大規模DNAテンプレートの相同性を介した末端結合標的統合 による 初代ヒトT細胞の非ウイルス工学

CRISPR/Cas9技術を使用して、相同性終末結合(HMEJ)DNA修復経路 を介して 、初代ヒトT細胞の大規模なマルチシストロン構造を高効率に標的ノックインするための詳細なプロトコールが提供されています。このcGMP適応型プロトコールで改変されたT細胞は、優れた細胞増殖、細胞毒性、およびサイトカイン産生を維持します。

現在の多くの養子細胞療法は、特定の腫瘍関連抗原を標的とするキメラ抗原受容体(CAR)または外因性T細胞受容体(TCR)の発現のためにT細胞を操作するために、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターに依存しています。治療用T細胞の産生をウイルスベクターに依存すると、製造のタイムライン、コスト、複雑さが大幅に増加し、特に学術的な環境では、新しい治療法の翻訳が制限されます。CRISPR/Cas9と相同性を介した末端結合を使用してT細胞の効率的な非ウイルス工学を行い、大規模なマルチシストロンDNAカーゴの標的統合を達成するためのプロセスが提示されます。このアプローチにより、ウイルスベクターに匹敵する統合頻度を達成し、 in vitro および in vivoの両方で強力な抗腫瘍効果を持つ高機能T細胞が得られます。特に、この方法は、現在の適正製造基準(cGMP)および臨床スケールアップに迅速に適応可能であり、臨床試験で使用する治療用T細胞の製造に短期的な選択肢を提供します。

T細胞は、適応免疫系の重要な構成要素であり、直接的な細胞溶解能力、サイトカインの産生による免疫応答の調節能力、B細胞と樹状細胞のライセンス供与、免疫^{学的記憶の}確立などを持っています1。それらは、免疫発達、恒常性と監視、病原体からの保護、癌からの予防と防御、さらにはアレルギーと自己免疫において重要な役割を果たします¹。T細胞は、V(D)J組換えによって生成される多種多様なT細胞受容体(TCR)を有しており、T細胞は膨大な数の抗原を認識し、さまざまな病原体に対して効果的な免疫応答を開始することができます^1,2。T細胞は、一般に、B細胞などの他の免疫細胞が免疫応答を調整するのを主に補助するCD4 T細胞(ヘルパーT細胞とも呼ばれる)と、^{その表面に}提示される特定の抗原を認識することにより感染細胞または癌性細胞を直接殺傷するCD8 T細胞(細胞傷害性T細胞)の2つのカテゴリーに分類することができる1。

キメラ抗原受容体(CAR)の開発により、免疫療法のためのT細胞のゲノム工学への関心が大幅に高まっています。CARは、抗体由来の抗原結合ドメインとT細胞シグナル伝達ドメインを融合させる遺伝子操作タンパク質であり、T細胞は^CAR3の抗体部分が認識する特異的エピトープを発現する細胞を同定し、標的化することができます。これらの受容体は、感染症や自己免疫など、さまざまな免疫療法に使用されていますが、がんの免疫療法では最も先進的な技術です。

CAR-T細胞は、白血病およびリンパ腫の治療において非常に成功しているが、固形腫瘍の治療に対する有効性は限定的である^4,5。これにより、固形腫瘍の適応症に対するCAR-T細胞の有効性を向上させるためのさらなる開発の波が押し寄せています。サイトカインアーマーリング、チェックポイント遺伝子ノックアウト、ドミナントネガティブ受容体、ケモカイン受容体、1つの細胞内で複数のCARを発現すること、細胞内シグナル伝達を強化するためのCARの修飾、および枯渇を防ぐための宿主調節メカニズムを利用するための所定の遺伝子座(TRAC遺伝子座など)への統合など、複数のアプローチが開発されてきた^6,7,8.これらのアプローチの多くは、より大きな遺伝的貨物および/または部位特異的な統合を必要とします。代替アプローチには、トランスジェニックTCRを使用してT細胞が細胞内ネオアンチゲンを標的にできるようにすることも含まれる^9,10。しかし、これには、TCRがネオアンチゲンエピトープとHLA分子の両方に対する特異性を持つ必要があるという重大な欠点があり、最終的な治療薬の使用は同族HLAを発現する患者に限定されます。さらに、多くの腫瘍は免疫療法に応答してHLA発現を変化または減少させ、トランスジェニックTCRを発現するT細胞の有効性を大幅に低下させる¹¹。

