Progettazione e validazione di una biostampante ad estrusione volumetrica per la biostampa di estratto solubile di membrana basale per la ricerca traslazionale

Gli estratti solubili della membrana basale sono le matrici biologiche più utilizzate nella ricerca sul cancro, ma il loro complesso comportamento reologico rende difficile la loro biostampa con i sistemi di bioprinting disponibili in commercio. Questo lavoro presenta una strategia di bioprinting personalizzata per produrre costrutti di matrici pure con una buona fedeltà di forma sia in strati singoli che multipli.

Nella ricerca traslazionale, i modelli 3D in vitro sono essenziali per far progredire la comprensione scientifica e lo sviluppo terapeutico. A questo scopo, gli estratti solubili di membrana basale (SBMes), derivati da cellule di sarcoma di topo, svolgono il ruolo chiave di replicare le caratteristiche meccaniche e biochimiche del microambiente in vivo . Sono particolarmente preziosi in una varietà di campi di ricerca, dall'ingegneria tissutale ai test sui farmaci. In particolare, sono diventate fondamentali nella ricerca sul cancro in quanto le tradizionali colture cellulari 2D, ampiamente utilizzate nel campo, possono fornire informazioni fuorvianti poiché non catturano la struttura tridimensionale (3D) e il microambiente tumorale.

Nella ricerca sul cancro, modelli 3D in vitro efficaci sono fondamentali per comprendere meglio l'evoluzione del cancro e anticipare le sfide, come i meccanismi di resistenza ai farmaci. Gli organoidi sono emersi come promettenti modelli 3D in vitro , che offrono una rappresentazione più accurata della biologia dei tumori. Crescono in SBMes poiché creano un ambiente in cui le cellule possono crescere e auto-organizzarsi in strutture 3D. Tuttavia, l'SBMe presenta sfide significative, tra cui basse proprietà meccaniche e comportamento reologico complesso, che ne impediscono l'uso con i sistemi di bioprinting per estrusione pneumatica disponibili in commercio.

Per ovviare a queste limitazioni, abbiamo sviluppato un sistema di bioprinting a basso costo e a controllo volumetrico e un protocollo specifico per la stampa di strutture con SBMe. Questo sistema si basa su un estrusore volumetrico e supera i limiti dei tradizionali approcci ad azionamento pneumatico. Una volta assemblato e programmato con uno specifico g-code, il sistema può biostampare sia SBMe puro che diluito per ottenere costrutti sia monostrato che multistrato. Questo approccio offre un metodo più affidabile e scalabile per la produzione di modelli 3D di colture cellulari, aprendo la strada a una ricerca più efficace su nuovi trattamenti e test farmacologici.

Nella ricerca traslazionale, la creazione di modelli 3D in vitro che replichino fedelmente l'ambiente in vivo è essenziale per far progredire la comprensione scientifica e lo sviluppo terapeutico¹. Un componente chiave nella loro costruzione è l'uso di analoghi della matrice extracellulare (ECM), come gli estratti solubili della membrana basale (SBMes), che riflettono meglio la complessità dei tessuti naturali. Le SBMe sono particolarmente preziose in una varietà di campi di ricerca, dall'ingegneria tissutale ai test sui farmaci ^2,3. In particolare, sono diventati fondamentali nella ricerca sul cancro, in quanto replicano le caratteristiche meccaniche e biochimiche del microambiente tumorale, consentendo lo sviluppo di modelli che riflettono meglio la crescita tumorale, le metastasi e le risposte al trattamento.

Infatti, nonostante i notevoli progressi compiuti negli ultimi decenni, molte terapie continuano a fallire, portando a frequenti fallimenti del trattamento in ambito clinico. Questo fallimento è spesso attribuito a meccanismi di resistenza ai farmaci causati da alti livelli di eterogeneità cellulare ^4,5. Modelli in vitro efficaci, in grado di ricapitolare accuratamente la complessità dei tumori umani, sono fondamentali per comprendere meglio l'evoluzione del cancro e anticipare questo fenomeno.

Le tradizionali colture cellulari 2D sono state fondamentali nella ricerca sul cancro, ma possono portare a informazioni fuorvianti sull'efficacia dei farmaci e sul comportamento del tumore, poiché non riescono a catturare la struttura 3D e il microambiente dei tumori reali ^6,7,8. Al contrario, i modelli 3D in vitro sono emersi come alternative promettenti, offrendo una rappresentazione più accurata del microambiente tumorale e del comportamento biologico imitando la complessità 3D ^9,10.

Nella ricerca sul cancro, gli organoidi sono ampiamente utilizzati come modelli 3D per lo studio della malattia e dell'efficacia dei farmaci, poiché forniscono modelli più accurati e pertinenti di tessuti e organi umani. L'uso di SBMe, derivato dalle cellule del sarcoma di topo di Engelbreth-Holm-Swarm, è stato fondamentale per far progredire la ricerca sul cancro^11,12. Fornisce un substrato gelatinoso in cui le cellule possono crescere, proliferare e auto-organizzarsi in strutture di organoidi, garantendo un corretto sviluppo e crescita^13,14.

