T2DMマウスにおける腹部マッサージの固定と操作方法

本研究では、ストレスや組織損傷を最小限に抑えながら手動マッサージを再現するマウス用腹部マッサージ器について紹介します。このデバイスは、2型糖尿病マウスの血糖値を大幅に低下させ、脂質代謝を改善し、インスリン感受性を高めることで、臨床的可能性を秘めた有望な非侵襲的治療アプローチを提供します。

2型糖尿病(T2DM)は、世界中で5億人以上が罹患している、急速に拡大している世界的な公衆衛生問題です。腹部マッサージは、2型糖尿病の管理に潜在的な利点を示していますが、特に動物実験では、動物のコンプライアンスや正確な圧力制御の必要性などの課題が実施を複雑にしているため、その有効性は不明のままです。これらの課題に対処するために、本研究では、マウス専用に設計された新しい腹部マッサージシミュレーションデバイスを紹介します。このデバイスは、動物へのストレスや組織の損傷を最小限に抑えながら、制御された方法で腹部マッサージの介入を実施するための実用的なソリューションを提供します。マウスの手足をしっかりと拘束し、マッサージ中に意識を保つことができ、腹部に加えられるマッサージの圧力と頻度の両方を正確に制御できます。手動腹部マッサージを正確にシミュレートするデバイスの機能は、T2DMへの影響を評価する実験的研究に新たな可能性を開きます。このプロトコルの主な目標は、マウスの血糖値、脂質代謝、インスリン感受性などの主要な T2DM マーカーに対する腹部マッサージの影響を調査することです。このデバイスは、腹部マッサージの信頼性と再現性のある方法を提供することで、T2DMの非侵襲的治療介入としての可能性について貴重な洞察を提供することができます。この研究の結果は、糖尿病の予防と治療のための臨床戦略の進歩、特に現代医療における腹部マッサージのような伝統的な治療法の理解を深めることに貢献する可能性があります。

2型糖尿病(T2DM)は、インスリン抵抗性と膵臓β細胞の機能不全を特徴とする慢性疾患です。これは全国的な公衆衛生問題であり、世界中で発生率が急速に増加しています¹。Global Metabolic Disease Burden Reportによると、世界中で5億人以上が糖尿病を患っており、そのうち90%以上が2型糖尿病²を患っています。腹部マッサージは、2型糖尿病の治療のための重要な介入です。腹部マッサージは、2型糖尿病患者の血糖値、生活の質、腸内細菌叢の組成、およびその代謝産物を大幅に改善し、インス^リン感受性を高めることができることが多くの研究で示されています^3,4,5。さらに、腹部マッサージは、胃腸の蠕動運動を促進し、消化機能を改善し、胃腸のうっ血を軽減し、栄養素の吸収とグルコース代謝を最適化します^6,7,8。腹部マッサージが T2DM の結果を改善する可能性にもかかわらず、十分には調査されていません。具体的には、腹部マッサージは、インスリンシグナル伝達経路などの代謝経路を調節することにより、インスリン感受性とグルコース代謝を改善することが示されていますが、正確な生理学的プロセスはまだ完全には理解されていません。この研究は、腹部マッサージが動物モデルで 2 型糖尿病をどのように改善できるかについて、より詳細なメカニズムの洞察を提供することにより、このギャップを埋めることを目的としています。

この研究の主な目標は、マウス専用に設計された革新的なデバイスを使用して、腹部マッサージが 2 型糖尿病に及ぼす影響を研究するための標準化された再現性のある方法を設計および開発することです。このデバイスは、圧力や頻度などのマッサージパラメータを正確に制御しながら、動物のストレスを最小限に抑え、動物福祉のコンプライアンスを確保することを目的としています。

