私たちは、ハエの株式の維持のために氏V. Lephartに感謝この作品は、健康補助金（GM62916）と国立科学財団の助成金（MCB0817107）のための国立研究所によってサポートされていました。

多糸染色体のスカッシュの準備のための以下のプロトコルは、ヨハンセン氏らに記載された手順から構成されている。 （2009）。 1。三齢ショウジョウバエの幼虫の文化高品質のスカッシュの準備に最適な多糸染色体を得るために、混雑していない培養条件は、（すなわち、20産卵標準4のメスのハエが&quot;毎日新しいボトルにボトルや変更を飛ぶ程度の場所）が不可欠です。太った人を選択します。彼らはまださまよっている間に3齢幼虫を登るの最初の収穫からではなく、蛹化直前に我々日常的に文化で21 ° C、18 ° Cはバンドは/例えばのようないくつかの目的にはより適している可能性がありますファット染色体が得られますバンド間の領域は、高分解能で可視化する必要があります。 2。多糸スカッシュ材料<ul><li>ドラモンド郭清の鉗子（2） </li><li>ペトリ皿（60 × 15 mm）の</li><li>曇らされた顕微鏡スライド（フィッシャー番号12-544-3）（ポリ-リジンコート） </li><li> 22 × 22 mmの15号のカバースリップ（フィッシャー番号12 - 520B）（Sigmacoteでコーティングした、シグマ＃SL2） </li><li> 22 × 40mmの15号のカバースリップ（フィッシャー番号12 - 530B） </li><li>金、ワイプ</li><li> 20倍対物レンズと位相差顕微鏡</li><li>小さなデュワー（例えば、真空フラスコまたは魔法瓶） </li><li>長い鉗子</li><li>剃刀の刃</li><li>コプリンジャー</li><li>ラバーメイドやタッパーウェアトレイ（または同等の密閉式トレイ） </li><li>パラフィルム（22 mmの正方形にカット） </li><li> 175グラムの重み</li></ul> 3。固定液とソリューション<ol><li> 5Xホルムアルデヒドの株式。 0.74 gの新鮮な溶液を調製しますのdH 2 O 4.0 mlのと1N KOHの28μLとパラホルムアルデヒド。 65℃くらいまで温めパラホルムアルデヒドを溶解し、氷上で保存する。 </li><li>固定液1。 5Xホルムアルデヒドの在庫から0.5ミリリットル10 × PBS、50μlのトリトンX - 100、3.45ミリリットルのdH 2 Oおよび1.0 mlの新鮮な溶液を調製します。トリトンX - 100を分散し、1時間以内に使用して暖かい。 </li><li>固定剤2。 1.5ミリリットルのdH 2 O、2.5ミリリットル氷酢酸、および1時間以内に5倍のホルムアルデヒドの株式や使用から1.0mlの新鮮な溶液を調製します。 </li><li> Lactoacetic酸溶液。 1ミリリットル乳酸、2ミリリットルのdH 2 O、および3mLの酢酸溶液を調製します。 </li></ol> 4。多糸染色体のスカッシュの準備： <ol><li>水で幼虫をすすぎ、解剖のための組織培養皿にPBSに移す。 </li><li>口の先端が鉗子一対のフック、他のペアと方法ダウンの約2 / 3体を保持つかみ、そして口を引っ張らないので唾液腺が露出しているフック。唾液、脳から腺と目触角ディスクを分離し、腺から脂肪体および他の関連する組織を離れて分析する。 </li><li>つのよくうつ病のスライドと同様に2〜固定液2の200から300マイクロリットルの最初のウェルに固定液1の200マイクロリットルを追加。よくいずれかの固定液を1に一度唾液腺の一つのペアを転送し、通常1〜2分程度の標的エピトープに必要な時間、インキュベートする。 （注：そのようなヒストン修飾のほとんどのようないくつかのエピトープは、、5分以上固定が必要な場合があります。） </li><li>使用して鉗子は、ウェル2の固定剤2に唾液腺を転送し、2分間インキュベートする。 </li><li>クリーンSigmacotedカバースリップ上でLactoacetic酸溶液の10〜30μlに腺を転送する。静かにカバースリップ上にポリリジンでコーティングされた顕微鏡スライドを下げると、腺がスライドとカバースリップの間になるように垂直方向の圧力を適用せずに、カバースリップを拾う。 