Tuttavia, la SBMe pone una serie di sfide a causa delle sue caratteristiche uniche e complesse. Essendo un fluido non newtoniano, l'SBMe presenta proprietà di assottigliamento al taglio, il che significa che la sua viscosità diminuisce con l'aumentare dello sforzo di taglio, rendendo la sua manipolazione e applicazione incoerenti sotto forze variabili. Inoltre, il suo comportamento tissotropico aumenta la complessità, in quanto può recuperare la sua viscosità nel tempo quando lo stress di taglio viene rimosso^15,16. Queste proprietà, insieme alla bassa resistenza meccanica (con valori del modulo di stoccaggio che vanno da 10 Pa a 5.000 Pa a seconda della concentrazione proteica) e al comportamento termosensibile, peggiorano queste sfide, richiedendo un controllo meticoloso durante la preparazione e l'uso, nonché la biostampa pura.

I sistemi standard di bioprinting ad azionamento pneumatico non riescono a controllare correttamente l'erogazione di SBMe poiché l'applicazione della pressione provoca un comportamento incontrollabile dopo la sua espulsione dalla siringa. Essa è affetta da un fenomeno simile all'"effetto spurt" descritto per i fusi polimerici, in cui la portata aumenta bruscamente al di sopra di un certo valore critico di pressione 17,18,19. Come riportato nel nostro precedente lavoro¹⁶, la strategia di erogazione a controllo volumetrico consente di disaccoppiare l'estrusione SBMe dalla pressione generata nel dosatore, che dipende dalle proprietà reologiche della matrice, dalle condizioni di lavoro e dalla geometria dell'ugello. Negli ultimi anni, sul mercato sono stati fatti diversi tentativi di sfruttare lo stesso principio, con Matribot di Corning in testa. Consente la manipolazione e la deposizione di SBMe e altri bioink sensibili alla temperatura grazie a condizioni di temperatura controllata. Tuttavia, potrebbe essere costoso, limitando l'accessibilità per i laboratori più piccoli.

Nel nostro articolo precedente, abbiamo presentato un'alternativa personalizzata a basso costo: un sistema di bioprinting volumetrico¹⁶. Questa versione era basata su una stampante 3D entry-level modificata con un estrusore stampato in 3D personalizzato. Nonostante la sua efficacia nel bioprinting, presentava alcune limitazioni nella ripetibilità della stampa. Essendo derivato da una stampante 3D entry-level, aveva alcuni problemi con i movimenti Z e l'auto-homing. Per rispondere a queste esigenze, abbiamo sviluppato una versione avanzata del nostro sistema di dosaggio volumetrico personalizzato a basso costo e un protocollo specifico per le strutture di bioprinting che utilizzano SBMe.

Qui, forniamo protocolli per la costruzione e l'uso di questo sistema. È composto da un estrusore volumetrico personalizzato, basato sul nostro precedente studio¹⁶, una custodia per bioprinter e un sistema di controllo. La produzione e l'assemblaggio vengono effettuati per ogni modulo. Se assemblato e programmato con un file gcode specifico, seguendo la descrizione del protocollo per la gestione delle matrici, il sistema è in grado di biostampare costrutti puri o diluiti utilizzando l'SBMe con una buona fedeltà di forma sia in strati singoli che multipli.

