トランスレーショナルリサーチのための可溶性基底膜抽出物のバイオプリンティングのための容積押出バイオプリンターの設計と検証

可溶性基底膜抽出物は、がん研究で最も広く使用されている生物学的マトリックスですが、その複雑なレオロジー挙動により、市販のバイオプリンティングシステムではバイオプリンティングが困難になります。この研究は、単一層と多層の両方で良好な形状忠実度を持つ純粋なマトリックスコンストラクトを生成するためのカスタマイズされたバイオプリンティング戦略を示しています。

トランスレーショナルリサーチでは、3D in vitro モデルは、科学的な理解と治療法の開発を進めるために不可欠です。この目的のために、マウス肉腫細胞に由来する可溶性基底膜抽出物(SBMes)は、 in vivo 微小環境の機械的および生化学的特徴を再現する重要な役割を果たします。特に、組織工学から薬物試験まで、さまざまな研究分野で価値があります。特に、この分野で広く使用されている従来の2D細胞培養は、3次元(3D)構造や腫瘍微小環境を捉えていないため、誤解を招く情報を提供する可能性があるため、がん研究の基本となっています。

がん研究では、効果的な 3Din vitro モデルが、がんの進行をよりよく理解し、薬剤耐性メカニズムなどの課題を予測するために重要です。オルガノイドは、腫瘍生物学をより正確に表現する有望な 3Din vitro モデルとして浮上しています。それらは、細胞が成長し、3D構造に自己組織化できる環境を作り出すため、SBMで成長します。しかし、SBMeには、低い機械的特性や複雑なレオロジー挙動などの大きな課題があり、市販の空気圧押出バイオプリンティングシステムでの使用が妨げられています。

これらの制限に対処するために、低コストで体積制御されたバイオプリンティングシステムと、SBMeで構造をプリンティングするための特定のプロトコルを開発しました。このシステムは、容積式押出機に基づいており、従来の空気圧駆動アプローチの制限を克服しています。特定のgコードで組み立てられ、プログラムされると、システムは純粋なSBMeと希釈されたSBMeの両方をバイオプリントして、単層と多層の両方のコンストラクトを得ることができます。このアプローチは、3D細胞培養モデルを作成するためのより信頼性と拡張性のある方法を提供し、新しい治療法や薬物試験のより効果的な研究への道を開きます。

トランスレーショナルリサーチでは、in vivo環境を忠実に再現した3Din vitroモデルを作成することが、科学的な理解と治療法の開発を進めるために不可欠です¹。それらを構築するための重要な要素は、天然組織の複雑さをよりよく反映する可溶性基底膜抽出物(SBM)などの細胞外マトリックス(ECM)アナログの使用です。SBMは、組織工学から薬物試験まで、さまざまな研究分野で特に価値があります^2,3。特に、腫瘍微小環境の機械的および生化学的特徴を再現し、腫瘍の成長、転移、および治療反応をよりよく反映するモデルの開発を可能にするため、がん研究の基本となっています。

実際、過去数十年にわたる大幅な進歩にもかかわらず、多くの治療法は失敗し続けており、臨床現場での治療の失敗が頻繁に発生しています。この失敗は、多くの場合、高レベルの細胞不均一性によって引き起こされる薬剤耐性メカニズムに起因します^4,5。ヒト腫瘍の複雑さを正確に再現できる効果的なin vitroモデルは、がんの進行をよりよく理解し、この現象を予測するために重要です。

従来の2D細胞培養は、がん研究の基礎となっていますが、実際の腫瘍の3D構造と微小環境を捉えることができないため、薬効と腫瘍の挙動について誤解を招く情報につながる可能性があります^6,7,8。対照的に、3Dインビトロモデルは有望な代替手段として浮上しており、3Dの複雑さを模倣することにより、腫瘍の微小環境と生物学的挙動をより正確に表現しています^9,10。

がん研究では、オルガノイドはヒトの組織や臓器のより正確で関連性の高いモデルを提供するため、疾患や薬効を研究するための3Dモデルとして広く使用されています。Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞に由来するSBMeの使用は、がん研究の進展において極めて重要である^11,12。これは、細胞が成長し、増殖し、オルガノイド構造に自己組織化できるゲル状の基質を提供し、適切な発生と成長を確実にします^13,14。

ただし、SBMeは、その独特で複雑な特性により、多くの課題を提起しています。非ニュートン流体であるSBMeは、せん断減粘特性を示すため、せん断応力が増加すると粘度が減少するため、変動する力の下での取り扱いと適用に一貫性がなくなります。さらに、そのチキソトロピー挙動は、せん断応力が除去されると時間の経過とともにその粘度を回復することができるため、複雑さを増す^15,16。これらの特性は、低い機械的強度(タンパク質濃度に応じて10 Paから5,000 Paの範囲の貯蔵弾性率)と熱感受性挙動とともに、これらの課題を悪化させ、調製および使用中に細心の注意を払って制御し、純粋にバイオプリンティングする必要があります。

標準的な空気圧駆動バイオプリンティングシステムでは、シリンジからの排出後に圧力がかかると制御不能な動作が発生するため、SBMeの分注を適切に制御できません。これは、高分子溶融物について記述された「スパート」効果と同様の現象の影響を受け、流量が特定の臨界圧力値17,18,19を超えて急激に増加する。前の研究¹⁶で報告したように、容積制御ディスペンス戦略は、マトリックスのレオロジー特性、作業条件、およびノズル形状に依存するディスペンサーで発生する圧力からSBMe押出を切り離すことができます。近年、市場では同じ原理を活用する試みが何度か行われており、コーニングのMatribotが先導しています。これにより、制御された温度条件により、SBMeやその他の温度に敏感なバイオインクの取り扱いと堆積が可能になります。ただし、費用がかかるため、小規模なラボではアクセシビリティが制限される可能性があります。