臨床試験中のほとんどのCAR-TまたはTCR-T細胞療法は、レンチウイルスやガンマレトロウイルスなどのレトロウイルスベクターを使用して製造されており、中サイズのカーゴとの高い統合頻度を達成しています。しかし、ウイルスベクターは、現在の適正製造基準(cGMP)要件と非特異的な統合プロファイルにより、挿入突然変異誘発のリスクを生み出すため、製造スケジュールが長くなります^12,13。さらに、貨物が5kbを超えると、トランスジェニックレトロウイルスを高力価で産生することが困難になる可能性があります¹⁴。組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)に由来するベクターなどの他のベクターは、自然には統合されませんが、DNAドナーテンプレートを核にシャトルすることができ、CRISPR/Cas9と組み合わせて使用することで、従来の相同性組換え(HDR)を介したゲノムエンジニアリングを容易にすることができます。しかし、これらのウイルスは、長くて複雑な生産ワークフローも有し、カーゴサイズ(<4.7 kb)や長い相同性アーム(500-1000 bp)を含める必要性によって制限されます15,16,17,18。

トランスポゾンまたは標的ヌクレアーゼとDNAドナーテンプレートの組み合わせを用いた非ウイルス性ゲノム改変は、初代ヒトリンパ球^8,19,20で報告されている。しかし、これらのアプローチは、リンパ球²¹に発現する細胞質DNAセンサーによる認識に続く、細胞質内の裸のDNA分子に対する毒性応答によって制限される。トランスフェクション中にこれらのDNAセンシング経路の低分子阻害剤を使用する試みがなされてきたが、これらの経路の冗長性は、cGMPプロトコル²²におけるそれらの使用を複雑にする可能性があります。特に、Sleeping Beauty、PiggyBac、Tc Busterなどのトランスポゾンベクターは、大きな遺伝子カーゴを高効率で統合することを可能にするが、非特異的な統合プロファイルを有する^23,24。プラスミド、直鎖、または一本鎖DNAテンプレートとHDRの標的ヌクレアーゼを組み合わせた非ウイルス性標的導入遺伝子の統合は、魅力的な代替手段ですが、特に遺伝子カーゴがますます大きくなる場合、効率の低さによって制限されており、1.5 kbを超えるカーゴを使用した場合の効率は10%未満であると報告されています^8,19。

ここでは、Webber, Johnsonらに記載されているように、初代ヒトT細胞における大きなDNAペイロードの非ウイルス性相同性末端結合(HMEJ)挿入のための段階的なプロトコールを紹介します。²⁵. HMEJは、Cas9 gRNAターゲットサイトに挟まれた短い48 bpのホモロジーアームを利用して、従来のHDRと比較して、大きなDNAカーゴの高効率なターゲット統合を可能にします。初代T細胞におけるプラスミドDNAの細胞毒性を低減する1つの方法は、ミニサークルやナノプラスミド²⁵のような最小のバックボーンを持つプラスミドを用いることである。ミニサークルは、プラスミド増幅後の組換えにより複製起源と抗生物質耐性遺伝子を切除することによって作製される小型プラスミドベクターです。それらは、T細胞の非ウイルス工学を改善し、細胞毒性を減少させることが示されています^23,24。ナノプラスミドはまた、最小限の複製起点および非伝統的な選択^{マーカー26}の使用によって達成される全体的なサイズを縮小している。私たちの経験では、minicircleおよびnanoplasmid vector platformは、従来のプラスミドと比較して、同等の効率改善と毒性の低減を実現します²⁵。

ここでは、試薬送達と試薬組成の時間的最適化、HMEJおよびCRISPR/Cas9を使用した高有効性の相乗効果、免疫療法やその他のさまざまなアプリケーションで使用するための大きな(>6.3 kb)マルチシストロンDNAテンプレートを持つ初代ヒトT細胞の部位特異的ゲノムエンジニアリングを実現する詳細なプロトコールを紹介します²⁵.我々は、1 kbのホモロジーアームを使用する従来のHRよりも、特に遺伝的カーゴ>1.5 kb^25,27を用いて、HMEJおよび48 bpホモロジーアームとのより高い統合を達成します。重要なことに、HMEJ修復によって操作されたT細胞は、優れた細胞増殖、細胞毒性、およびサイトカイン産生を保持しながら、消耗していない表現型^{を保持します25}。このプロトコルは、cGMP標準に容易に適応でき、臨床的に関連性のある細胞数に拡張可能であるため、さまざまな臨床試験での将来の使用に迅速に移行することができます²⁵。

