אנו מודים לגב &#39;ו&#39; Lephart לאחזקת מלאי לעוף עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק (GM62916) ואת הקרן הלאומית למדע מענק (MCB0817107).

פרוטוקול הבאים להכנת כרומוזום polytene סקווש מותאמת ההליך המתואר יוהנסן et al. (2009). 1. תרבות של הזחלים third תסיסנית instar על מנת לקבל את הכרומוזומים polytene האופטימלי עבור ההכנות סקווש באיכות גבוהה, תנאים culturing צפוף חיוניים (כלומר, סביב מקום 20 ההטלה זבובים הנשי בקבוק סטנדרטי &quot;4 לעוף שינוי בקבוק חדש בכל יום). בחר את האנשים השמנים ביותר מן היבול הראשון של טיפוס 3 זחלים instar בזמן שהם עדיין משוטטים אך זמן קצר לפני התגלמות. אנו שגרתי תרבות ב 21 ° C 18 ° C אך תניב הכרומוזומים שמנים שעשויים להיות מתאים יותר למטרות מסוימות כמו למשל כאשר הלהקה / אזורים interband צריך להיות דמיינו ברזולוציה גבוהה. 2. קישואים חומרים Polytene <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דראמונד מלקחיים דיסקציה (2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פטרי (60 x 15 מ&quot;מ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסוכרים שקופיות מיקרוסקופ (פישר מס &#39;12-544-3) (poly-ליזין מצופה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 22 x 22 מ&quot;מ מס &#39;15 מכסה מחליק (פישר מס&#39; 12-520B) (מצופה Sigmacote: Sigma # SL2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 22 x 40 מ&quot;מ 15 מס &#39;מכסה מחליק (פישר מס&#39; 12-530B) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קים, מגבונים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניגוד שלב מיקרוסקופ במטרה 20X </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיואר קטנים (למשל, תרמוס תרמוס או בקבוק) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לונג מלקחיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סכיני גילוח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coplin צנצנת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גומי Maid או מגש טאפרוור (או מגש סגר שווה ערך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm (חתך לתוך ריבועים 22 מ&quot;מ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 175 גרם משקולות </li></ul> 3. Fixatives ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניות פורמלדהיד 5X. הכן פתרון חדש של 0.74 גרם paraformaldehyde ב 4.0 מ&quot;ל של DH 2 O עם 28 μl של 1N KOH. חם עד 65 ° C לפזר את paraformaldehyde ולאחר מכן לאחסן על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקבע 1. הכן פתרון חדש של 0.5 מ&quot;ל PBS 10X, 50μl טריטון X-100, 3.45 מ&quot;ל DH 2 O ו - 1.0 מ&quot;ל ממלאי פורמלדהיד 5X. חם לפזר את טריטון X-100 ולהשתמש תוך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקבע 2. הכן פתרון חדש של 1.5 מ&quot;ל DH 2 O, 2.5 מ&quot;ל חומצה אצטית קרחונית, ו 1.0 מ&quot;ל ממלאי פורמלדהיד להשתמש 5X ו תוך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומצה Lactoacetic פתרון. הכן תמיסה של חומצה לקטית 1 מ&quot;ל, 2 מ&quot;ל DH 2 O, ו - 3 מ&quot;ל חומצה אצטית. </li></ol> 4. סקווש Polytene כרומוזום הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים זחלים להעביר PBS בצלחת רקמה תרבות לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוז את קצה הפה קרסים עם זוג אחד של מלקחיים, להחזיק את הגוף בערך 2 / 3 הדרך למטה עם זוג אחר, ולמשוך על פיו ווים כך בלוטות הרוק חשופים. הפרד את בלוטות הרוק מהמוח את העין מחושים דיסקים, לנתח משם את השומן בגוף וכל הרקמות הקשורים אחרים מבלוטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 מיקרוליטר של מקבע 1 עד הבאר הראשונה של השקופית שני דיכאון היטב 200-300 מיקרוליטר של 2 מקבע היטב השניים. העברת זוג אחד של בלוטות הרוק בכל פעם עד 1 מקבע היטב אחד לדגור על כמות הזמן הדרוש epitope היעד, בדרך כלל כ - 1-2 דקות. (הערה: כמה epitopes, כמו רוב השינויים היסטון, עשויה לדרוש 5 דקות או קיבעון יותר.