以前の論文では、低コストのカスタム代替案である体積駆動型バイオプリンティングシステム¹⁶を紹介しました。このバージョンは、カスタム3Dプリント押出機を備えた改造されたエントリーレベルの3Dプリンターに基づいていました。バイオプリンティングでは有効であるにもかかわらず、印刷の再現性にはいくつかの制限がありました。エントリーレベルの3Dプリンターから派生したため、Z字型の動きとオートホーミングにいくつかの問題がありました。これらのニーズに対応するために、カスタムの低コスト容積式分注システムの高度なバージョンと、SBMeを使用したバイオプリンティング構造用の特定のプロトコルを開発しました。

ここでは、このシステムの構築と使用のためのプロトコルを提供します。これは、以前の研究¹⁶に基づくカスタム体積制御押出機、バイオプリンターケース、および制御システムで構成されています。生産と組み立てはモジュールごとに行われます。マトリックス処理のプロトコルの説明に従って、特定のgcodeファイルで組み立ておよびプログラムすると、システムはSBMeを使用して、単層と多層の両方で良好な形状忠実度で純粋なまたは希釈されたコンストラクトをバイオプリンティングできます。

1. 3D容積測定バイオプリンターの印刷と組み立て

1. バイオプリンターのコンポーネントを準備し、3Dプリントします。
   1. *をダウンロードします。 補足ファイル1のSTL設計ファイル。
   2. 負荷*。独自のスライスソフトウェアでSTLファイルを作成し、印刷プレート上のピースの向きと3Dプリンターに必要なすべてのオプションを定義します。中品質のオプション(ノズルサイズ0.4 mm、フィラメント直径1.75 mm、押出機温度220 °C、プリントベッドプレート温度50 °C、層高さ0.2 mm、印刷速度300 mm / s)のポリ乳酸(PLA)を使用してピースを印刷します。
      注意: 中品質のオプションは、ピースの印刷に使用したプリンターによって異なる場合があります。
   3. 印刷したピースを3Dプリンターベッドから取り外します。印刷された支持構造がある場合は取り外し、必要に応じて表面を磨きます。
2. 押出機を組み立てます(図1)。
   1. 2つのリニアボールベアリング(LM4UU)をプッシャーブロックの垂直穴に挿入します。親ねじナットT8も背面の中央の穴に挿入し、4本のネジ(M3x10)で固定します。
   2. ステッピングモーターにリジッドシャフトカップリングを取り付けてから、4本のネジ(M3x6)を使用して押出機モーターハウジングに固定します。
      注意: ステッピングモーターの向きを押出機モーターハウジングの溝に合わせて、ケーブルのジャッキを適切に配置できるようにします。
   3. ステップ1.2.2で組み立てたステッピングモーターを、前に挿入した剛性シャフトカップリングを使用してT8親ねじ(150 mm)に固定します。すべてのブロックが止めネジで適切に固定されていることを確認してください。
   4. 押出機ベースの底部に1つの自動調心フランジベアリング(内径8mm)を2本のネジ(M4x8)で取り付けます。
   5. 2つのボールベアリング(4 x 9 x 4 mm)を押出機ベースの上部の特定の穴に挿入し、他の2つを下部の穴に挿入します。
   6. 組み立てた部品(ステップ1.2.1)を、構造上部のキャビティから押出機ベースに挿入します。4つのボールベアリング(ステップ1.2.5)を、両側に1つずつ、合計2本の4mmロッドで接続します。ステップ1.2.1で組み立てられた部品の2つのリニアボールベアリングをロッドに通します。
      注:最初に上部の2つのボールベアリングにバーを挿入し、次にバーを押出機ベースに入れて、下部のボールベアリングに到達し、すべてが定義されたスロットに固定されるようにすることもできます。
   7. 手順1.2.3で組み立てた部品を押出機ベースの中央の穴に挿入します。親ねじを回転させて親ねじナットを通過させ、自動調心フランジベアリングに到達します。コンポーネントの止めネジを使用して親ねじをロックし、2本のネジ(M3x8)を使用して押出機モーターハウジングを押出機ベースの上部に固定します。
   8. 他の 2 本のネジ (M3x40) と M3 ナットを使用して、シリンジ バレル フランジ リテーナーをエクストルーダー ベースの底部に取り付け、シリンジ バレル フランジをロックします (挿入方向は上から下へ)。他の2本のネジ(M3x30)とM3ナットを使用して、シリンジピストンリテーナーをプッシャーブロックの上部穴(挿入方向を下から上)に取り付け、プランジャーフランジをロックします。