1. 3D stampa e assemblaggio di bioprinter volumetrici

1. Prepara e stampa in 3D i componenti della biostampante.
   1. Scarica il file *. File di progettazione STL dal file supplementare 1.
   2. Carico*. STL nel software proprietario di slicing per definire l'orientamento dei pezzi sulla lastra di stampa e tutte le opzioni necessarie per la stampante 3D. Stampa i pezzi utilizzando acido polilattico (PLA) con opzioni di media qualità (dimensione ugello 0,4 mm, diametro filamento 1,75 mm, temperatura estrusore 220 °C, temperatura piastra di stampa 50 °C, altezza strato 0,2 mm, velocità di stampa 300 mm/s).
      NOTA: Le opzioni di qualità media possono variare a seconda della stampante utilizzata per la stampa dei pezzi.
   3. Staccare i pezzi stampati dal piano della stampante 3D. Rimuovere le strutture di supporto stampate, se presenti, e lucidare le superfici dove necessario.
2. Assemblare l'estrusore (Figura 1).
   1. Inserire due cuscinetti lineari a sfere (LM4UU) nei fori verticali del blocco spintore. Inserire anche un dado per vite T8 nel foro centrale posteriore e fissarlo con quattro viti (M3x10).
   2. Fissare un giunto rigido dell'albero al motore passo-passo e quindi fissarlo all'alloggiamento del motore dell'estrusore utilizzando quattro viti (M3x6).
      NOTA: Orientare il motore passo-passo in base alla scanalatura nell'alloggiamento del motore dell'estrusore per consentire il corretto posizionamento del jack per i cavi.
   3. Fissare il motore passo-passo, montato al punto 1.2.2, ad una vite T8 (150 mm) utilizzando il giunto rigido dell'albero precedentemente inserito. Assicurarsi che ogni blocco sia fissato correttamente con le viti di fermo.
   4. Fissare un cuscinetto a flangia autoallineante (diametro interno 8 mm) nella parte inferiore della base dell'estrusore con due viti (M4x8).
   5. Inserire due cuscinetti a sfera (4 x 9 x 4 mm) negli appositi fori sulla parte superiore della base dell'estrusore e gli altri due nei fori della sezione inferiore.
   6. Inserire la parte assemblata (passaggio 1.2.1) nella base dell'estrusore attraverso la cavità nella parte superiore della struttura. Collegare i quattro cuscinetti a sfera (passaggio 1.2.5) con due aste da 4 mm, una per lato. Far passare le aste attraverso i due cuscinetti lineari a sfere nella parte assemblata al punto 1.2.1.
      NOTA: E' anche possibile inserire prima le barre sui due cuscinetti a sfera superiori e poi inserirle nella base dell'estrusore fino a raggiungere il cuscinetto a sfere inferiore e il tutto è fissato nelle fessure definite.
   7. Inserire la parte assemblata al punto 1.2.3 nel foro centrale della base dell'estrusore. Ruotare la vite di comando per far passare il dado della vite di comando e raggiungere il cuscinetto della flangia autoallineante. Utilizzare le viti di fermo nel componente per bloccare la vite di comando e due viti (M3x8) per fissare l'alloggiamento del motore dell'estrusore sulla parte superiore della base dell'estrusore.
   8. Utilizzare altre due viti (M3x40) e dadi M3 per fissare il fermo della flangia del cilindro della siringa alla parte inferiore della base dell'estrusore, per bloccare la flangia del cilindro della siringa (direzione di inserimento dall'alto verso il basso). Utilizzare altre due viti (M3x30) e dadi M3 per fissare il fermo del pistone della siringa ai fori superiori del blocco di spinta (direzione di inserimento dal basso verso l'alto) per bloccare la flangia dello stantuffo.
   9. Inserire due viti (M4x80) in due molle e farle passare attraverso i fori presenti nella parte inferiore della base dell'estrusore e del blocco siringa. Avvitare i dadi lasciando lo spazio per la siringa per evitare che il blocco siringa scivoli.
      NOTA: Le viti devono andare da dietro in avanti.
3. Assemblare l'asse X (Figura 2).
   1. Inserire quattro cuscinetti a sfere lineari (LM8UU x 24 mm) nel X_Left_Block e X_Right_Block parti nei fori superiore e inferiore, due per ciascuno. Fissare anche due blocchi della cintura sopra i blocchi X destro e X sinistro con le viti (M2x10) lasciando spazio per la cintura.
   2. Inserire due cuscinetti a sfera (5 x 16 x 5 mm) nei fori centrali di X_Right_Block, uno per lato. Posizionare una puleggia (foro 5 mm) nella cavità interna del X_Right_Block e collegare i due cuscinetti a sfera con un'asta da 5 mm (lunghezza 35 mm), facendola passare attraverso la puleggia.
      NOTA: Utilizzare un'asta più lunga per il montaggio per avere una migliore maneggevolezza. Dopo aver posizionato i pezzi in posizione, tagliare l'asta della lunghezza desiderata.
   3. Fissare un finecorsa al X_motor_housing con due viti (M3x8). Inserire il motore NEMA 17 nell'alloggiamento del motore e utilizzare quattro viti (M3x8) per fissare il coperchio del X_block_1 all'alloggiamento del motore e al motore.
   4. Fissare una puleggia (foro 5 mm) al motore e bloccarla con viti di fermo, quindi avvitare la parte assemblata al punto da 1.3.3 a X_block_1 con quattro viti (M5x8). Fissare anche un finecorsa nella parte inferiore del X_Left_Block con due viti (M3x8).
      NOTA: Il diametro esterno delle pulegge nei passaggi 1.3.2 e 1.3.4 deve essere lo stesso.
   5. Posizionare due cuscinetti a sfere lineari (LM8UU x 45 mm) nei fori nella parte superiore e inferiore del X_slider.
   6. Collegare le parti assemblate nei passaggi 1.3.2 e 1.3.4 con due aste da 8 mm (lunghezza 200 mm) e farle passare attraverso la parte assemblata nel passaggio 1.3.5.
      NOTA: Tagliare le aste della lunghezza desiderata prima del montaggio.
   7. Bloccare un'estremità della cinghia al X_slider_belt_connection utilizzando il blocco della cinghia e due viti (M2x8). Far passare la cinghia attorno alla puleggia nella parte assemblata 1.3.4, quindi attorno alla puleggia nella parte assemblata 1.3.2 e fissare l'altra estremità della cinghia al collegamento X_slider_belt utilizzando il secondo blocco cinghia e altre due viti (M2x8). Assicurarsi che la cintura sia ben tesa per ottenere il movimento corretto.
      NOTA: Durante questa fase, il X_slider deve essere spostato verso un'estremità della struttura dell'asse X per evitare interferenze.
   8. Avvitare la X_slider_belt_connection al X_slider con una vite (M6x20).
   9. Collegare l'estrusore al X_slider e fissarlo con quattro viti (M5x10).