直ちに慎重に一辺上にピンセットでカバーグラスを把握し、細胞溶解と拡散染色体を容易にするゆっくりと組織上の任意の縦の圧力を最小化しようとし、少し前後に移動する。あるいは静かに前後にカバースリップを移動するにも消しゴム鉛筆の側面や指先を使う。前後にカバースリップを移動するの遅れは、彼らがLactoacetic酸溶液に曝されると、より剛性になる傾向があるので染色体腕の広がりを減少させる可能性があることに注意してください。ソリューションの混濁は、多くの場合、細胞分離の良い兆候です。ゆっくりと数回にも広がって染色体を助けることができる鉛筆の消しゴム側で（垂直方向の圧力を避けるために）斜めにカバースリップをタップします。 </li><li>すぐに染色体が十分に広がっているかどうかを判断するために20または40倍の目標との位相差顕微鏡下で組織を調べます。 </li><li>拡散染色が十分であるときに、きれいな金 - ワイプのスタック上にカバースリップの側でスライドを下に設定します。せん断の場合とカバースリップのいずれかの水平移動を避け、第二の上に金がワイプとカバースリップが配置されている場所の上に親指を置き、しっかりと押すことで染色体を平坦に置きます染色体。 </li><li>準備が意図した目的に適しているかどうかを判断するために顕微鏡下で再びスライドを調べます。染色体が退治時に大幅に移動した場合は、あなたのその後の準備にLactoacetic酸溶液の少ない量を使用してください。適当なスライドの十分な数が得られるまで繰り返し、4.1から4.8を繰り返します。スライドのカバースリップ上175グラムのウェイトを置きます。 </li><li>液体窒素で小さなデュワー（例えば、魔法瓶を）埋める。長い鉗子を使用して、液体N 2へのディップスライドは、沸騰が停止するまで、スライドを削除し、そして即座にカバースリップをオフに反転する一角で、きれいなカミソリの刃のエッジを使用してください。 4℃のPBSでコプリンジャーにスライドをすぐに使用する場合、場所℃にそうでなければ95％エタノールで満たされたコプリンジャーにスライドを収集する。霜が組織をス​​ライドに付着し、カバースリップで残っていないことを確認するために離れて昇華した後にカバースリップを調べます。すべてのスライドをPBS（数時間内で使用する）または、エタノール（長期保管用）のいずれかに格納されるまで、スライドの残りの部分で繰り返します。 </li></ol>代表的な結果高品質の多糸押しつぶし標本を得るための最初の重要なステップは、大きな唾液腺の核と脂肪幼虫を成長させることです。二つ目はある程度の練習がかかる場合が拡散手続き、との良好なテクニックです。改良された拡散成功のための一つの先端は潰しステップ中lactoacetic酸溶液の最小限の量を見つけることです。これまでは染色体の腕を洗うこと、過度のストリーミング力を発生させることなく染色体の広がりを十分推進していきます。また、前後にカバースリップを動かす上でのいかなる遅延もLactoacetic酸溶液にさらされたとき、彼らはより剛性になるように染色体の腕の広がりを減少させることは注目に値する。 すべてがうまくいけば、多数のよく広がった多糸染色体があるはずです。図1は、二重緑のバンド間の領域のためのマーカーとし、色素で標識された、そのような準備の例を示している汚れ青の縞模様の地域。不十分な拡散が得られた場合、染色体は、図2に示すように、小さなボールのようになります。一方、あまり拡散が発生した場合、chomosomesは薄すぎると、拡張または図3に示すように、細かく断片化いくつかのケースになります。 <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig1.jpg" alt="図1" /> ダブルJIL - 1ヒストンH3S10キナーゼ（赤）とヘキスト（青色）に対する抗体で標識図1。多糸スカッシュの準備。 <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig2.jpg" alt="図2" /> 不十分な拡散と図2。多糸スカッシュ。 <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。すぎる広がりを持つ多糸スカッシュ。