すべての実験は、血液媒介病原体に対する普遍的な予防策、滅菌/無菌技術、個人用保護具、および適切なバイオセーフティレベル2(BSL2)装置を使用して行われました。ここで説明するすべての実験は、ミネソタ大学の機関バイオセーフティ委員会(IBC)によって承認されました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 培地の準備

1. T細胞完全培地(TCM)のサプリメントを調製します。
   1. フィルター滅菌した100 mM酢酸を添加して、組換えヒトIL-2を12000 IU/mLの濃度に再構成し、ピペッティングでよく混合します。次に、フィルター滅菌した0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)を1x Phosphate Buffered Saline(1x PBS)に溶解し、6000 IU/mLの濃度にさらに希釈し、ピペッティングでよく混合して長期保存溶液を作ります。
   2. 組換えヒトIL-7を滅菌水で200 ng/μLの濃度に再構成し、ピペッティングでよく混合します。次に、PBS中の0.2% BSAをフィルター滅菌して100 ng/μLの濃度にさらに希釈し、ピペッティングでよく混合して長期保存溶液を作ります。
   3. 組換えヒトIL-15を滅菌水で200 ng/μLの濃度に再構成し、ピペッティングでよく混合します。次に、PBS中の0.2% BSAをフィルター滅菌して100 ng/μLの濃度にさらに希釈し、ピペッティングでよく混合して長期保存溶液を作ります。
      注:各サイトカインを-20°Cから-80°Cの小さなアリコートに最大6か月間保管し、凍結/融解サイクルの繰り返しを避けてください。
2. TCMメディアを準備します。
   1. T細胞増殖基礎培地に2.6% T細胞増殖サプリメントと2.5%免疫細胞血清補充物を添加して、基礎培地を調製します。詳細については 、資料の表 を参照してください。
      1. 1% L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、10 mMのN-アセチル-L-システイン、300 IU/mL組換えヒトIL-2、5 ng/mL組換えヒトIL-7、および5 ng/mL組換えヒトIL-15を基礎培地に添加してTCMを調製します。
      2. 0.22 μmフィルターに媒体を通し、滅菌培地ボトルにTCMを滅菌します。
      3. TCMを最大2週間4°Cに保ちます。
3. リカバリメディアを準備します。
   1. T細胞増殖基礎培地に2.6%T細胞増殖サプリメントと2.5%免疫細胞血清補充物を添加して、基礎培地を調製します。
      1. 1% L-グルタミン、10 mM の N-アセチル-L-システイン、300 IU/mL 組換えヒト IL-2、5 ng/mL 組換えヒト IL-7、5 ng/mL 組換えヒト IL-15 を基礎培地に添加し、1 μg/mL DNase を添加して、回収培地を調製します。
         注:ペニシリン/ストレプトマイシンをリカバリーメディアに添加しないでください。エレクトロポレーション後の細胞回収率を低下させる可能性があるためです。
      2. 0.22 μmフィルターに媒体を通し、滅菌した培地ボトルに媒体を通して、回収培地を滅菌します。
      3. リカバリー培地は4°Cで最大2週間保管してください。

2. ノックインサイトの選択とテンプレートのデザイン

1. ノックインのゲノムターゲット位置を決定します。
   注: AAVS1などのセーフハーバーロケーションは、ターゲットセルへの影響を最小限に抑えたい場合に使用できます。遺伝子発現を阻害する標的部位を用いて、標的遺伝子のノックアウトと目的のコンストラクトのノックインを1ステップで同時に行うことができます。インフレームで内在性遺伝子と統合するように設計された標的部位とドナーを使用して遺伝子融合を作製したり、2Aリボソームスキップ配列と組み合わせてコンストラクトを内因性プロモーターの転写制御下に置くことができます(図1)。
2. 発現カセットが統合部位に一致する48 bpの相同性アームに隣接し、gRNAターゲット部位に直進するようにカーゴテンプレートを設計します。
   注:プラスミド直鎖化gRNAは、ヒトまたはマウスのゲノム²⁵に見られない配列(GGGAGGCGTTCGGGCCACAG)を標的とするように設計されたユニバーサルgRNA²⁸(UgRNA)(GGGAGGCGUUCGGGCCACAG)またはゲノム標的gRNA配列であり得る。これにより、単一のgRNAがゲノムノックイン部位で切断され、カーゴテンプレートも直鎖化できる(図1).ナノプラスミドまたはミニサークルのいずれかをカーゴテンプレートのベクターとして使用できます。標準プラスミドは、一部の形質転換ラインではナノプラスミドやミニサークルの代わりに使用できますが、T細胞などのより感度の高い初代細胞ではノックインや細胞増殖が減少します。