4. Assemblare l'asse Y (Figura 3).
   1. Posizionare la staffa di fissaggio sulla parte posteriore della bioprinter utilizzando quattro viti (M3x10) e quattro dadi.
      NOTA: La posizione della staffa di fissaggio può essere adattata per ottenere la corretta tensione della cinghia e consentire l'inserimento del motore passo-passo.
   2. Inserire il motore passo-passo nella staffa di fissaggio e avvitarlo con quattro viti (M3x8). Quindi, posizionare una puleggia (foro 5 mm) sull'albero motore e fissarla con le viti di fermo.
      NOTA: La puleggia può essere fissata all'albero motore prima di inserire il motore nella staffa di fissaggio per evitare interferenze tra i componenti.
   3. Posizionare due pulegge (diametro interno 8 mm) sull'asta anteriore da 8 mm e bloccarle sulle due aste (a 2,5 cm dall'estremità). Ripetere questa operazione per l'asta posteriore e aggiungere un'altra puleggia, a 5 cm di distanza dall'estremità destra.
   4. Fissare 12 cuscinetti a flangia autoallineanti (diametro 8 mm) alle parti superiori interne della biostampante.
   5. Collegare le due parti anteriori della bioprinter e le due parti posteriori della bioprinter (direzione sinistra/destra) utilizzando le aste assemblate al punto 1.4.3 e bloccarle ai cuscinetti della flangia autoallineante (diametro 8 mm). Fissare le due parti assemblate a tutte le giunzioni con le viti (M3x8).
      NOTA: Quando si posiziona l'asta posteriore, posizionare una cinghia chiusa che collega la puleggia sul motore passo-passo con la puleggia interna sull'asta.
      NOTA: Fissare il motore passo-passo serrando i dadi per garantire l'assenza di movimento del motore e la corretta tensione della cinghia.
   6. Collegare le due parti assemblate al punto 1.4.5 utilizzando quattro aste da 8 mm. Far passare le aste attraverso i cuscinetti lineari a sfere presenti nella parte assemblata 1.3 e bloccarle ai cuscinetti a flangia autoallineanti (diametro 8 mm). Fissare le due parti assemblate a tutte le giunzioni con le viti (M3x8).
   7. Fissare un'estremità della cinghia aperta sulla parte superiore del X_block_1 utilizzando il blocco della cinghia e ripetere questa operazione per la X_block_2. Far passare la cinghia attorno alle pulegge posteriori a sinistra, quindi attorno alla puleggia anteriore e fissare nuovamente l'altra estremità della cinghia alla X_block_1 con un altro blocco cinghia. Ripetere questa operazione per la seconda cinghia.
      NOTA: Le cinghie devono essere adeguatamente tese per ottenere il movimento corretto e della stessa lunghezza per evitare piegamenti o interferenze nei movimenti Y.
5. Assemblare l'asse Z (Figura 4).
   1. Avvitare insieme le parti inferiori della custodia della biostampante (M4x8).
   2. Fissare un cuscinetto a flangia autoallineante (diametro 8 mm) al pavimento della parte inferiore della parte assemblata al passaggio 1.5.2.
   3. Fissare con viti due cuscinetti lineari a sfere flangiati (LMH8UU) ai fori esterni presenti nel Z_slider e una madrevite nel foro centrale (M3x8).
   4. Fissare un finecorsa al lato sinistro Z_plane con due viti (M3x8).
   5. Fissare il motore passo-passo a un giunto rigido dell'albero. Fissare un motore passo-passo al Z_block con quattro viti (M3x20) e un'asta filettata al giunto rigido dell'albero. Assicurarsi che ogni blocco sia fissato correttamente con le viti di fermo.
   6. Collegare la parte assemblata al punto 1.5.5 alla base della biostampante utilizzando due aste da 8 mm. Lasciarli passare attraverso la parte assemblata al punto 1.5.3.
   7. Fissare la Z_block al pannello posteriore utilizzando due viti (M5x8).
   8. Collegare Z_plane a Z_slider utilizzando quattro viti (M3x25). Inseriteli nei fori di Z_plane dall'alto verso il basso, passate la molla tra Z_plane e Z_slider e fissateli con i dadi. Regolare la tensione della molla per livellare il piano.
   9. Fissare quattro piedini regolabili sotto la struttura della biostampante nell'apposita cavità. Livellare la bioprinter regolando i piedini.
   10. Collegare la parte assemblata alla parte assemblata al punto 1.4.6 con otto viti (M4x12).
   11. Fissare con le viti due cerniere sulla parte frontale della struttura nelle apposite sedi e un magnete sulla parte destra nell'apposito punto (M2x8). Avvitare l'intera struttura a lastre di plexiglass trasparente da 2 mm per chiudere le aperture.
       NOTA: Avvitare il pannello frontale in plexiglass alle cerniere e inserire un'altra vite in corrispondenza del magnete per ottenere una porta anteriore.
6. Visualizzare l'assieme (Figura 5A).
   1. Far passare i cavi, collegati al display, attraverso il foro inferiore e fissare il display all'alloggiamento del display con quattro viti (M3x3).
      NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito senza il coperchio della manopola LCD. Potrebbe essere posizionato sulla manopola preinstallata dopo il fissaggio all'alloggiamento del display.
   2. Chiudere l'alloggiamento con il coperchio utilizzando quattro viti (M2x6).
   3. Inserisci la scheda SD nello slot sinistro.
   4. Lascia che i fili passino attraverso il foro sulla parte superiore della struttura. Avvitare la parte assemblata nella parte superiore del bioprinter con due viti (M3x8).
      NOTA: Tutti i cavi (motori, finecorsa e display) scorreranno vicino al muro e usciranno dal foro in basso a sinistra. Sono fissati con fermacavi per evitare interferenze con le parti meccaniche.
7. Assemblaggio dell'elettronica (Figura 5B)
   1. Fissare la presa alla parte esterna della custodia elettronica con due viti (M3x10).
   2. Fissare la scheda madre alla parte interna del case elettronico con quattro viti (M3x10).
   3. Fissare la parte inferiore dell'alimentatore alla parte interna della custodia elettronica con quattro viti (M3x8).
   4. Passare i fili attraverso il foro circolare sul coperchio e collegarli alla scheda madre. Chiudere la custodia elettronica con il suo coperchio utilizzando quattro viti (M3x10).
      NOTA: E' possibile collegare la custodia dell'elettronica alla struttura della biostampante o lasciarla sulla scrivania in caso di spazi di lavoro ridotti.
      La Figura 6 mostra tutti i collegamenti dei cavi elettronici. Possono essere leggermente diversi a seconda della scheda madre della stampante 3D in uso.