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים להעביר את בלוטות הרוק עד 2 מקבע היטב 2 ו דגירה במשך שתי דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את בלוטות ל μl 10-30 של פתרון חומצה Lactoacetic על coverslip Sigmacoted נקי. בעדינות נמוך שקופיות polylysine מצופה מיקרוסקופ על coverslip ו, ללא הפעלת לחץ אנכי, להרים את בלוטות coverslip כך הם בין השקופיות לבין coverslip. להקל מיד תמוגה התא כרומוזומליות להפיץ בקפידה על ידי לתפוס את coverslip עם מלקחיים על קצה אחד בעדינות להעביר אותו מעט קדימה ואחורה, מנסה למזער את הלחץ האנכי על הרקמה. לחילופין להשתמש בצד מחק של עיפרון או אפילו האצבע להזיז בעדינות את coverslip קדימה ואחורה. שים לב כי כל עיכוב בהעברת coverslip הלוך ושוב צפוי לצמצם הפצת הנשק כרומוזומליות כמו שהם נוטים להיות נוקשה יותר בחשיפה הפתרון חומצה Lactoacetic. ערפול של הפתרון הוא בדרך כלל אינדיקציה טובה ההפרדה התא. בעדינות הקשה coverslip באלכסון (כדי למנוע לחץ אנכי) עם הצד במחק של עיפרון כמה פעמים יכול גם לסייע בהפצת כרומוזומליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לבדוק את הרקמה תחת מיקרוסקופ שלב לעומת יעד של 20 40X או כדי לקבוע אם הכרומוזומים היטב להתפשט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כרומוזומליות הפצת מספיק, להגדיר את השקופית עם הצד coverslip על ערימה של קים נקי, מגבונים. המקום השני קים-למחות על גבי ולשטח כרומוזומים על ידי הנחת האצבע על איפה coverslip ממוקם ולחיצה בתקיפות, להימנע מכל תנועה אופקית של coverslip כי היה גזירההכרומוזומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את השקופית שוב תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע אם התכשיר מתאים למטרה המיועדת. אם הכרומוזומים עברו באופן משמעותי על מועך, להשתמש פחות נפח של תמיסת חומצה Lactoacetic בהכנות הבאים שלך. חזור על שלבים עד 4.1-4.8 מספר מספיק של שקופיות מתאים הושגו. מקום 175 גרם משקולות על coverslip של השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי דיואר קטן (למשל, בקבוק תרמוס) עם חנקן נוזלי. בעזרת מלקחיים ארוכים, לטבול להחליק לתוך הנוזל N 2 עד מפסיק רותחים, להסיר שקופיות, ומיד להשתמש בקצה של סכין גילוח נקי בפינה אחת כדי להפוך את coverslip. אם השקופית ישמש באופן מיידי, מקום בצנצנת Coplin עם PBS ב 4 ° C. אחרת לגבות את השקופית לתוך צנצנת Coplin מלא אתנול 95%. בדוק את coverslip פעם כפור יש בסובלימציה ממנו לאשר כי הרקמה דבק לשקופית ולא להישאר עם coverslip. חזור עם שאר השקופיות עד כל השקופיות מאוחסנים או PBS (לשימוש בתוך מספר שעות) או אתנול (עבור אחסון לטווח ארוך יותר). </li></ol> נציג תוצאות הצעד הקריטי הראשון עבור השגת איכות גבוהה polytene הכנה סקווש הוא לגדול הזחלים שומן עם גרעין גדול בלוטת הרוק. השנייה היא טכניקה טובה עם ההליך להפיץ, אשר עשוי לקחת חלק באימון. טיפ להצלחה הפצת משופרת היא למצוא את נפח מינימלי של פתרון חומצה lactoacetic במהלך השלב מועך. זו תקדם מספיק להפיץ הכרומוזומים מבלי ליצור כוחות זרימה מוגזמת שיכולה לשטוף ידיים כרומוזום משם. זה גם ראוי לציין כי כל עיכוב בהעברת coverslip הלוך ושוב תפחית הפצת הנשק כרומוזומליות כאשר הם הופכים נוקשים יותר כאשר הם נחשפים הפתרון חומצה Lactoacetic. אם הכל ילך כשורה, צריך להיות רבים הכרומוזומים polytene להפיץ היטב. איור 1 מציג דוגמה של הכנה כזו, שכותרתו כפול עם כסמן לאזורים interband בירוק עם צבע כי כתמים באזורים התאגדו בכחול. אם הפצת מספיק מתקבל, הכרומוזומים ייראה כדורים קטנים, כפי שמוצג באיור 2. מצד שני, אם יותר מדי מתפשט התרחש, chomosomes תהיה רזה מדי המורחבת או במקרים מסוימים מקוטעת לחתיכות קטנות כפי שמוצג באיור 3. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig1.jpg" alt="איור 1" /> 1. איור הכנה Polytene סקווש שכותרתו כפול עם נוגדנים קינאז H3S10 ז&#39;יל-1 היסטון (באדום) ו Hoechst (כחול). <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig2.jpg" alt="איור 2" /> 2. איור Polytene סקווש עם הפצת מספיק. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. סקווש Polytene עם יותר מדי מתפשט.