3. T細胞の単離と活性化

1. 商業ベンダーからT細胞を入手するか、免疫磁気選別¹⁸を使用してPBMCからT細胞を単離します。
2. 実験に必要なT細胞の数を決定し、T細胞をTCMで1 mLあたり1 × 10⁶ 細胞の濃度で解凍、洗浄、および再懸濁します。このミックスを1 mLを24ウェルプレートのウェルに加えます。
   1. T細胞活性化ビーズをボルテックスしてビーズを再懸濁し、ビーズを2:1の比率でビーズを添加します:細胞を各ウェルに。これらの細胞を37°Cおよび5%_CO2 インキュベーターで36時間インキュベートしてから、T細胞のエンジニアリングを開始します。
      注:活性化後36時間未満またはそれを超えるインキュベーション時間は、T細胞のノックイン効率、生存率、およびポストエンジニアリング細胞増殖を低下させる²⁵。

4. T細胞工学

1. 実験コントロールを含む、実験を完了するために必要な実験条件を決定します。
   注:エピソーム発現のコントロールとしてプラスミドのみの条件を含めることが重要です。プラスミドドナーの非存在下で、化学的に修飾された標的部位のgRNA²⁸ および/またはCas9 mRNAを用いたエレクトロポレーション条件も、ネガティブコントロールとして使用できます。
2. リカバリープレートを用意します。
   1. 実験コントロールを含む各実験条件について、24ウェル組織培養プレートのウェルに300 μLの回収培地を加え、37°Cおよび5%_CO2 インキュベーターでプレートを温めます。
      注:代替セル番号、回復量、および条件については、 表1 を参照してください。
3. T細胞を調製します。
   1. 刺激したT細胞/T細胞活性化ビーズ混合物を回収し、生細胞をカウントし、T細胞/T細胞活性化ビーズをTCM培地に1〜5〜5×10⁶ 細胞/mLの濃度で1.5mLの微量遠心チューブに再懸濁します。
   2. 微量遠心チューブを磁石( 材料表を参照)に入れ、3分間インキュベートします。
      注:T細胞活性化ビーズを使用してT細胞を活性化する場合は、ビーズの除去が必要です。別の活性化方法を使用する場合、ビードの除去は必要ないかもしれません。
   3. インキュベーション後、磁石から取り出さずに、培地とT細胞を新しいチューブに移します。このチューブには、T細胞活性化ビーズが除去された刺激されたT細胞が含まれています。T細胞を再カウントし、14 mLまたは50 mLのコニカルチューブに入れます。チューブに1×PBSを充填し、遠心分離の準備が整うまで細胞を37°Cおよび5%_CO2 インキュベーターに保管します。
4. T細胞ミックスを調製します。
   1. 必要なマスターミックスバッファー(82%一次細胞溶液と18%サプリメント)の量を決定するには、エレクトロポレーション条件の数に1を加えた数(n + 1)を掛けます。(例:6つのエレクトロポレーション条件を計画 + 1 = 7. 7 × 18 μL / 126 μLのマスターミックスバッファー)。
      注:これらのボリュームは、この研究で使用した4Dエレクトロポレーションシステムに固有のものです( 材料の表を参照)。他のエレクトロポレーションシステムでは、異なる容量と濃度が必要になります。一次細胞溶液の量 = 必要なマスターミックスバッファーの総量 × 0.82 およびサプリメントの量 = 必要なマスターミックスバッファーの総量 x 0.18。(例:0.82 × 126 μL = 103.32 μLの一次細胞溶液と0.18 × 126 μL = 22.68 μL)。
   2. 初代細胞溶液とサプリメントを一緒に混合して、マスターミックスバッファーを作製します。
   3. T細胞を1x PBSで200 × g (室温)で10分間遠心分離し、上清を吸引します。
   4. マスターミックスバッファー中のT細胞を、マスターミックスバッファー18μLあたり1×10細胞6細胞の濃度で再懸濁します。
5. 試薬を準備します。
   1. ストック溶液の濃度を使用して、エレクトロポレーションあたりで示された質量を達成するために必要なHMEJプラスミド、標的部位gRNA、プラスミド直列化gRNA(UgRNA)、およびCas9 mRNAの量を決定します(表2)。
   2. 氷上の96ウェルプレートのウェルに、各条件で試薬を添加します。
6. エレクトロポレーションミックスを調製します。
   1. 必要に応じて、18 μLのT細胞ミックスを96ウェルプレートの各ウェルに加えます。
   2. 必要に応じてマスターミックスバッファーを追加し、すべてのエレクトロポレーション条件が最終総容量が22 μLになるようにします。
      注:22 μLの容量には、ピペッティング損失の可能性を考慮した10%の超過容量が含まれています。
7. エレクトロポレーションを行います。
   1. 機器の電源を入れ、プログラムをロードします。
   2. 必要なキュベットの数を決定し、必要な数のキュベットを開きます。キュベットとキャップの一方の端に印を付け、キュベットからキャップを取り外します。
      注:20μLの反応に対してキュベットあたり16個のウェルがあります。
   3. 96ウェルプレートのウェルからエレクトロポレーションミックス20μLを1〜2回上下に静かにピペットで分け、キュベットに入れます。
   4. ステップ4.7.2で行ったマーキングを使用してキュベットをキャップし直し、キャップを後方に置かないようにします。キュベットを3〜5回軽くたたいて気泡を取り除き、機器を配置してキュベットをエレクトロポレーションします。
   5. キュベットを装置からそっと取り外し、フードに入れ、細胞を室温で15分間休ませます。
   6. 残りの後、80 μLの温めた回収培地を回収プレートから取り出し、各サンプルに加え(細胞に直接ではなく、キュベットの側面に追加)、非常に穏やかにピペットで一度上下させ、合計100 μLの容量を回収プレートに戻します。
      注:エレクトロポレーション後の細胞は非常に壊れやすいです。穏やかな取り扱いは非常に重要です。
   7. 細胞を37°Cおよび5%CO₂ で30分間インキュベートします。
   8. TCMを添加して、細胞を1 × 10⁶ 細胞/mLの濃度に希釈します。翌日に培地の半分を交換し、その後3〜4日ごとに、実験期間中、サイトカイン濃度が2×のTCMと交換します。
   9. 1 × 10⁶ 細胞/mLに希釈した後、T細胞活性化ビーズを0.5:1ビーズ:細胞を各ウェルに添加して細胞を再刺激します。
      注:細胞が急速に拡大している可能性があります。培地の半分の交換を行う必要があり、細胞をより大きなウェルに移動させる必要がある場合があります。
   10. 3日目に、T細胞活性化ビーズを除去します。
   11. 所望の伸長期間が経過した後、細胞を回収します。
       注:キュベットに未使用のウェルがある場合は、使用済みのウェルに印を付けて、キュベット全体を50 mLの円錐形に入れて4°Cで保存し、将来の使用に備えることができます。