2. Impostazione del software e processo di generazione del gcode

1. Preparazione delle impostazioni del software di slicing
   1. Aprire il software di affettamento.
      NOTA: Le istruzioni possono variare a seconda del software utilizzato o della versione.
   2. Accedi alla piattaforma.
   3. Vai alle opzioni Impostazioni . Selezionare la stampante, quindi Aggiungi una stampante non in rete. Seleziona la stampante FFF personalizzata e nella casella Nome stampante, digita il nome della stampante. Fare clic su Aggiungi.
      NOTA: Se si tratta della prima installazione del software, il pannello Aggiungi stampante si aprirà automaticamente dopo l'accesso.
   4. Nella finestra Impostazioni macchina , modificare le impostazioni predefinite x, y, z a 176, 120, 45 mm.
   5. Deselezionare l'opzione Letto riscaldato se non è già deselezionata.
   6. Inserire nei pannelli G-code iniziale e G-code finale le righe di testo riportate nei file intitolati 'JoVE_Starting_G-code.txt' e 'JoVE_Ending_G-code.txt' nel File supplementare 2.
      1. Modificare il valore 150 nella riga 'M92 E150' nel file g-code iniziale in base alla portata da applicare. Stimare il valore corretto utilizzando la seguente formula:
         
         Dove Q è la portata desiderata [μL/min].
         NOTA: Questa formula è stata ottenuta sperimentalmente con il sistema descritto. Potrebbe essere diverso se ci sono modifiche ai componenti meccanici o elettrici. Una possibile alternativa potrebbe essere quella di fissare il valore in base al sistema in uso e creare un codice MATLAB personalizzato per generare il file gcode desiderato.
   7. Modificare il valore Diametro materiale compatibile nel pannello Estrusore 1 a 1,75 e quindi chiudere.
   8. Vai su Marketplace, seleziona il plug-in Z Offset Setting e installalo. Al termine del processo, riavvia il software per finalizzare. Una volta riaperto, seleziona Impostazioni | Stampante | Gestisci stampanti sulla barra degli strumenti. Nella finestra Preferenze , fai clic su Impostazioni e attiva tutte le opzioni selezionando l'opzione Controlla tutto e chiudila.
   9. Configurare la configurazione facendo clic su Impostazioni di stampa (terzo pulsante) nel menu stage , che contiene il pannello di configurazione . Immettere la percentuale di riempimento nel profilo di stampa corrente nel pannello di configurazione . Selezionare il pulsante Personalizzato per modificare le impostazioni di stampa correnti e il profilo Fine nel menu a discesa. Impostare la velocità di stampa su 10 mm/s.
2. Preparazione del gcode
   1. Scarica il file *. File di progettazione STL, intitolato 'JoVE_Square', dal file supplementare 2 di questo documento.
   2. Carico. STL nel software di slicing.
   3. Posiziona il pezzo sulla superficie piana e spostalo alle coordinate 65, 42,5, 0 (X, Y, Z) mm. Creare due copie facendo clic sul pulsante . Nome del file STL nell'elenco degli oggetti e selezionando l'opzione Moltiplica selezionati. Spostali alle seguenti coordinate: 16, 42,5, 0 mm e -33, 42,5, 0 mm (X, Y, Z).
      NOTA: Non è possibile definire automaticamente l'ordine di stampa a meno che non venga modificato manualmente direttamente nel file gcode finale. Le coordinate sono definite per una piastra a 6 pozzetti multipli.
   4. Vai alle Impostazioni di stampa nel menu stage . Nella sezione Muri , metti 0 come conteggio delle linee del muro. Metti 0 come valore di spessore superiore/inferiore nella sezione superiore/inferiore . Nel pannello Riempimento , inserire i seguenti valori: Motivo di riempimento: Griglia, Distanza linea di riempimento: 5 mm, Direzioni linea di riempimento: [0].
      NOTA: È possibile ridurre la velocità di traslazione nella sezione Velocità di stampa per migliorare la precisione dell'asse X.
   5. Disabilitare la retrazione nella sezione Corsa e il raffreddamento della stampa nella sezione Raffreddamento .
   6. Nella sezione Adesione piastra di stampa , selezionare Nessuno come Tipo di adesione piastra di stampa, mentre nella sezione Modalità speciali , selezionare l'opzione Uno alla volta come Sequenza di stampa.
   7. Fare clic sul pulsante Slice per generare il g-code.
   8. Apri il file g-code con l'applicazione Blocco note e rimuovi le righe "M104 S200", "M105" e "M109 S200" nella riga 12 dopo la frase "; Generato con Cura_SteamEngine 4.9.0".
   9. Aggiungere "G1 Z25" prima della riga successiva"; MAGLIA: JoVE_Square_rev. STL(6)" e dividere il successivo in due: (1) G0 F3600 X142.46 Y7.499 e (2) G1 Z0.3.
      NOTA: Le coordinate X e Y sono solo esempi.
   10. Modificare il valore Z in Z25 in ogni riga presente dopo "; TIME_ELAPSED" commenta ogni ultima istruzione di strato di ogni pezzo.
       NOTA: Per la stampa di un solo pezzo, il passaggio 2.3.10 non è necessario.