しかし、動物モデル、特にマウスに腹部マッサージを行うには、いくつかの課題があります。現在の研究方法は、一貫性のないマッサージの適用、均一な圧力と頻度を維持することの難しさ、介入中の動物のコンプライアンスの確保などの課題に直面しています。これらの制限は再現性を妨げ、結果にばらつきをもたらすため、より効果的で信頼性の高い手法の必要性が強調されています。この問いに答えるためには、動物実験が不可欠です。動物の腹部マッサージでは、一定の圧力と頻度を維持する必要があります。しかし、実際には、動物は自然に活動的であるため、動物が指示に従い、デバイス内で必要な位置に留まることは容易ではありません。また、介入中に一貫した圧力と速度を確保することも困難であり、腹部マッサージ技術に必要な安定性を達成するのが難しくなります。したがって、マウス、ラット、およびその他の動物モデルに対して腹部マッサージ介入を行うことは、研究において依然として重要な課題です。また、動物実験では、ストレスや不安の軽減、痛みの軽減、全身の状態の改善など、動物福祉に関する課題に取り組む必要があります。麻酔後のマッサージや手動拘束などの既存の方法は、多くの場合、労働集約的であり、実験的なバイアスを導入したり、意識のある動物の自然な生理学的条件を再現できなかったりします。以前の解決策には、ラット腹部マッサージモデル^9,10,11が含まれていました。これらの制限を克服するために、マウス用の新しい腹部マッサージデバイスを紹介します。本研究では、これらの制限を克服するために設計された新しい腹部マッサージデバイスを紹介する。従来の技術と比較して、この装置は、安定した動作、マッサージパラメータの正確な制御、動物のストレスの軽減、再現性の向上など、大きな利点を提供します。さらに、その費用対効果の高い設計により、代謝性疾患研究における幅広いアプリケーションへのアクセス性が向上します。このデバイスは、最新のエンジニアリングと従来の治療アプローチを統合することにより、T2DMの非侵襲的実験方法論における重大なギャップを埋めます。

このアプローチは、2型糖尿病の非侵襲的治療技術、特に腹部マッサージが消化器および代謝機能に及ぼす調節効果を強調する伝統的な中国医学(TCM)に由来する技術に関する幅広い文献に貢献しています。研究者は、この方法がT2DMやその他の代謝障害に対する非薬理学的介入の研究に特に適していると感じるかもしれません。この方法は、主要な実験的課題に取り組むことにより、この分野の臨床研究とトランスレーショナル研究を前進させるための基盤を提供します。

すべての動物実験は、南京中医薬大学の動物管理および使用委員会によって承認されました(承認番号:202409A033)。ここでは、8週齢、体重22g±2gのSPFグレードの健康な雄C57BL/6Jマウス24匹を選抜しました。マウスは、温度20〜22°C、相対湿度45〜50%で12時間の明暗サイクルの下で飼育されました。動物たちは食べ物と水を自由に手に入れることができました。

1. T2DMマウスモデルの確立

1. 動物施設の新しい環境に適応するために、マウスに標準的な食事を1週間与えます。1週間後、C57BL/6Jマウス24匹を対照群(6匹)とT2DMモデル群(18匹)に分けて、乱数表を用いて無作為に分けます。対照群には精製された標準食を投与し、T2DMモデル群には高脂肪食を投与します。6ヶ月間ダイエットを続けます。
2. この期間中、マウスの飲酒、食事、体重、空腹時血糖、およびランダムな血糖値をモニターします。2回連続して血糖値が7.8 mM / Lを超える場合は、インスリン負荷試験(ITT)を実施します。曲線下面積 (AUC) の値が 35 より大きい場合、T2DM モデルが成功したと考えます。
3. T2DMモデルが安定したら、介入を開始します。

