate&amp;nbsp; (&#039;MAXI plate&#039;)</td><td>Swissci</td><td>MMX01-UVP&amp;nbsp;</td><td>Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200&amp;nbsp; &amp;micro;L. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 &amp;micro;L. UV transmissible.</td></tr><tr><td>MRC hanging drop seal</td><td>Swissci</td><td>n/a</td><td>Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.</td></tr><tr><td>Adhesive sealing tape</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-50</td><td>3-inch wide Duck&amp;reg; HD Clear&amp;trade; for sealer and manual sealing.</td></tr><tr><td>Adhesive aluminium sheet</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td>Used to reseal additive screens.</td></tr><tr><td>Ink cartridge</td><td>Markem-Imaje</td><td>9651</td><td>System 1 (inkjet printer).</td></tr><tr><td>Solvent cartridge</td><td>Markem-Imaje</td><td>8652</td><td>System 1 (inkjet printer).</td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L tips&amp;nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>235947</td><td>System 2 (STAR&amp;trade; liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE&amp;trade; tips in disposable stacks.</td></tr><tr><td>Reagent container</td><td>Hamilton</td><td>194052</td><td>Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR plate</td><td>Thermo Scientific&amp;trade;</td><td>AB-2150</td><td>System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito&amp;reg;). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.</td></tr><tr><td>microsyringes</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03020</td><td>Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito&amp;reg; nanoliter dispenser (9mm spacing).</td></tr><tr><td>strip-holder block</td><td>TTP Labtech</td><td>3019-05013</td><td>SSB device for the Mosquito&amp;reg; strips, aka &#039;4-way Reagent Holder&#039;.</td></tr><tr><td>2 &amp;micro;L 8-well strip</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03110</td><td>Contains protein on the deck of the Mosquito&amp;reg;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 &amp;micro;L.</td></tr><tr><td>5 &amp;micro;L 8-well strip</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03100</td><td>Contains protein on the deck of the Mosquito&amp;reg;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 &amp;micro;L.</td></tr><tr><td>5 mL syringes</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07100</td><td>Syringe body and piston for the Dragonfly&amp;reg; liquid handler. Pack of 100.</td></tr><tr><td>Troughs/Reservoirs</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07103</td><td>Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly&amp;reg;. Pack of 50.</td></tr><tr><td>Orbital microplate shaker</td><td>CamLab Limited</td><td>n/a</td><td>Variomag&amp;reg; for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).</td></tr><tr><td>Microplate mixer</td><td>TTP Labtech</td><td>3121-01015</td><td>MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.</td></tr></tbody></table>

automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology

X 線を回折する高品質の結晶が得られるとき、結晶構造は原子分解能の近くで解決できるかもしれない。蛋白質、Dna、Rna、その錯体の結晶化条件はない、しかし予測します。さまざまな条件を用いた回折結晶の品質の収穫を増加する方法です。2 つの完全に自動化されたシステムは、ナノリットル液滴を用いた蒸気拡散によってで、MRC 分子生物学実験施設 (ケンブリッジ、イギリス、MRC LMB) 1,920 の初期条件に対する結晶化を容易にする開発されています。半自動化されたプロトコルは、試薬、pH、濃度を変更するか、可能性のある結果の結晶の特性を向上させる添加物を導入することによって条件を最適化する開発されています。対応するすべてのプロトコルの詳細に説明・簡潔に説明されます。一緒に取られて、彼らは便利で高効率高分子結晶化マルチ ユーザー機能でユーザーに彼らの実験の主要なパラメーターを制御を与えている間を有効にします。

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Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

自動化されたシステムと画面の大きい数のルーチンの準備のためのプロトコル、蒸気拡散実験のためのナノリットル結晶滴は説明し、説明しました。

MRC 分子生物学研究所高分子結晶化のプロトコルを自動

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

automated-protocols-for-macromolecular-crystallization-at-mrc

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.3K ビュー.  Medical Research Council. 自動化されたシステムと画面の大きい数のルーチンの準備のためのプロトコル、蒸気拡散実験のためのナノリットル結晶滴は説明し、説明しました。

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High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