3. Test di rigonfiamento/degradazione

1. Fasi preparatorie
   1. Assumere una siringa di vetro sterile da 1 ml (terminale TLL) e un ugello conico sterile da 25 G. Assemblali e metti la siringa assemblata in frigorifero.
   2. Mettere i puntali delle pipette e la fiala della matrice SBMe in frigorifero per una notte il giorno prima dell'esperimento.
   3. Stampa tre griglie in PLA (Φ = 20 mm) con pori circolari di 1 mm x 1 mm e un pilastro verticale laterale per afferrarle.
2. Costrutti di stampa
   1. Prendere la siringa assemblata e il flaconcino della matrice SBMe dal frigorifero. Aspirare 500 μL della matrice SBMe e metterla nell'incubatore per 15 minuti per consentire la gelificazione.
   2. Prendere la siringa dall'incubatrice e inserirla nella testina di stampa del bioprinter. Assicurarsi che lo stantuffo della siringa sia correttamente a contatto con il blocco spintore.
   3. Fissare lo stantuffo di fissaggio della siringa e la flangia del cilindro della siringa con i fermi del pistone della siringa e il cilindro della siringa con il morsetto della siringa.
   4. Calibrare il sistema utilizzando l'impostazione Auto-home nel menu della biostampante per rilevare automaticamente l'origine degli assi.
   5. Spostare l'estrusore utilizzando il comando Sposta assi fino a quando la punta dell'ago tocca la griglia PLA per definire manualmente Z0.
   6. Avviare la stampa selezionando il file g-code da stampare nel menu della biostampante.
   7. Mettere la piastra multipozzetto nell'incubatore per 2 minuti per consentire all'SBMe di stabilizzarsi dopo l'estrusione.
   8. Prendere la piastra multipozzetto e inserire 2 mL di terreno di coltura cellulare nei tre pozzetti contenenti le griglie biostampate. Inserire la piastra multipozzetto nell'incubatore.
   9. Ad ogni punto temporale (t0, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 1, 3, 7, 10 e 14 giorni), prelevare ogni griglia dalla lastra e asciugarla con carta pulita per rimuovere l'eccesso di fluido e peso su una bilancia. Rimetti la griglia nella piastra e poi nell'incubatrice per continuare l'esperimento. Stimare il rapporto di rigonfiamento e il tasso di degradazione utilizzando le seguenti formule:
      
      Dove W_t è il peso dei costrutti in ogni punto temporale e W_t0 il peso dei costrutti essiccati.
      
      Dove W_i è il peso alla fine della prova di rigonfiamento.

4. Bioprinting di costrutti SBMe

1. Fasi preparatorie
   1. Prendere una siringa di vetro sterile da 1 ml (terminale TLL) e un ugello conico sterile da 25 G e assemblarli sotto la cappa di biosicurezza. Mettili in una scatola sterile in frigorifero.
   2. Mettere i puntali della pipetta e il flaconcino della matrice SBMe in frigorifero per una notte (4 °C con ghiaccio) il giorno prima dell'esperimento.
   3. Aggiungere 20 μl di blu di tripano in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
   4. Impostare la centrifuga a 345 × g, 4 °C e lasciarla raffreddare (~3-4 h).
   5. Assumere 5 mL di acqua in una provetta da centrifuga da 15 mL come bilancia per la centrifuga.
   6. Soluzione tampone fosfato calda (PBS) e terreno a bagnomaria.
      NOTA: Il terreno di coltura cellulare è costituito da un terreno di Eagle's modificato con Dulbecco (DMEM) completo integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), penicillina-streptomicina e L-glutammina.
   7. Posizionare il bioprinter sotto la cabina di sicurezza biologica. Sterilizzare sotto luce UV per 20 min.
      NOTA: Per garantire il corretto funzionamento della biostampante, eseguire la funzione Auto-home e verificare i movimenti corretti di ciascun asse e il funzionamento dei finecorsa.
2. Preparazione Bioink
   1. Prendi il pallone nell'incubatrice contenente cellule di cancro alla prostata murino in commercio e mettilo sotto la cabina di biosicurezza.
   2. Estrarre il terreno di coltura cellulare dal pallone.
      NOTA: I volumi riportati in questo protocollo si applicano ai matracci per colture cellulari T25.
   3. Lavare le cellule una volta con 2 ml di PBS e poi aspirarle.
   4. Aggiungere 500 μl di tripsina e mettere il pallone nell'incubatore per 5 minuti per consentire il distacco delle cellule dalla piastra.
   5. Controllare la tripsinizzazione delle celle e, se necessario, picchiettare delicatamente il fondo del pallone.
   6. Aggiungere 4,5 ml di terreno al pallone. Lavare accuratamente la piastra per assicurarsi che tutte le cellule staccate galleggino nel terreno di coltura cellulare.
   7. Aspirare il terreno e aggiungerlo a una provetta da centrifuga da 15 mL.
   8. Prelevare un'aliquota da 20 μL e mescolarla con l'aliquota del blu di tripano. Quindi, mettere 10 μl di questa miscela nella camera di conteggio delle cellule per contare le cellule vive utilizzando la seguente formula:
      