<ol>
	<li>Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II-mediated+transcription+at+active+loci+does+not+require+histone+H3S10+phosphorylation+in+Drosophila.">RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila.</a> Development. 135, 2917-2925 (2008).</li><li>DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+GFP-fusion+proteins+on+polytene+chromosomes.">Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes.</a> Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).</li><li>Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+transcription+and+epigenetic+chromatin+modification+in+Drosophila+polytene+chromosome+squash+preparations+using+antibodies.">Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies.</a> Methods. 48, 387-397 (2009).</li></ol>

従来のスカッシュ固定プロトコルの酢酸と乳酸を含めることは、拡散バンド間分解能と染色体腕の両方を促進するが、残念ながら、いくつかのエピトープは、この治療を生きていけない。そのようなエピトープの例は、H3S10ph（カイら 、2008）である。酸処理はまた、GFPタグ融合タンパク質、DiMario らの固有の蛍光を消光するという欠点を持っているので。 （2006）最近、GFP -抗体?...

preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling

ショウジョウバエは、長いクロマチン構造と三齢幼虫の巨大な唾液腺多糸染色体で提供される細胞診の利点のための遺伝子調節の関係を研究するためのお気に入りのモデルのシステムとなっています。この組織では染色体は、約1000枚を生じさせる細胞分裂がない場合の複製の多くのラウンドを受ける。 DNAは、特定のタンパク質の局在化とクロマチン形態を相関させるユニークな機会を提供大幅に拡大された染色体で、その結果、各複製サイクルの後に整列されたまま。その結果、別の遺伝子で、転写プロセスの異なる段階で存在するエピジェネティックな修飾を定義することに関心の高いレベルがあった。このような研究のための重要なツールは、酵素に対する抗体を持つ多糸染色体のラベリング、転写因子、または関心のヒストン修飾です。このビデオプロトコルは、抗体の標識にショウジョウバエ多糸染色体を準備するヨハンセンの実験室で使用されているスカッシュのテクニックを示しています。

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Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

このビデオプロトコルは準備するヨハンセン実験室で使用されているスカッシュのテクニックを示しています。<em&gt;ショウジョウバエ</em抗体標識用&gt;多糸染色体。

抗体標識用ショウジョウバエ多糸染色体のカボチャの準備

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

preparation-drosophila-polytene-chromosome-squashes-for-antibody

Research

JoVE Journal

Biology

31.0K ビュー.  Iowa State University. このビデオプロトコルは準備するヨハンセン実験室で使用されているスカッシュのテクニックを示しています。ショウジョウバエ多糸染色体。

ビデオ: Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

遺伝学

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

マラリア蚊の2Dと3D染色体絵画

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

免疫・感染学

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

のライブ解剖ショウジョウバエ胚：抗体染色によってミュータントコレクションをスクリーニングするための合理化手法

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

生物学

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

ショウジョウバエの卵子形成期における分極細胞内輸送と基底膜タンパク質の分泌の共焦点および超解像イメージング

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

発生生物学

抗体媒介ライブイメージングによるタンパク質可視化の強化

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

著者スポットライト:動物の形態形成研究における機械的および生化学的シグナルのダイナミクスの解明 

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;精巣

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

蛍光DNAための簡単​​な方法<em&gt;その場で</em&gt;ぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

「ヒト化」を生成<em&gt;ショウジョウバエ</emキネシン5の薬理学的阻害に感受性&gt; S2細胞株

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

抗体標識用ショウジョウバエ多糸染色体のカボチャの準備

要約

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ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

マラリア蚊の2Dと3D染色体絵画

のライブ解剖ショウジョウバエ胚：抗体染色によってミュータントコレクションをスクリーニングするための合理化手法

ショウジョウバエの卵子形成期における分極細胞内輸送と基底膜タンパク質の分泌の共焦点および超解像イメージング

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

蛍光DNAための簡単な方法

「ヒト化」を生成

抗体標識用ショウジョウバエ多糸染色体のカボチャの準備

要約

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ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

マラリア蚊の2Dと3D染色体絵画

のライブ解剖ショウジョウバエ胚：抗体染色によってミュータントコレクションをスクリーニングするための合理化手法

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蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

蛍光DNAための簡単​​な方法

「ヒト化」を生成

蛍光DNAための簡単な方法