   9. 2本のネジ(M4x80)を2つのスプリングに挿入し、エクストルーダーベースとシリンジブロックの底部にある穴に通します。シリンジブロックが滑らないように、シリンジのスペースを残してナットをねじ込みます。
      メモ: ネジは後ろから前に通す必要があります。
3. X軸を組み立てます(図2)。
   1. X_Left_Block部にリニアボールベアリング(LM8UU×24mm)を4個、上部と下部の穴にX_Right_Block個ずつ2個ずつ挿入します。また、X右ブロックとX左ブロックのいずれかの上に2つのベルトブロックをネジ(M2x10)で取り付け、ベルト用のスペースを確保します。
   2. X_Right_Blockの中央の穴に2つのボールベアリング(5 x 16 x 5 mm)を両側に1つずつ挿入します。X_Right_Blockの内部空洞にプーリー(穴5mm)を置き、2つのボールベアリングを5mmロッド(長さ35mm)で接続し、プーリーを通過させます。
      注意: アセンブリには、取り扱いを良くするために、より長いロッドを使用してください。ピースを所定の位置に配置した後、ロッドを希望の長さにカットします。
   3. リミットスイッチを2本のネジ(M3x8)でX_motor_housingに取り付けます。NEMA 17モーターをモーターハウジングに挿入し、4本のネジ(M3x8)を使用してX_block_1カバーをモーターハウジングとモーターに固定します。
   4. プーリー(ボア5 mm)をモーターに取り付け、止めネジでロックしてから、手順1.3.3で組み立てた部品を4本のネジ(M5x8)でX_block_1にねじ込みます。X_Left_Blockの下部にリミットスイッチも2本のネジ(M3x8)で取り付けます。
      注意: ステップ1.3.2と1.3.4のプーリーの外径は同じである必要があります。
   5. 2つのリニアボールベアリング(LM8UU x 45 mm)をX_sliderの上部と下部の穴に配置します。
   6. 手順1.3.2と1.3.4で組み立てたパーツを2本の8mmロッド(長さ200mm)で接続し、ステップ1.3.5で組み立てたパーツに通します。
      注意: 組み立てる前に、ロッドを希望の長さにカットしてください。
   7. ベルトブロックと2本のネジ(M2x8)を使用して、ベルトの一方の端をX_slider_belt_connectionにロックします。組み立てられたパーツ1.3.4のプーリーの周りにベルトを通し、次に組み立てられたパーツ1.3.2のプーリーの周りにベルトを通し、2番目のベルトブロックと他の2本のネジ(M2x8)を使用してもう一方のベルト端をX_slider_belt接続に固定します。正しい動きを得るために、ベルトが適切に締まっていることを確認してください。
      注意: この手順では、干渉を避けるために、X_sliderをX軸構造の一方の端に向かって移動させる必要があります。
   8. X_slider_belt_connectionを1本のネジ(M6x20)でX_sliderにねじ込みます。
   9. 押出機をX_sliderに接続し、4本のネジ(M5x10)で固定します。
4. Y軸を組み立てます(図3)。
   1. 4本のネジ(M3x10)と4つのナットを使用して、固定ブラケットを上リアバイオプリンター部品に配置します。
      注意: 固定ブラケットの位置は、ベルトの適切な張力を得て、ステッピングモーターの挿入を可能にするように調整できます。
   2. ステッピングモーターを固定ブラケットに挿入し、4本のネジ(M3x8)でねじ込みます。次に、クランクシャフトにプーリー(ボア5mm)を取り付け、止めネジで固定します。
      注意: プーリーは、モーターを固定ブラケットに入れる前にクランクシャフトに取り付けて、コンポーネント間の干渉を避けることができます。
   3. 前面の8mmロッドに2つのプーリー(内径8mm)を配置し、2本のロッド(端から2.5cm離れた場所)にロックします。リアロッドに対してこの操作を繰り返し、右端から5cm離れた場所に別のプーリーを追加します。
   4. 12個の自動調心フランジベアリング(直径8mm)をバイオプリンターの内側上部に取り付けます。
   5. ステップ1.4.3で組み立てたロッドを使用して、2つのアップフロントバイオプリンターパーツと2つのアップリアバイオプリンターパーツ(左/右方向)を接続し、自動調心フランジベアリング(直径8 mm)にロックします。組み立てた2つの部品をすべての接合部にネジ(M3x8)で固定します。
      注意: リアロッドを配置するときは、ステッピングモーターのプーリーとロッドの内側のプーリーを接続する閉じたベルトを配置します。
      注意: ステッピングモーターを固定してナットを締め、モーターが動かないようにし、ベルトに適切な張力をかけないようにします。