      dove f è il fattore di diluizione per la sospensione di blu di tripano (rapporto 1:1); V è il volume di sospensione cellulare [mL].
   9. Centrifugare la sospensione cellulare rimanente per 5 minuti (345 × g, 4 °C).
   10. Rimuovere il surnatante e risospendere nella matrice SBMe fredda alla densità cellulare desiderata (10,⁶ cellule/mL)
   11. Aspirare 800 μl della sospensione della matrice contenente le cellule con la siringa fredda.
   12. Rimuovere le bolle d'aria che potrebbero essere intrappolate nella siringa e metterla in una scatola sterile. Quindi, metterlo nell'incubatrice per 15 minuti per consentire la gelificazione.
3. Processo di bioprinting
   1. Prendere la siringa dall'incubatrice e inserirla nella testina di stampa del bioprinter. Assicurarsi che lo stantuffo della siringa sia correttamente a contatto con il blocco spintore.
      NOTA: Il modello e il volume devono essere gli stessi della siringa utilizzata per l'esperimento.
   2. Fissare lo stantuffo di fissaggio della siringa e la flangia del cilindro della siringa con i fermi del pistone della siringa e il cilindro della siringa con il morsetto della siringa.
   3. Utilizzare i dadi M4 nella parte inferiore dell'estrusore per regolare la pressione della molla e bloccare la siringa in posizione.
      NOTA: I passaggi da 4.3.1 a 4.3.4 sono mostrati nella Figura 7.
   4. Calibrare il sistema utilizzando l'impostazione Auto-home nel menu della biostampante per rilevare automaticamente l'origine degli assi.
      NOTA: Questo passaggio garantisce sempre le corrette impostazioni iniziali indipendentemente dal tipo di supporto che utilizziamo per la stampa.
   5. Posizionare una piastra a 6 pozzetti sul piano di stampa.
   6. Spostare l'estrusore utilizzando il comando Sposta assi fino a quando la punta dell'ago tocca il fondo del pozzetto per definire manualmente Z0.
   7. Seleziona il file gcode nell'opzione di menu del menu bioprinter e avvia la stampa. In ogni pozzetto verrà stampata una griglia quadrata a sei strati (lato 2,6 cm).
   8. Dopo il processo di bioprinting, utilizzare un microscopio invertito per assicurarsi che il processo di stampa sia andato a buon fine e mettere la piastra multipozzetto nell'incubatore per 2 minuti per consentire all'SBMe di stabilizzarsi dopo l'estrusione.
   9. Mettere 2 mL di terreno di coltura cellulare in ciascun pozzetto.
      NOTA: Il volume deve coprire completamente i costrutti.

In questo articolo, presentiamo un protocollo per i costrutti di bioprinting realizzati in SBMe utilizzando una biostampante volumetrica a basso costo, personalizzata e personalizzata. Forniamo una descrizione dettagliata e la stampa 3D*. STL per costruire il sistema e dimostriamo il suo potenziale utilizzo nella ricerca sul cancro stampando strutture a strato singolo e multistrato. Ogni componente stampato in 3D è stato adeguatamente pulito dalla struttura di supporto o dai residui di stampa indesiderati prima dell'assemblaggio. La Figura 8 mostra diverse viste dell'assieme complessivo. Ci sono due diverse opzioni: (A) con pezzi separati per avere la possibilità di ridurre l'ingombro all'interno della cabina di sicurezza biologica o (B) con il blocco elettronico direttamente attaccato alla struttura per avere un sistema più compatto.

Lo scopo di questo sistema di bioprinting volumetrico e del protocollo presentato è quello di presentare una strategia alternativa per costrutti di bioprinting con SBMe¹⁶ puro. Grazie a questo metodo, siamo in grado di ottenere strutture autoportanti con una buona fedeltà di forma. La Figura 9 e la Figura 10 illustrano esempi di ottimizzazione del processo di stampa utilizzando il sistema descritto. Come mostrato, l'accuratezza di stampa deve sempre essere valutata per stabilire i parametri di stampa ottimali. Per definire le impostazioni ottimali per questo protocollo, sono state studiate diverse velocità di flusso (da 43,34 ± 5,77 μL/min a 116,69 ± 5,77 μL/min) e velocità di stampa (da 5 a 20 mm/s). L'omogeneità della deposizione delle fibre, il rapporto di diffusione e la deviazione standard sono parametri chiave nella valutazione. Poiché la SBMe è una miscela di ECM di derivazione naturale derivata da cellule tumorali di topo, soffre di variazioni da lotto a lotto; Pertanto, potrebbe essere necessario adattare questi parametri alle proprietà del batch in uso.

Con parametri ottimali definiti (portata di 86,68 μl/min, velocità di stampa di 10 mm/s), è possibile utilizzare il sistema attuale per creare strutture più complesse. La Figura 10 mostra i risultati rappresentativi delle due possibilità: (A) strutture a strato singolo con diverse dimensioni dei pori e (B) strutture a sei strati con forme diverse. Inoltre, lo stress di taglio, un parametro critico nella biologia cellulare, influisce sulla vitalità cellulare, sulla segnalazione cellulare e sull'espressione proteica ed è correlato a molteplici parametri, come la portata, la forma dell'ugello, il diametro e la viscosità del fluido.

Anche il comportamento di rigonfiamento/degradazione è un parametro chiave quando si ha a che fare con colture cellulari lunghe. Per raggiungere l'obiettivo dell'articolo, il comportamento di rigonfiamento delle matrici biologiche è stato valutato nell'arco di 4 ore e il peso rimane stabile nel tempo. Dal punto temporale iniziale, la SBMe ha mostrato un leggero aumento intorno al peso iniziale del 4% massimo dopo 3 ore (Figura 11A). Gli studi di degradazione sono stati condotti per 2 settimane. I costrutti SBMe hanno mantenuto quasi il 60% del loro peso iniziale dopo 7 giorni, mentre hanno mostrato una riduzione progressiva durante la seconda settimana raggiungendo circa il 75% del tasso di degradazione (Figura 11B).