2. マウスのグループ化と治療

1. T2DMモデリングが成功したら、乱数表を使用してT2DMマウスを次のグループのいずれかにランダムに割り当て、偏りのない選択を確保します:モデルグループ、メトホルミングループ、腹部マッサージグループ、各グループに6匹のマウス。
2. 対照群では介入を行わない。乱数表を使用して、各マウスを実験グループの1つに割り当て、グループが初期体重とグルコースレベルの点で同等であることを確認して、割り当てのバイアスを最小限に抑えます。
3. 実験全体を通してモデルグループに高脂肪食を与え、0.2 mLの生理食塩水を毎日、1日1回、週6日、8週間強制経口投与します。
4. 実験中、メトホルミングループに高脂肪食を与えます。メトホルミン錠剤を粉砕し、1日1回200 mg / kg /日で強制経口投与のために溶解し、生理食塩水で0.2 mLに希釈します。.これを1日1回、週6日、8週間投与します。
5. 腹部マッサージグループでは、実験全体を通して高脂肪食を摂ります。マウスに毎日0.2mLの生理食塩水を強制投与します。薬物投与の5分後に一度腹部マッサージを行います。.腹部マッサージの介入を週に6回、決まった時間に、休息日を1日挟んで、8週間連続して実施します。
   1. 自家製のげっ歯類の拘束具を使用してマウスを固定し、腹部を露出させながら、腹部マッサージのために落ち着いていることを確認します。
   2. マウスがShenqueとTianshuのポイントを見つけるためのツボマップへの参照。ShenqueからTianshuまでの距離を半径として使用し、時計回りの回転マッサージを1分間に100〜120回、30分間行います。介入中に加えられた圧力範囲は 0.1-0.3 N/cm でした。マウスが許容できるレベルに圧力を調整しながら、落ち着いてFPS圧力試験システムを使用して監視します。

3. 腹部マッサージトレーニング器具の準備

1. 厚さ1mmのポリプロピレン板を用意して固定板を作り、片側4.5cm、もう片側3cmの半径の半円に成形します。広げると、上辺が8cm、下辺が10cm、辺の長さが10cmの台形を形成します。透明なプレートを使用して、図1A-Cに示すようにマウスの固定を観察します。
2. マウスのサイズに応じて、 図1Aに示すように、固定プレートに4つの長い穴を開けます。
3. 柔らかくて丈夫な不織布を用意し、中心を楕円形に切り、角に細長い直線の帯を4本入れて固定布として使用します。長くてまっすぐなストリップがプレートの4つの細長い穴を通過できることを確認します。マウスのサイズに基づいて、 図 1B に示すように、マウスの手足が通過するように、布ストリップに 4 つの丸い穴を開けます。
4. マウスの腹部サイズに基づいて感圧フィルムセンサーを選択し、マウスの腹部に対応する固定布の部分に圧力フィルムを貼り付けます。 図1Dに示すように、フィルムを圧力監視装置に接続します。

4.腹部マッサージの施術

1. 固定布の4本の長いストリップを固定プレートの穴に通し、マウスが簡単に通過できる通路を作ります。
2. 図2Aに示すように、マウスを半径4.5cmの側に置き、穴を掘る本能を使用して半径3cmの側に移動するように促します。
3. 透明固定プレートの裏側からマウスの位置を観察します。マウスが適切な位置に到達したら、4つのファブリックストリップを締めて、マウスを固定ファブリックの中央部分に結合します。ストリップを結び目で結び、マウスを固定します。
4. 図2Bに示すように、固定プレートを裏返し、鉗子を使用してマウスの手足を固定布の4つの丸い穴から引き出し、マウスをさらに固定します。
5. 片手でプレートを持ち、固定マウスデバイスを手のひらに置き、マウスの仰臥位を配置します。親指でマウスの腹部に腹部マッサージを行います。手順中は、図2C-Dに示すように、マウスの腹部の圧力膜センサーに加えられる力が一定で均一に保たれるように、圧力監視装置の値を注意深く監視します。
   1. 腹部マッサージ中にマウスの鼻と唇が紫色に見える場合は、固定布がきつすぎて酸素欠乏を引き起こしていることを示している可能性があります。このような場合は、すぐに手順を中止し、布片を緩め、マウスを離して酸素欠乏から回復します。
   2. 腹部マッサージ中、マウスはより頻繁に排便または排尿することがありますが、これは腹部マッサージに対する正常な反応です。迅速なクリーニングを行います。
6. 腹部マッサージの20分後、布片の結び目を緩め、マウスが固定装置から解放されるようにします。
7. マウスが腹部マッサージに順応した後、プロセスは最小限の闘争で静かに進行するはずです。マウスが過度に苦労する場合は、固定プレートが壊れている、固定生地がきつすぎるなど、デバイスに問題がないか確認してください。処置中、マウスの快適性とバイタルサインを常に監視します。
8. 実験終了後、動物の体重を量り、血糖値を測定します。