   6. ステップ 1.4.5 で組み立てた 2 つのパーツを 4 本の 8 mm ロッドで接続します。ロッドを組み立てられた部品1.3にあるリニアボールベアリングに通し、自動調心フランジベアリング(直径8 mm)にロックします。組み立てた2つの部品をすべての接合部にネジ(M3x8)で固定します。
   7. ベルトブロックを使用してX_block_1の上部に開いたベルト端を固定し、この操作をX_block_2繰り返します。ベルトを左側のリアプーリーの周りに通し、次にフロントプーリーの周りに通し、もう一方のベルト端を別のベルトブロックでX_block_1に再度固定します。2 番目のベルトに対してこの操作を繰り返します。
      注意: ベルトは、正しい動きを得るために適切に締められ、Yの動きの曲がりや干渉を避けるために同じ長さにする必要があります。
5. Z軸を組み立てます(図4)。
   1. 下部のバイオプリンターケースパーツ(M4x8)をねじ込みます。
   2. ステップ1.5.2で、1つの自動調心フランジベアリング(直径8 mm)を組み立て部品の底の床に取り付けます。
   3. Z_sliderにある外部穴に2つのフランジ付きリニアボールベアリング(LMH8UU)を固定し、中央の穴に1つの親ねじナット(M3x8)をネジで固定します。
   4. リミットスイッチを2本のネジ(M3x8)で左Z_planeに固定します。
   5. ステッピングモーターをリジッドシャフトカップリングに固定します。ステッピングモーターを4本のネジ(M3x20)でZ_blockに取り付け、ネジ付きロッドをリジッドシャフトカップリングに取り付けます。すべてのブロックが止めネジで適切に固定されていることを確認してください。
   6. ステップ1.5.5で組み立てた部品を、2本の8mmロッドを使用してバイオプリンターベースに接続します。ステップ1.5.3で組み立てたパーツを通過させます。
   7. 2本のネジ(M5x8)を使用してZ_blockを背面パネルに固定します。
   8. 4 本のネジ (M3x25) を使用して Z_plane を Z_slider に接続します。Z_plane穴に上から下まで挿入し、Z_planeとZ_sliderの間にスプリングを通し、ナットで固定します。スプリングの張力を調整して、平面を水平にします。
   9. 特定のキャビティのバイオプリンター構造の下に4つの調整可能な脚を取り付けます。足を調整してバイオプリンターを水平にします。
   10. 組み立てられた部品を手順1.4.6の組み立てられた部品に8本のネジ(M4x12)で接続します。
   11. 構造の前面の特定の場所に2つのヒンジを取り付け、右側の相対的な場所に1つの磁石をネジ(M2x8)で取り付けます。全体の構造を2mmの透明なプレキシガラスシートにねじ込み、開口部を閉じます。
       注意: フロントプレキシガラスパネルをヒンジにねじ込み、磁石に対応する別のネジを取り付けて、フロントドアを取得します。
6. アセンブリを表示します(図5A)。
   1. ディスプレイに接続されたワイヤーを下部の穴に通し、4本のネジ(M3x3)でディスプレイをディスプレイハウジングに取り付けます。
      注意: この通路は、LCDノブカバーなしで行う必要があります。ディスプレイハウジングに取り付けた後、プリインストールされたノブに配置できます。
   2. 4本のネジ(M2x6)を使用して、カバーでハウジングを閉じます。
   3. SDカードを左側のスロットに挿入します。
   4. ワイヤーを構造上部の穴に通します。バイオプリンターの上部にある組み立てられた部品を2本のネジ(M3x8)でねじ込みます。
      注意: すべてのワイヤー(モーター、リミットスイッチ、ディスプレイ)は壁の近くを走り、左下の穴から出ます。それらは、機械部品との干渉を避けるためにケーブルクリップで固定されています。
7. 電子機器アセンブリ(図5B)
   1. ソケットを2本のネジ(M3x10)で電子ケースの外側に固定します。
   2. マザーボードを4本のネジ(M3x10)で電子ケースの内側に取り付けます。
   3. 電源の底部を4本のネジ(M3x8)で電子ケースの内側に取り付けます。
   4. ワイヤーをカバーの円形の穴に通し、マザーボードに接続します。4本のネジ(M3x10)を使用して、電子ケースをカバーで閉じます。
      注:電子機器ケースをバイオプリンター構造に接続したり、作業スペースが狭い場合は机の上に置いておくことができます。
      図 6 に、すべての電子ケーブル接続を示します。それらは、使用している3Dプリンターのマザーボードによってわずかに異なる場合があります。