<ol>
	<li>Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II-mediated+transcription+at+active+loci+does+not+require+histone+H3S10+phosphorylation+in+Drosophila.">RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila.</a> Development. 135, 2917-2925 (2008).</li><li>DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+GFP-fusion+proteins+on+polytene+chromosomes.">Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes.</a> Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).</li><li>Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+transcription+and+epigenetic+chromatin+modification+in+Drosophila+polytene+chromosome+squash+preparations+using+antibodies.">Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies.</a> Methods. 48, 387-397 (2009).</li></ol>

הכללתו של חומצות אצטית לקטית פרוטוקולים קיבעון קונבנציונאלי סקווש מקלה הן ברזולוציה interband והזרוע כרומוזומליות מתפשטת אך למרבה הצער epitopes כמה אינם שורדים את הטיפול הזה. דוגמה epitope כזה היא H3S10ph (Cai et al. 2008). מאז הטיפול בחומצה יש גם חיסרון, כי זה מרווה את הקרינה הפנימית של ה-GFP-tagged חלבונים, DiMario et al. (2006) לאחרונה פיתח משחררי פורמלדהיד &quot;נטול חומצה טכניקה סקווש&quot; המאפשרים להדמיה ישירה של חלבון ה-GFP-Fusion על כרומוזומים polytene ללא תיוג GFP-נוגדנים, כמו גם לגילוי נוגדנים של חומצה רגיש epitopes. שינויים עבור הליך זה מתוארים נוספת יוהנסן ואח&#39; בפירוט. (2009). חומצה נציג קבוע polytene סקווש הכנה שכותרתו כפול עם נוגדנים ל ז&#39;יל-1 היסטון H3S10 קינאז ו Hoechst מוצג באיור. 1.

preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling

תסיסנית כבר זמן רב במערכת מודל האהוב לחקר הקשר בין מבנה הכרומטין ויסות הגנים, בשל היתרונות ציטולוגית הניתנים על ידי ענקי הרוק polytene הכרומוזומים של בלוטת הזחלים instar השלישי. ברקמת זה הכרומוזומים לעבור סיבובים רבים של שכפול בהעדר חלוקת התא והוליד כ 1,000 עותקים. ה-DNA נשאר מיושר לאחר כל מחזור replicative וכתוצאה מכך הכרומוזומים מוגדלים מאוד אשר מספקים הזדמנות ייחודית, כדי לקשר בין המורפולוגיה הכרומטין עם לוקליזציה של חלבונים ספציפיים. כתוצאה מכך, חלה על רמה גבוהה של עניין בהגדרת שינויים epigenetic נוכח גנים שונים בשלבים שונים של תהליך השעתוק. כלי חשוב עבור מחקרים כאלה הוא תיוג של כרומוזומים polytene עם נוגדנים האנזים, גורם שעתוק, או שינוי היסטון של עניין. זה פרוטוקול וידאו ממחיש את הטכניקה סקווש המשמשים את המעבדה יוהנסן להכין תסיסנית הכרומוזומים polytene תיוג נוגדן.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling at JoVE.com

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

זה פרוטוקול וידאו ממחיש את הטכניקה סקווש המשמשים את המעבדה יוהנסן להכין<em&gt; תסיסנית</em&gt; הכרומוזומים polytene תיוג נוגדן.

הכנת מועכת תסיסנית Polytene כרומוזום עבור סימון נוגדן

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

preparation-drosophila-polytene-chromosome-squashes-for-antibody

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

31.0K Views.  Iowa State University. זה פרוטוקול וידאו ממחיש את הטכניקה סקווש המשמשים את המעבדה יוהנסן להכין תסיסנית הכרומוזומים polytene תיוג נוגדן.

Video: Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Genetics

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

ציור כרומוזום דו מימדי ותלות מימדי אצל יתושים מלריה

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Immunology and Infection

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה של סחר תוך-תאי מקוטב והפרשת חלבוני ממברנת מרתף במהלך Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Developmental Biology

שיפור הדמיית חלבונים באמצעות הדמיה חיה בתיווך נוגדנים

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

מחבר זרקור: חשיפת הדינמיקה של אותות מכניים וביוכימיים במחקר מורפוגנזה של בעלי חיים 

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

שיטה פשוטה DNA הקרינה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה לכרומוזומים &quot;סתמת

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

יצירה &quot;אנושי&quot;<em&gt; דרוזופילה</em&gt; S2 שורת תאים רגיש לתרופתי עיכוב של Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

הכנת מועכת תסיסנית Polytene כרומוזום עבור סימון נוגדן

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים

ציור כרומוזום דו מימדי ותלות מימדי אצל יתושים מלריה

Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן

הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה של סחר תוך-תאי מקוטב והפרשת חלבוני ממברנת מרתף במהלך Drosophila Oogenesis

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של

שיטה פשוטה DNA הקרינה

יצירה "אנושי"