ここでは、「Giant Minicircle」コンストラクトと呼ばれる大きな(>6.3 kb)マルチシストロニックテンプレートを、CRISPR/Cas9編集を使用して初代ヒトT細胞の TRAC 遺伝子座に統合しました。TRAC特異的gRNA(TCTCTCAGCTGGTACACGGC)、UgRNA、およびHMEJナノプラスミド(図2A)で、 TRAC特異的gRNA、ユニバーサルgRNA、およびCas9 mRNAをネガティブコントロールとして使用した状態。Giant Minicircleコンストラクト、 TRAC特異的gRNA、ユニバーサルgRNA、Cas9 mRNAを含むサンプルは、GFP発現の測定時の平均ノックイン率が23.35%(23.5%±5.247)でしたが、ネガティブコントロールではGFP発現は見られませんでした(図2B)。実験条件間で倍率拡大(図2C)と生存率(図2D)に有意差はありませんでした。これらの結果は、非常に大きなテンプレートの高効率ノックインが、優れた細胞生存率と細胞増殖を維持しながら実証されています。

図1:HMEJコンストラクト設計の概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:巨大なミニサークルコンストラクトでエレクトロポレーションしたT細胞の特性評価。 (A)ジャイアントミニサークルコンストラクトの概略図、GSGリンカー、抗CD19 CAR、およびMNDプロモーターの下でDHFRミューテインとeGFPを備えたTRACプロモーターの下で抗メソセリンCARおよびRQR8をコードする大きな(>6.3 kb)マルチシストロニックテンプレート。(B)エレクトロポレーションの9日後にGiant MinicircleコンストラクトとCRISPR-Cas9試薬を使用したT細胞のRQR8発現率、(C)倍増拡大、および(D)生存率を、CRISPR-Cas9試薬を含まないGiant Minicircleでエレクトロポレーションしたネガティブコントロールと比較しました。(***p < 0.001)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:キュベットとリカバリープレートの細胞濃度。