2. ソフトウェア設定とgcode生成プロセス

1. スライシングソフトの設定準備
   1. スライスソフトウェアを開きます。
      注意: 手順は、使用するソフトウェアやバージョンによって異なる場合があります。
   2. プラットフォームにサインインします。
   3. [設定]オプションに移動します。プリンターを選択し、[ネットワークに接続されていないプリンターの追加] を選択します。[カスタムFFFプリンター]を選択し、[プリンター名]ボックスにプリンターの名前を入力します。[追加]をクリックします。
      注意: 初めてソフトウェアをインストールする場合は、サインイン後に[ プリンターの追加]パネル が自動的に開きます。
   4. [マシン設定]ウィンドウで、デフォルト設定のx、y、zを176、120、45 mmに変更します。
   5. 「加熱ベッド」オプションの選択を解除します (まだ選択解除されていない場合)。
   6. 「開始 g-code」パネルと「終了 g-code」パネルに、補足ファイル 2 の「JoVE_Starting_G-code.txt」および「JoVE_Ending_G-code.txt」というタイトルのファイルで報告されたテキスト行を挿入します。
      1. 開始 g コード ファイルの行 'M92 E150' の値 150 を、適用する流量に応じて変更します。次の式を使用して適切な値を見積もります。
         
         ここで、Qは所望の流量[μL/min]です。
         注:この式は、記載されたシステムで実験的に得られたものです。機械部品または電気部品に変更がある場合は、異なる場合があります。可能な代替手段は、使用中のシステムに応じて値を固定し、目的のgcodeファイルを生成するためのカスタムMATLABコードを作成することです。
   7. [エクストルーダー 1]パネルの[互換性のある材料直径]の値を 1,75 に変更し、閉じます。
   8. マーケットプレイスに移動し、Z Offset Settingプラグインを選択してインストールします。プロセスの最後に、ソフトウェアを再起動して確定します。再度開いたら、[設定] |プリンター |ツールバーの[プリンターの管理]をクリックします。[設定]ウィンドウで、[設定]をクリックし、[すべてチェック]オプションを選択してすべてのオプションをアクティブにして閉じます。
   9. 設定パネルを含むステージメニューの[印刷設定](3番目のボタン)をクリックして、設定を構成します。設定パネルの現在の印刷プロファイルのインフィル率を入力します。[カスタム]ボタンを選択して、現在の印刷設定を変更し、ドロップダウンメニューのプロファイル[ファイン]を変更します。[印刷速度]を10 mm/sに設定します。
2. gcodeの準備
   1. *をダウンロードします。STLデザインファイル、タイトルは「JoVE_Square」、本稿の 補足ファイル2 から。
   2. 負荷。STLファイルをスライスソフトウェアに入れます。
   3. 平らな面にピースを配置し、座標65、42.5、0(X、Y、Z)mmに移動します。をクリックして 2 つのコピーを作成します。オブジェクトリスト内のSTLファイル名と、選択した乗算オプションの選択。それらを次の座標に移動します:16、42.5、0 mmおよび-33、42.5、0 mm(X、Y、Z)。
      注:最終的なgcodeファイルで直接手動で変更しない限り、印刷順序を自動的に定義することはできません。座標は6マルチウェルプレートに対して定義されます。
   4. ステージメニューの印刷設定に移動します。[壁]セクションで、[壁の線数]として0を入力します。Top/BottomセクションのTop/Bottomの厚さの値として0を入力します。[インフィル]パネルに、次の値を挿入します:インフィルパターン:グリッド、インフィルライン距離:5 mm、インフィルライン方向:[0]。
      注意: X軸の精度を向上させるために、印刷速度セクションで移動速度を下げることができます。
   5. [移動]セクションでリトラクトを無効にし、[冷却]セクションで冷却を印刷します。
   6. 「Build Plate Adhesion」セクションで、「Build Plate Adhesion Type」として「None」を選択し、「Special Modes」セクションで「Print Sequence」として「One at a Time」オプションを選択します。
   7. 「Slice」ボタンをクリックして、gコードを生成します。
   8. メモ帳アプリケーションでgコードファイルを開き、12行目の「M104 S200」、「M105」、および「M109S200」のフレーズの後ろの行「M109 S200」を削除します。Cura_SteamEngine 4.9.0" で生成されました。
   9. 次の行の前に「G1 Z25」を追加します。メッシュ:JoVE_Square_rev。STL(6)」を作成し、次の 1 つを 2 つに分割します: (1) G0 F3600 X142.46 Y7.499 と (2) G1 Z0.3。
      注:X座標とY座標は単なる例です。
   10. "; TIME_ELAPSED」は、各ピースの最後のレイヤーの指示ごとにコメントします。
       注:1枚だけを印刷する場合、手順2.3.10は必要ありません。

3. 膨潤・劣化試験

1. 準備手順
   1. 滅菌済みの1 mLガラス製シリンジ(TLL端子)と滅菌済みの25 Gコニカルノズルを用意します。それらを組み立て、組み立てたシリンジを冷蔵庫に入れます。
   2. ピペットチップとSBMeマトリックスバイアルを実験の前日に冷蔵庫に一晩入れます。
   3. 1mm×1mmの円形の孔径を持つ3つのPLAグリッド(Φ=20mm)と、それらをつかむための側面の垂直ピラーを印刷します。
2. 印刷コンストラクト
   1. 組み立てたシリンジとSBMeマトリックスバイアルを冷蔵庫から取り出します。SBMeマトリックス500μLを吸引し、インキュベーターに15分間入れてゲル化させます。
   2. インキュベーターからシリンジを取り出し、バイオプリンターのプリントヘッドに入れます。シリンジプランジャーがプッシャーブロックに適切に接触していることを確認します。
   3. シリンジ固定プランジャーとシリンジバレルフランジをシリンジピストンリテーナーで固定し、シリンジバレルをシリンジクランプで固定します。
   4. バイオプリンターメニューの Auto-home 設定を使用してシステムをキャリブレーションし、軸の原点を自動的に検出します。
   5. Move Axesコマンドを使用してエクストルーダーを動かし、針先がPLAグリッドに接触するまで動かし、手動でZ0を定義します。
   6. バイオプリンターのメニューで印刷するgコードファイルを選択して印刷を開始します。
   7. マルチウェルプレートをインキュベーターに2分間入れて、押し出し後にSBMeが落ち着くようにします。
   8. マルチウェルプレートを取り、バイオプリントグリッドを含む3つのウェルに2mLの細胞培養培地を入れます。マルチウェルプレートをインキュベーターに入れます。
   9. 各時点(t0、1時間、2時間、3時間、4時間、1、3、7、10、14日)で、プレートから各グリッドを取り出し、きれいな紙で乾かして、天秤上の余分な媒体と重量を取り除きます。グリッドをプレートに戻し、次にインキュベーターに戻し、実験を続けます。次の式を使用して、膨潤率と劣化率を推定します。
      