上記の計画によれば、マウスの腹部は所定の位置に固定されたままであり、比較的固定された位置により、マウスは安定した姿勢を保つことができました。一定の頻度で腹部をマッサージすると、マッサージの圧力と持続時間は管理可能な範囲内に制御されました。このアプローチは、漢方薬の伝統的な腹部マッサージと似ています¹²。この介入計画に従うことで、介入時間を適切に延長することができ、マウスがトレーニングに適応し、不快感を軽減し、実験手順の標準化に貢献し、実験効率を向上させます。

腹部マッサージがT2型糖尿病マウスの血糖値と体重に及ぼす影響
ブランク群と比較して、図3に示すように、モデル群のマウスの空腹時血糖値(FBG)とランダム血糖値(RBG)のレベルと体重は有意に増加しており、T2DMモデルが成功裏に確立されたことが示されました。モデル群と比較して、腹部マッサージ群とメトホルミン群のマウスのFBGおよびRBGレベルは、図3A-Bに示すように減少しました。両者の間に有意差はなく、メトホルミンと腹部マッサージの両方が糖尿病モデルにおける体重と高血糖の減少に有効であることが示されました。さらに、どちらの介入もマウスの体重を改善し、これは血糖コントロールの改善に関連している可能性があります。これらの結果は、このプロトコルによって提供される腹部マッサージ戦略が、T2DMマウスの血糖値の調節においてメトホルミンと同様の効果を有することを示唆しています。

腹部マッサージがT2型糖尿病マウスの脂質代謝に及ぼす影響
脂質代謝に関しては、ブランク群と比較して、モデル群のマウスの総コレステロール(TC)、低密度リポタンパク質(LDL)、およびトリグリセリド(TG)のレベルは、 図4A、C、Dに示すように上昇し、高密度リポタンパク質(HDL)のレベルは 図4Bに示すように大幅に低下しました。腹部マッサージ後、マウスのTC、LDL、およびTGレベルは、 図4A、C、Dに示すように有意に減少しました。対照的に、 HDLレベルは図4Bに示すように増加し、メトホルミン群と有意差はありませんでした。これは、腹部マッサージが脂質代謝の最適化においてメトホルミンと同様のプラスの効果を持っていることを裏付けています。

T2DMマウスのインスリンシグナル伝達経路に対する腹部マッサージの効果
ブランク群と比較して、図5に示すように、モデル群のマウスの肝臓組織におけるIRS-1、IRS-2、PI3K、AKT、およびGLUT4 mRNAの発現レベルは有意に減少しました(p < 0.01)。肝臓組織サンプルは、8週間の介入期間の終了時に収集され、その後、TRIzol試薬を使用してRNAを抽出し、定量PCR(qPCR)を使用して分析されました。腹部マッサージとメトホルミンで治療したマウスにおけるPI3K、AKT、およびGLUT4 mRNAの発現レベルは有意に増加しました(p < 0.01、p < 0.05)。腹部マッサージ群とメトホルミン群の差は、図5C-Eに示すように、有意ではなかった(p > 0.05)。これらの結果は、腹部マッサージとメトホルミンの介入の両方が、PI3K、AKT、GLUT4などのインスリンシグナル伝達経路の主要な遺伝子の発現を増加させることにより、インスリンシグナル伝達を効果的に増強することを示唆しています。これらの知見は、腹部マッサージがメトホルミンと同等のT2DMに対する治療効果を有することを示しており、これはおそらくインスリン感受性を改善し、同様の分子メカニズムを通じてグルコース恒常性を促進することによってである。腹部マッサージ群とメトホルミン群の間に有意差はなく、腹部マッサージが 2 型糖尿病の管理におけるメトホルミンの実行可能な代替または補完的なアプローチである可能性があることを示唆しています。これらの結果の重要性は、インスリンシグナル伝達経路を調節する糖尿病の非薬理学的治療に関する洞察を提供する可能性にあります。