表2:必要なCRISPR/Cas9試薬とDNAテンプレートの量。

養子細胞療法(ACT)が進化し続ける中、ウイルスベースのベクターに伴う高コストと複雑さを伴わずに免疫細胞を操作するための効率的な非ウイルス性方法に対する需要が高まっています。この分野での主な目標は、サイトスペシフィックな統合を達成し、人工細胞製品の一貫性、安全性、機能を向上させることです。最近の研究では、レポーター遺伝子や単一のCARまたはTCR配列²⁹などの小さな遺伝子コンストラクトの非ウイルス性統合が成功裏に実証されていますが、これらの方法をより大型の多重遺伝子発現カセットに拡張する必要があります。これらの大型カセットは、ケモカイン受容体やサイトカインアーマーリングの追加など、免疫細胞の機能を強化したり、特異性を向上させたり(ロジックゲートシステムなど)、キルスイッチによる安全性を高めたりするために必要です。この目的のために、我々は、より大きな遺伝的カーゴを効率的に部位特異的に統合することができる非ウイルス性アプローチの開発を目指した²⁵。

プロトコル全体には、いくつかの重要なステップがあります。毒性を最小限に抑えるためには、高品質でクリーンなナノプラスミドまたはミニサークルが必要です。この研究では、市販のプラスミドが最高のパフォーマンスを発揮しました。T細胞の活性化からエレクトロポレーションまでの36時間の期間も、理想的な結果を得るために重要です。また、エレクトロポレーション直後の細胞の取り扱いや操作を最小限にすることで、細胞が回復することも重要です。また、エレクトロポレーション後に新しいT細胞活性化ビーズを培養物に再添加して、可能な限り最高のカーゴ統合頻度と細胞増殖を達成することも重要です。

本明細書に記載されているように、プロトコールは、市販のエレクトロポレーションシステムを使用します( 材料の表を参照)。他のエレクトロポレーションシステムも適しているかもしれませんが、デバイス固有のエレクトロポレーション条件の最適化や、場合によってはエレクトロポレーション後のセルの取り扱いが必要になる可能性があります。

HMEJが介在するヒトT細胞の工学には、いくつかの制限があります。このプロトコルはプラスミドで機能しますが、最適な結果を得るには、貨物の配送にナノプラスミドまたはミニサークルを使用する必要がありますが、これらは標準的なプラスミドほど製造が容易ではありません。さらに、非常に大きなマルチシストロニックカセットの組み込みが成功したことが実証されていますが、遺伝子統合の頻度が低下し始めるカーゴの上限がある可能性があります。

この研究では、HMEJが、特にがん免疫療法の文脈において、操作されたT細胞を産生するための強力で効率的な非ウイルス性ゲノム工学法として紹介されています。従来のウイルスベクターの限界を克服することにより、このアプローチは、機能を強化した遺伝子改変T細胞を生成するための費用対効果が高く、スケーラブルで、より安全な代替手段を提供します。大型の多重遺伝子カセットを精密に統合する能力は、がん、感染症、自己免疫疾患などの幅広い疾患を治療するための免疫細胞のエンジニアリングに新たな可能性を開きます。さらに、HMEJ法は臨床グレードの製造プロセスとの互換性があるため、実際の治療環境での実用化が保証され、近い将来、よりアクセスしやすく効率的な細胞ベースの治療への道が開かれます。

B.R.W.とB.S.M.は、この原稿の研究を支援するためにIntima Biosciencesが資金提供するスポンサー付き研究契約の主任研究者です。この原稿で概説されている方法とアプローチをカバーする特許が出願されています。

B.R.W.は、Office of Discovery and Translation、NIH助成金R21CA237789、R21AI163731、P01CA254849、P50CA136393、U54CA268069、R01AI146009、国防総省助成金HT9425-24-1-1005、HT9425-24-1-1002、HT9425-24-1-0231、およびChildren's Cancer Research Fund、Fanconi Anemia Research Fund、Randy Shaver Cancer and Community Fundからの資金提供を認めています。B.S.M.は、Office of Discovery and Translation、NIHの助成金R01AI146009、R01AI161017、P01CA254849、P50CA136393、U24OD026641、U54CA232561、P30CA077598、U54 CA268069、国防総省の助成金HT9425-24-1-1005、HT9425-24-1-1002、HT9425-24-1-0231、およびChildren's Cancer Research Fund、Fanconi Anemia Research Fund、Randy Shaver Cancer and Community Fundからの資金提供を認めています。