      ここで、W_t は各時点におけるコンストラクトの重量、W_t0 は乾燥コンストラクトの重量です。
      
      ここで、W_i は腫れテスト終了時の重量です。

4. SBMeコンストラクトのバイオプリンティング

1. 準備手順
   1. 滅菌済みの1 mLガラス製シリンジ(TLL端子)と滅菌済みの25 Gコニカルノズルを用意し、バイオセーフティキャビネットの下に組み立てます。それらを冷蔵庫の滅菌ボックスに入れます。
   2. ピペットチップとSBMeマトリックスバイアルを実験の前日に冷蔵庫に一晩(氷上で4°C)入れます。
   3. 20 μLのトリパンブルーを1.5 mLの遠心分離チューブに加えます。
   4. 遠心分離機を345 × g、4°Cに設定し、冷まします(~3〜4時間)。
   5. 遠心分離機のバランスとして、5 mLの水を15 mLの遠心分離チューブに取ります。
   6. 水浴中の温かいリン酸緩衝液(PBS)と培地。
      注:細胞培養培地は、10%ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン-ストレプトマイシン、およびL-グルタミンを添加した完全なダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)でできています。
   7. バイオプリンターを生物学的安全キャビネットの下に置きます。UVライトで20分間滅菌します。
      注意: バイオプリンターが適切に機能するように、オートホーム機能を実行し、各軸の適切な動きとリミットスイッチの動作を確認してください。
2. バイオインク調製
   1. 市販のマウス前立腺がん細胞が入ったインキュベーターにフラスコを入れ、バイオセーフティキャビネットの下に置きます。
   2. 細胞培養培地をフラスコから取り出します。
      注:このプロトコルで報告されている容量は、T25細胞培養フラスコに適用されます。
   3. 細胞を2mLのPBSで一度洗浄し、吸引します。
   4. トリプシン500μLを加え、フラスコをインキュベーターに5分間入れて、プレートから細胞を剥離させます。
   5. 細胞のトリプシン化を確認し、必要に応じてフラスコの底を軽くたたきます。
   6. フラスコに4.5mLの培地を加えます。プレートを慎重に洗浄して、分離したすべての細胞が細胞培養培地に浮いていることを確認します。
   7. 培地を吸引し、15 mLの遠心チューブに加えます。
   8. 20μLのアリコートを取り、トリパンブルーアリコートと混ぜます。次に、この混合物10μLをセルカウンティングチャンバーに入れ、次の式を使用して生細胞をカウントします。
      
      ここで、 f はトリパンブルー懸濁液の希釈係数(1:1の比率)です。V は細胞懸濁液量[mL]です。
   9. 残りの細胞懸濁液を5分間遠心分離します(345 × g、4°C)。
   10. 上清を取り除き、目的の細胞密度(10⁶ cells/mL)で冷たいSBMeマトリックスに再懸濁します
   11. 細胞を含むマトリックス懸濁液800μLをコールドシリンジで吸引します。
   12. シリンジに閉じ込められている可能性のある気泡を取り除き、滅菌ボックスに入れます。その後、インキュベーターに15分間入れてゲル化させます。
3. バイオプリンティングプロセス
   1. インキュベーターからシリンジを取り出し、バイオプリンターのプリントヘッドに入れます。シリンジプランジャーがプッシャーブロックに適切に接触していることを確認します。
      注:モデルと容量は、実験に使用したシリンジと同じである必要があります。
   2. シリンジ固定プランジャーとシリンジバレルフランジをシリンジピストンリテーナーで固定し、シリンジバレルをシリンジクランプで固定します。
   3. エクストルーダーの底部にあるM4ナットを使用して、スプリング圧力を調整し、シリンジを所定の位置にロックします。
      注: 手順 4.3.1 から 4.3.4 を 図 7 に示します。
   4. バイオプリンターメニューの Auto-home 設定を使用してシステムをキャリブレーションし、軸の原点を自動的に検出します。
      注意: このパッセージは、印刷に使用するサポートの種類とは無関係に、常に適切な初期設定を保証します。
   5. 6マルチウェルプレートを印刷面に置きます。
   6. Move Axes コマンドを使用して、針先がウェルの底に触れるまで押出機を動かし、手動でZ0を定義します。
   7. バイオプリンターメニューのメニューオプションでgcodeファイルを選択し、印刷を開始します。正方形の6層グリッド(2.6cm辺)を各ウェルに印刷します。
   8. バイオプリンティングプロセスの後、倒立顕微鏡を使用してプリンティングプロセスが成功したことを確認し、マルチウェルプレートをインキュベーターに2分間入れて、押出後にSBMeが落ち着くようにします。
   9. 各ウェルに2 mLの細胞培養培地を入れます。
      注:ボリュームはコンストラクトを完全に覆う必要があります。

この記事では、低コストのカスタムメイドの容積式バイオプリンターを使用して、SBMeで作られたバイオプリンティングコンストラクトのプロトコルを紹介します。詳細な説明と3Dプリントを提供します*。STLファイルを使用してシステムを構築し、単層および多層構造を印刷することにより、がん研究での使用の可能性を実証しています。各3Dプリントされたコンポーネントは、組み立てる前に、支持構造や不要なプリント残留物から適切に洗浄されています。 図 8 は、アセンブリ全体のさまざまなビューを示しています。 (A) 生物学的安全キャビネット内の負担を減らす可能性を持つために別々のピースを使用する、 または(B) 構造に直接取り付けられた電子ブロックを使用して、よりコンパクトなシステムを持つという2つの異なるオプションがあります。

この容積式バイオプリンティングシステムおよび提示されたプロトコルの目的は、純粋なSBMe¹⁶を用いたバイオプリンティングコンストラクトの代替戦略を提示することです。この方法のおかげで、形状忠実度の高い自立構造を得ることができます。 図9 および 図10 は、説明したシステムを使用した印刷プロセスの最適化の例を示しています。このように、最適な印刷パラメータを確立するためには、常に印刷精度を評価する必要があります。このプロトコルの最適な設定を定義するために、さまざまな流速(43.34 ± 5.77 μL/minから116.69 ± 5.77 μL/minまで)と印刷速度(5〜20 mm/s)を調査しました。繊維の堆積の均一性、拡散率、および標準偏差は、評価の重要なパラメーターです。SBMeはマウス腫瘍細胞に由来する天然由来のECM混合物であるため、バッチ間のばらつきに悩まされます。そのため、これらのパラメーターを使用中のバッチのプロパティに合わせて調整する必要がある場合があります。