生化学

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

タンパク質結晶の成長を使用して異なる寸法自動結晶化その場の動的光散乱と相まって

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other important cellular biology questions. The technologies available to genetically manipulate Dictyostelium cells are well-developed. Transfections can be performed using different selectable markers and marker re-cycling, including homologous recombination and insertional mutagenesis. This is supported by a well-annotated genome. However, these approaches are optimized for axenic cell lines growing in liquid cultures and are difficult to apply to non-axenic wild-type cells, which feed only on bacteria. The mutations that are present in axenic strains disturb Ras signaling, causing excessive macropinocytosis required for feeding, and impair cell migration, which confounds the interpretation of signal transduction and chemotaxis experiments in those strains. Earlier attempts to genetically manipulate non-axenic cells have lacked efficiency and required complex experimental procedures. We have developed a simple transfection protocol that, for the first time, overcomes these limitations. Those series of large improvements to Dictyostelium molecular genetics allow wild-type cells to be manipulated as easily as standard laboratory strains. In addition to the advantages for studying uncorrupted signaling and motility processes, mutants that disrupt macropinocytosis-based growth can now be readily isolated. Furthermore, the entire transfection workflow is greatly accelerated, with recombinant cells that can be generated in days rather than weeks. Another advantage is that molecular genetics can further be performed with freshly isolated wild-type Dictyostelium samples from the environment. This can help to extend the scope of approaches used in these research areas.

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is a popular model organism to study complex cellular processes such as cell migration, endocytosis, and development. The utility of the organism is dependent on the feasibility of genetic manipulation. Here, we present methods to transfect Dictyostelium discoideum cells that overcome existing limitations of culturing cells in liquid media.

キイロタマホコリカビの選択に基づいて細胞と細菌の成長の遺伝子工学

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

遺伝学

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial purification of biologically important RNA/protein complexes. However, this strategy suffers from one major disadvantage that limits its broader utilization: the biotin/streptavidin interaction can be broken only under denaturing conditions that also disrupt the integrity of the eluted complexes, hence precluding their subsequent functional analysis and/or further purification by other methods. In addition, the eluted samples are frequently contaminated with the background proteins that nonspecifically associate with streptavidin beads, complicating the analysis of the purified complexes by silver staining and mass spectrometry. To overcome these limitations, we developed a variant of the biotin/streptavidin strategy in which biotin is attached to an RNA substrate via a photo-cleavable linker and the complexes immobilized on streptavidin beads are selectively eluted to solution in a native form by long wave UV, leaving the background proteins on the beads. Shorter RNA binding substrates can be synthesized chemically with biotin and the photo-cleavable linker covalently attached to the 5&#39; end of the RNA, whereas longer RNA substrates can be provided with the two groups by a complementary oligonucleotide. These two variants of the UV-elution method were tested for purification of the U7 snRNP-dependent processing complexes that cleave histone pre-mRNAs at the 3&#39; end and they both proved to compare favorably to other previously developed purification methods. The UV-eluted samples contained readily detectable amounts of the U7 snRNP that was free of major protein contaminants and suitable for direct analysis by mass spectrometry and functional assays. The described method can be readily adapted for purification of other RNA binding complexes and used in conjunction with single- and double-stranded DNA binding sites to purify DNA-specific proteins and macromolecular complexes.

RNA/protein complexes purified using botin-streptavidin strategy are eluted to solution under denaturing conditions in a form unsuitable for further purification and functional analysis. Here, we describe a modification of this strategy that utilizes a photo-cleavable linker in RNA and a gentle UV-elution step, yielding native and fully functional RNA/protein complexes.

ビオチンと写真分解リンカーに接続されている RNA を用いた高分子複合体のシングル ステップ浄化

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

A Behavioral Assay for Investigating the Role of Spatial Memory During Instinctive Defense in Mice

Evolution has selected a repertoire of defensive behaviors that are essential for survival across all animal species. These behaviors are often stereotyped actions elicited in response to innately aversive sensory stimuli, but their success requires enough flexibility for adapting to different spatial environments, which can change rapidly. Here, we describe a behavioral assay to evaluate the influence of learned spatial knowledge on defensive behaviors in mice. We have adapted the widely used Barnes maze spatial memory assay to investigate how mice navigate to a shelter during escape responses to innately aversive sensory stimuli in a novel environment, and how they adapt to acute changes in the environment. This new assay is an ethological paradigm that does not require training and exploits the natural exploration patterns and navigation strategies in mice. We propose that the set of protocols described here are a powerful means of studying goal-directed behaviors and stimulus-triggered navigation, which should be of interest to both the fields of instinctive behaviors and spatial memory.