図1:腹部マッサージトレーニング機器の準備 (A)厚さ1mmのポリプロピレンプレートを固定用の穴のある台形に成形し、マウスの手足に4つの穴をあけて、柔らかい不織布をフィットするようにカットします。圧力フィルムセンサーをマウスの腹部の生地に置き、圧力監視装置に接続します。(B)装置の完成組立は、固定プレートの正面図を示しています。(C)組み立てが完了した後、図は固定プレートの裏側図でデバイスの最終結果を示しています。(D)マウスの固定に使用した固定布を締めた後の効果の様子。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:マウスの腹部マッサージ手順(A)マウスを半径4.5cmの側面に置き、マウスの穴を掘る習性を利用してマウスを半径3cmの側面に移動させます。(B)さらに、マウスの手足を操作して、固定布の4つの穴からマウスを引き出してマウスを固定します。(C)オペレーターはプレートを片手で持ち、マウス固定装置を手のひらに置いて、マウスが仰向けになるようにします。(D)もう一方の手の親指を使用して、マウスの腹部をマッサージできます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:腹部マッサージがT2DMマウスの血糖値と体重値に及ぼす影響 (A)8週間の介入後のT2DMマウスの空腹時血糖値(FBG)値の比較(グループあたりn = 6)。(B)介入の8週間後のT2DMマウスのインスリン抵抗性指数(IRI)レベルの比較(グループあたりn = 6)。(C)8週間の介入期間中のT2DMマウスの体重変化の比較(グループあたりn = 6)。測定はベースライン時と8週間の介入後に行われました。エラーバーは、平均の標準誤差(SEM)を表します。統計分析は、一元配置ANOVAとそれに続くTukeyの事後検定を使用して実行されました。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 は、グループ間の有意差を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:T2DMマウスの脂質代謝に対する腹部マッサージの効果(A)介入群間のLDLコレステロール値の比較(グループあたりn = 6)。(B)介入後の各グループにおける高密度リポタンパク質(HDL)レベルの比較(グループあたりn = 6)。(C)介入後のマウスの総コレステロール(TC)値の比較(n = 6/群)。(D)介入の3週間後のT2DMマウスのトリグリセリド(TG)レベルの比較(グループあたりn = 6)。測定は、3週間の介入後に行われました。エラーバーは、平均の標準誤差(SEM)を表します。統計的有意性は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定を使用して決定されました。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 は、グループ間で統計的に有意な差を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:T2DMマウスのインスリンシグナル伝達経路。 (A)介入後の異なるグループ間のIRS-1 mRNA発現レベルの比較(グループあたりn = 6)。(B)介入後の各グループにおける IRS-2 mRNA発現レベルの比較(グループあたりn = 6)。(C)介入後のマウスにおける PI3K mRNA発現レベルの比較(n = 6/群)。(D)介入後の各グループにおける AKT mRNA発現レベルの比較(グループあたりn = 6)。(E)介入後のマウスにおける GLUT4 mRNA発現レベルの比較(n = 6/グループ)。サンプルは、8週間の介入の終了時に収集されました。エラーバーは、平均の標準誤差(SEM)を表します。統計的有意性は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定を使用して評価されました。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 は、グループ間の有意差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

腹部マッサージは、伝統的な中国医学(TCM)マッサージの代表的な基本技術であり、特に脾臓と胃の消化器系の調節とケアにおいて、さまざまなシステム疾患の臨床予防と治療に広く適用されています13,14,15。腹部マッサージは人体の表面に直接影響し、中湾(CV12)、梁門(ST21)、神楽(CV8)、天州(ST25)、関元(CV4)、気海(CV6)などの腹部のツボのほとんどをカバーします。この技術は、腹部のツボを刺激するだけでなく、内臓を深く浸透させて刺激し、均一で優しく、しっかりとした浸透性の操作を通じて体の代謝機能を改善します⁴。

本研究では、実験マウスにおける腹部マッサージの新規シミュレーション装置を設計した。この装置は、透明な固定プレート、柔軟な固定布、および手動マッサージの強さとリズムをシミュレートできる圧力センサーで構成されており、実験マウスへの不必要なストレスや組織の損傷を回避します。従来の腹部マッサージ法や麻酔後の腹部マッサージなど、既存の腹部マッサージ実験プロトコルに関しては、操作は容易であるが、これらの方法は、昏睡状態のマウスにおける実際の生理学的反応を完全にシミュレートすることはできない¹⁵。また、マウスを持ち上げて腹部マッサージを行う方法も、マウスの脊椎に追加の刺激を誘発し、単一因子の制御を困難にし、実験バイアスにつながる可能性がある。この観察結果は、介入中に一貫した条件を維持することが困難になった実験的試験に基づいています。これに対し、この研究で設計されたデバイスは、より制御され、再現性があり、安定した条件を可能にし、費用対効果と再現性の点で明確な利点を提供します。