定義された最適なパラメータ(流量86.68μL/min、印刷速度10mm/s)により、現在のシステムを使用してより複雑な構造を作成することが可能です。 図10 は、 (A) 細孔径の異なる単層構造と (B) 形状の異なる6層構造の2つの可能性の代表的な結果を示しています。さらに、細胞生物学における重要なパラメータであるせん断応力は、細胞の生存率、細胞シグナル伝達、およびタンパク質発現に影響を及ぼし、流量、ノズル形状、直径、流体粘度などの複数のパラメータに関連しています。

膨潤/分解挙動も、長い細胞培養を扱う際の重要なパラメータです。この記事の目的に対処するために、生物学的マトリックスの膨潤挙動を4時間にわたって評価し、重量は時間の経過とともに安定しています。最初の時点から、SBMeは3時間後に最大4%の初期重量付近でわずかな増加を示しました(図11A)。分解研究は2週間実施されました。SBMeコンストラクトは、7日後に初期重量のほぼ60%を保持しましたが、2週目には徐々に減少し、分解率の約75%に達しました(図11B)。

また、3Dバイオプリントコンストラクトの細胞生存率と、手動ピペッティングで生成されたコントロールとしての100μLマトリックスの3滴との比較を行うことにより、このシステムとバイオプリンティングSBMeのプロトコルの実現可能性を実証しました。 図12で報告されているように、3Dバイオプリント構造中の生存細胞の割合は80%を超えており、これは対照値と同等です。

図1:3Dバイオプリンター押出機の組み立て画像。 この図は、 (A) 3Dプリントされた主な部品と (C) 押出機の組み立てに必要な商用コンポーネントを示し、 (B) は組み立てられたビューを示しています。 (D) この画像は、全体的な手順のすべての主要な手順を報告しています。青い矢印は挿入の方向を示し、赤い円は特定のステップのネジや主要コンポーネントを強調しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:X-Axisエクストルーダーの組み立てイメージ。 この図は、X軸の組み立てに必要な 主要な(A) 3Dプリントピースと (C) 商用コンポーネントを示し、 (B) は組み立てられたビューを示しています。 (D) この画像は、全体的な手順のすべての主要な手順を報告しています。青い矢印は挿入の方向を示し、赤い円は特定のステップのネジや主要コンポーネントを強調しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:Y軸エクストルーダーの組み立てイメージ。 この図は、Y軸の組み立てに必要な 主要な(A) 3Dプリントピースと (C) 商用コンポーネントを示し、 (B) は組み立てられたビューを示しています。 (D) この画像は、全体的な手順のすべての主要な手順を報告しています。青い矢印は挿入の方向を示し、赤い円は特定のステップのネジや主要コンポーネントを強調しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:Z軸押出機の組み立て画像。 この図は、Z軸の組み立てに必要な 主要な(A) 3Dプリントピースと (C) 商用コンポーネントを示し、 (B) は組み立てられたビューを示しています。 (D) この画像は、全体的な手順のすべての主要な手順を報告しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:電子機器の組立イメージ。 この図は、 (A) ディスプレイと (B) 電子ケースの組み立ての主な手順を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:配線回路図。 この画像は、すべてのコンポーネントとのケーブル接続を示しています。電源はACソケットとマザーボードの両方に接続されています。後者は、すべての周辺機器、LCDユニット、および電源に接続します。マザーボード上の色付きの円(青、赤、緑、黒)は、画像の右側にある青い四角で強調表示されており、ステッピングモーターの配線を示しています。各色は、各モーターのそれぞれの色のケーブルを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:シリンジの位置決め。 シリンジを押出機ベースに配置してロックする主な手順。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:システムの組み立て。この画像は、システム全体のさまざまなビューを示しています。2つのオプションが提示されます:(A)構造に取り付けられた電子ブロックなしの(B)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図9:蛇紋岩の印刷適性評価。 この図は、印刷適性評価に関連する画像とグラフを示しています。トップパネル (A)では、流量の増加に伴う繊維の均一性と拡散率を調査しました。底面 パネル(B)では、これらのパラメータを印刷速度を上げて調べた。スケールバー= 1 cm。この図は、De Stefano et ^al.16から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図10:単層および多層グリッドでの印刷適性評価。 代表的な画像は、パネル (A)で細孔径が変化する1層構造の場合、パネル (B) で形状の異なる6層構造の場合に報告されています。この図は、De Stefano et ^al.16から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図11:コンストラクトの膨潤および劣化試験。(A) 経時的なバイオプリントされたコンストラクトの膨潤率で、細胞培養培地中の質量(%)の相対的な増加として表される。 (B) 経時的に残存する質量の割合(%)として示される劣化プロファイル。データは平均±標準偏差(n = 3)として表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図12:細胞生存率の評価。 この図は、(A、C)コントロールサンプルと(B、D)バイオプリントされたSBMeコンストラクトから取得した光学画像を示しています。上面の画像は10倍の倍率(スケールバー=400μm)で取得され、下面のパネルの画像は20倍(スケールバー=100μm)で取得されました。(E)細胞生存率の比較。この図は、De Stefano et ^al.16から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:*。外部構造、X/Y/Z軸、押出機、ディスプレイ、電子機器ハウジングのSTLファイル。 各 *.STLファイルは、図で報告されているものと一致します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:gcode準備ファイル。 *.txt 必要な開始 g コード ファイルと終了 g コード ファイルを含む *.CAD 直方体の例の STL ファイルで、スライス ソフトウェアを使用してインフィルを調整してグリッドを作成できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