This protocol describes a behavioral assay, based on the Barnes maze test, to study how instinctive defensive actions are modified by the knowledge of spatial environment.

マウスで本能的な防衛中に空間記憶の役割を調査するため行動分析

Evolution has selected a repertoire of defensive behaviors that are essential for survival across all animal species. These behaviors are often ...

行動学

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

生物学

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In circadian rhythms research, for example, clock gene fusions with firefly luciferase give rise to robust rhythms in cellular bioluminescence that persist over many days. Technical limitations associated with photomultiplier tubes (PMT) or conventional microscopy-based methods for bioluminescence quantification have typically demanded that cells and tissues be maintained under quite non-physiological conditions during recording, with a trade-off between sensitivity and throughput. Here, we report a refinement of prior methods that allows long-term bioluminescence imaging with high sensitivity and throughput which supports a broad range of culture conditions, including variable gas and humidity control, and that accepts many different tissue culture plates and dishes. This automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) also allows the observation of spatial variations in luciferase expression across a cell monolayer or tissue, which cannot readily be observed by traditional methods. We highlight how the ALLIGATOR provides vastly increased flexibility for the detection of luciferase activity when compared with existing methods.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetically encoded luciferase is a popular non-invasive reporter of gene expression. Use of an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) enables longitudinal recording from bioluminescent cells under a wide range of conditions. Here we show how ALLIGATOR may be used in the context of circadian rhythms research.

ガスと温度最適化レコーダー (ワニ) をイメージング自動縦ルシフェラーゼを用いた発光レポーターの柔軟な測定

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

細胞内のATG9A局在の調査

Imaging ATG9A, a Multi-Spanning Membrane Protein

Autophagy is a highly conserved pathway that the cell uses to maintain homeostasis, degrade damaged organelles, combat invading pathogens, and survive pathological conditions. A set of proteins, called ATG proteins, comprise the core autophagy machinery and work together in a defined hierarchy. Studies in recent years have improved our knowledge of the autophagy pathway. Most recently, it has been proposed that ATG9A vesicles are at the heart of autophagy, as they control the rapid de novo synthesis of an organelle called the phagophore. The study of ATG9A has proven challenging, since ATG9A is a transmembrane protein, and it is present in different membrane compartments. As such, understanding its trafficking is an important element for understanding autophagy. Here, detailed methods are presented that can be used to study ATG9A and, in particular, its localization using immunofluorescence techniques, which can be assessed and quantified. The pitfalls of transient overexpression are also addressed. The correct characterization of ATG9A function and the standardization of techniques to analyze its trafficking are crucial to further characterize the events governing autophagy initiation.

著者スポットライト:マルチスパン膜タンパク質であるATG9Aのイメージング  

This protocol describes various methods that can help in the study of ATG9A biology, including immunofluorescence followed by image analysis, transient overexpression considerations, and investigating the ATG9A glycosylation status using western blot.

ATG9A、マルチスパン膜タンパク質のイメージング

Autophagy is a highly conserved pathway that the cell uses to maintain homeostasis, degrade damaged organelles, combat invading pathogens, and survive ...

MRC 分子生物学研究所高分子結晶化のプロトコルを自動

要約

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生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

タンパク質結晶の成長を使用して異なる寸法自動結晶化その場の動的光散乱と相まって

キイロタマホコリカビの選択に基づいて細胞と細菌の成長の遺伝子工学

ビオチンと写真分解リンカーに接続されている RNA を用いた高分子複合体のシングルステップ浄化

マウスで本能的な防衛中に空間記憶の役割を調査するため行動分析

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで

ガスと温度最適化レコーダー (ワニ) をイメージング自動縦ルシフェラーゼを用いた発光レポーターの柔軟な測定

ATG9A、マルチスパン膜タンパク質のイメージング

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マウスで本能的な防衛中に空間記憶の役割を調査するため行動分析

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