このプロトコルの重要なステップは、マウスをスタンドに固定し、最小限の動きを維持しながら腹部がマッサージにアクセスできるようにすることです。加えられる周波数と圧力の正確な制御は、力のリアルタイム監視を提供する圧力センサーによって容易になります。マウスの適応訓練は、マウスが数回のセッションでプロセスに順応し、不快感を最小限に抑え、ストレス反応を減らすことができるため、プロトコルのもう一つの重要な側面です。このトレーニングフェーズの後、マウスは毎日30分間の腹部マッサージに耐えることができ、これは実験の信頼性と安定性を確保するための重要な要素です。このプロセスにより、動物は過度のストレスを感じることなく適応することができ、これは結果の完全性に不可欠です。

最近の研究では、腹部マッサージが2型糖尿病(T2DM)に対して、血糖値の低下や脂質代謝の最適化など、複数の調節効果があることが示されています^5,12,17。この研究では、腹部マッサージ群のマウスは、空腹時血糖値(FBG)とランダム血糖値(RBG)の有意な低下を示しました。さらに、腹部マッサージ群の脂質代謝指標は大幅に改善し、総コレステロール(TC)、低密度リポタンパク質(LDL)、およびトリグリセリド(TG)のレベルは大幅に減少しました。対照的に、高密度リポタンパク質(HDL)のレベルは大幅に増加しました。これらの結果は、代謝性疾患に対する腹部マッサージの潜在的な介入価値を明らかにし、2型糖尿病の包括的な治療に新たな方向性を提供します。

これらの改善の根底にある分子メカニズムのより深い調査は、腹部マッサージが、特にPI3K、AKT、 GLUT4などのグルコース代謝に関与する主要な遺伝子の発現をアップレギュレーションすることにより、インスリンシグナル伝達経路を調節することを示しています。これらの遺伝子は、グルコース取り込みとインスリン感受性の調節に関与するインスリンシグナル伝達経路に不可欠です。PI3KとAKTのアップレギュレーションは、下流のシグナル伝達分子の活性化を促進し、筋肉や脂肪組織などの組織でのグルコースの取り込みと貯蔵を促進します。一方、GLUT4の発現が増加すると、細胞内へのグルコース輸送が促進され、全体的なグルコースの恒常性が向上します。これらの分子変化は、グルコース代謝とインスリン感受性の観察された改善に寄与している可能性が高く、T2DM管理における腹部マッサージの潜在的な治療効果についての洞察を提供します。

しかし、このプロトコルの実験手順では、研究者の技術的なトレーニング、特にマウスにデバイスに慣れ親しむ必要があり、マウスが手順中に経験する不快感を最小限に抑えるために繰り返し練習する必要があります。今後の研究におけるもう一つの重要なポイントは、マッサージの強度と頻度を最適化し、それらが実験結果に与える影響をより深く理解することです。今回の知見はマウスモデルに基づいており、この手法の広範な適用性と有効性を確認するためには、より広範な動物実験や臨床試験によるさらなる検証が不可欠です。

将来的には、このプロトコルは、特に糖尿病、肥満、さらには特定の胃腸疾患などの代謝性疾患の研究において、多くの潜在的なアプリケーションを持っています。この技術の非侵襲的な性質は、より侵襲的な方法の魅力的な代替手段となり、臨床研究や潜在的な治療介入のための新しいアプローチを提供します。また、この装置は他の動物モデルにも適合させることができ、実験環境でのより広範な適用を可能にします。さらに、このデバイスとプロトコルは、伝統的な漢方薬療法の近代化に重要な役割を果たす可能性があり、代謝性疾患やその他の健康状態に対するそれらの影響の根底にあるメカニズムを探求するための科学的プラットフォームを提供します。

著者は何も開示していません。

この研究は、National Clinical Research Base of Traditional Chinese Medicine(JDZX2015127、安徽省中医薬病院に基づく)の特別科学研究プロジェクトの第2陣によって支援されています。