トランスレーショナルリサーチでは、SBMは組織工学から薬物試験まで、さまざまな研究分野で特に価値があります^2,3。特に、腫瘍微小環境の機械的および生化学的特徴を再現し、腫瘍の成長、転移、および治療反応をよりよく反映するモデルの開発を可能にするため、がん研究の基本となっています。SBMeは、特に3Dオルガノイド^13,14に最も広く使用されている生体マトリックスです。Engelbreth-Holm Swarmマウス肉腫に由来する天然ECMとして、IV型コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、およびペルレカンの特異な組成を有する。これらの成分は多くの正常組織に見られるため、SBMeは複雑な基底膜によりよく似たものにすることができます。SBMeは、in vivo組織¹⁴の特徴を厳密に模倣した構造への細胞自己組織化を可能にする。ただし、複雑なレオロジー挙動と低い機械的特性が特徴であり、制御不能な挙動でカートリッジから排出されるため、標準の空気圧駆動ディスペンシングシステムでは印刷できません¹⁶。このため、純粋なバイオプリントはほとんど行われず、しばしば他のハイドロゲル^13,20,21,22と混合されるか(たとえそれらが追加のばらつきを導入する可能性があるとしても)、またはマイクロ流体チップにバイオプリントされて機械的支持^体23を得る。

以前の研究では、純粋なSBMeで作られたコンストラクトを、容積式ディスペンシング¹⁶を使用してバイオプリントするための修正戦略を提案しました。当初のシステムは、エクストルーダーを改造した市販の3Dプリンターでした。具体的には、元のものはカスタムメイドのシリンジポンプに置き換えられましたが、全体的な構造と電子機器は同じままでした。このシステムは、単層構造と多層構造を良好な形状忠実度でプリントすることができましたが、それでも2つの主要な問題がありました:二重Z軸は後続の層の構築にいくつかの問題を引き起こし、自動ホーミングエラーは実験の再現性に問題を引き起こしました。この作業では、1つのZモーターだけで滅菌可能な構造を作成することにより、これらの制限を克服するための完全にカスタムメイドのシステムを構築する手順を提供します。この新しいシステムバージョンは、既存の電子機器をベースにしていますが、全体の構造は主に3Dプリントされた部品で構成されています。プリンターを構築する際には、2つの主要な重要な基本ステップがあります:1つは、X軸とY軸で正しく動くようにベルトを適切に張力をかけること、もう1つは、各印刷前にシステムを適切にキャリブレーションすることです。Zスライダーは薄くて平らな表面であり、速度が速すぎると上下に動くときに振動する可能性があるため、Zスライダーに問題がある可能性もあります。この問題を克服するための追加の機能は、基板を硬化させるために金属バーを追加することです。

また、初期のゲル化が細胞との再懸濁やバイオプリンティングプロセスに影響を与える可能性があるため、SBMeの操作も重要なステップです。マトリックスの感温性挙動と複雑なレオロジー特性、およびマトリックスに直接埋め込まれたオルガノイドまたはスモールセルクランプの印刷に容積押出バイオプリンターを使用することにより、提供されたプロトコルに従うことが基本的に重要です。実際、マトリックスは4°Cで液体であり、6°Cを超えるとゲル化し始めるため、取り扱いプロセス¹⁵には特に注意が必要です。このため、文献で一般的に使用されているプロトコルでは、最初のマトリックスと2番目の細胞懸濁液の2つのステップで播種することが推奨されています。これは主に、特に細胞凝集体を扱う際の沈降によるものです。私たちのプロトコルを使用して、代わりに1つのステップでシーディングを実行する可能性を実証し、大きなコンストラクトの作成も可能にしました。したがって、マトリックスの熱感受性により、プロトコールを成功させるためには、最終ステップまでの全プロセスで常に4°Cに維持することが非常に重要です。温度が急激に変化すると、ゲル化してプロセスが中断します。特に、シリンジの充填中に不要な架橋を避けることが基本です。これは、気泡の正しい除去を妨げる可能性があるためです。

長鎖細胞培養アッセイを扱う際のもう一つの重要な側面は、経時的な生物学的マトリックスの安定性と、コンストラクトの形状保持に影響を与える可能性のある水性環境での膨潤です。文献では、SBMeの膨潤の根本的なメカニズムは不明ですが、他のECMコンポーネントの3Dマトリックスがかなりの量の浸透圧膨潤を示しています^24,25。これは通常、溶液のイオン濃度、生体マトリックスのタンパク質濃度、および製造プロセスに依存します。場合によっては、SBMeは最大40%の重量増加を示しています²⁶。生物学的な手がかりと機械的特性がオルガノイドの組み立てと成長に影響を与える可能性があるため、効果的な実験条件で膨潤挙動をテストしました。得られた結果は、分解を開始する前に初期重量の最大4%の増加を伴う水性媒体での大きな膨潤を示さなかった。

劣化に関しては、SBMeの組成と架橋密度の不均一性により、予測不可能性が発生する可能性があります。膨潤だけでなく、劣化についても深く調査されていないため、特定のコンストラクトをテストして、長期的な耐久性を確認しました。この結果は、2週間にわたる構造安定性を強調しており、試験終了時の劣化率の75%を占めています。全体として、提供されるシステムおよびプロトコールは、薬物スクリーニング実験および疾患モデリング実験に非常に有利であり、したがって、他のハイドロゲルと混合することなく安定したSBMeコンストラクトを作製することができる。この戦略は、同軸バイオプリンティングのような共培養実験にも有望です。

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

この研究は、Cancer Research UKとFondazione AIRC(n° 22790)のパートナーシップを通じて資金提供されたAccelerator Award n° A26815「Single-cell cancer evolution in the clinic」、および欧州連合-次世代EU、ミッション4、コンポーネント1、CUP D53D23003310006によって部分的に資金提供されました。