Abbiamo anche dimostrato la fattibilità di questo sistema e protocollo per la biostampa SBMe facendo un confronto tra la vitalità cellulare in costrutti biostampati in 3D e tre gocce di matrice da 100 μL come controlli, generate con pipettaggio manuale. Come riportato nella Figura 12, la percentuale di cellule vive nelle strutture biostampate in 3D era superiore all'80%, che è paragonabile ai valori di controllo.

Figura 1: Immagine di assemblaggio per l'estrusore della bioprinter 3D. Questa figura mostra i principali (A) pezzi stampati in 3D e (C) i componenti commerciali necessari per l'assemblaggio dell'estrusore, mentre (B) mostra la sua vista assemblata. (D) Questa immagine riporta tutti i passaggi principali per l'intera procedura. Le frecce blu indicano la direzione di inserimento, mentre i cerchi rossi evidenziano le viti e/o i componenti principali in passaggi specifici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagine di assemblaggio per l'estrusore dell'asse X. Questa figura mostra i principali (A) pezzi stampati in 3D e (C) i componenti commerciali necessari per l'assemblaggio dell'asse X, mentre (B) mostra la sua vista assemblata. (D) Questa immagine riporta tutti i passaggi principali per l'intera procedura. Le frecce blu indicano la direzione di inserimento, mentre i cerchi rossi evidenziano le viti e/o i componenti principali in passaggi specifici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagine dell'assemblaggio per l'estrusore dell'asse Y. Questa figura mostra i principali (A) pezzi stampati in 3D e (C) i componenti commerciali necessari per l'assemblaggio dell'asse Y, mentre (B) mostra la vista assemblata. (D) Questa immagine riporta tutti i passaggi principali per l'intera procedura. Le frecce blu indicano la direzione di inserimento, mentre i cerchi rossi evidenziano le viti e/o i componenti principali in passaggi specifici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immagine di assemblaggio per l'estrusore dell'asse Z. Questa figura mostra i principali (A) pezzi stampati in 3D e (C) i componenti commerciali necessari per l'assemblaggio dell'asse Z, mentre (B) mostra la sua vista assemblata. (D) Questa immagine riporta tutti i passaggi principali per l'intera procedura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagine di assemblaggio dell'elettronica. Questa figura mostra i passaggi principali per l'assemblaggio di (A) il display e (B) la custodia elettronica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Schemi di cablaggio. Questa immagine illustra i collegamenti dei cavi con tutti i componenti. L'alimentatore è collegato sia alla presa CA che alla scheda madre. Quest'ultimo si collega a tutti i dispositivi periferici, all'unità LCD e all'alimentatore. I cerchi colorati (blu, rosso, verde e nero) sulla scheda madre, evidenziati da quadrati blu sul lato destro dell'immagine, identificano il cablaggio del motore passo-passo. Ogni colore indica il rispettivo cavo colorato per ogni motore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Posizionamento della siringa. I passaggi principali per posizionare e bloccare la siringa alla base dell'estrusore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Assemblaggio del sistema. Questa immagine riporta diverse viste dell'intero sistema. Vengono presentate due opzioni: (A) con o (B) senza il blocco elettronico attaccato alla struttura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Valutazione della stampabilità su serpentine. Questa figura mostra le immagini e i grafici relativi alla valutazione della stampabilità. Nel pannello superiore (A), l'omogeneità delle fibre e il rapporto di diffusione sono stati studiati all'aumentare delle portate. Nel pannello inferiore (B), questi parametri sono stati studiati all'aumentare della velocità di stampa. Barra della scala = 1 cm. Questa cifra è stata modificata da De Stefano et ^al.16. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Valutazione della stampabilità su griglie monostrato e multistrato. Le immagini rappresentative sono riportate nel pannello (A), che cambia la dimensione dei pori, per le strutture a strato singolo, e nel pannello (B) per i costrutti a sei strati con forme diverse. Questa cifra è stata modificata da De Stefano et ^al.16. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11: Test di rigonfiamento e degradazione dei costrutti. (A) Rapporto di rigonfiamento dei costrutti biostampati nel tempo, rappresentato come l'aumento relativo della massa (%) nel terreno di coltura cellulare. (B) Profilo di degrado, indicato come percentuale di massa residua (%) nel tempo. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 12: Valutazione della vitalità cellulare. Questa figura mostra immagini ottiche prelevate da (A, C) un campione di controllo e (B, D) un costrutto SBMe biostampato. Le immagini nel pannello superiore sono state acquisite con un ingrandimento di 10x (barra della scala = 400 μm), mentre quelle nel pannello inferiore a 20x (barra della scala = 100 μm). (E) Confronto della vitalità cellulare. Questa cifra è stata modificata da De Stefano et ^al.16. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: *. File STL per la struttura esterna, gli assi X/Y/Z, l'estrusore, il display e l'alloggiamento dell'elettronica. I nomi dei file di ogni *. STL corrispondono a quelli riportati nelle figure. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: file di preparazione gcode. *.txt file contenenti i file g-code iniziali e finali richiesti e un file *. File STL di un esempio di parallelepipedo rettangolare CAD, il cui riempimento può essere regolato utilizzando un software di slicing per creare una griglia. Clicca qui per scaricare questo file.

Nella ricerca traslazionale, le SBMe sono particolarmente preziose in una varietà di campi di ricerca, dall'ingegneria tissutale ai test farmacologici ^2,3. In particolare, sono diventati fondamentali nella ricerca sul cancro, in quanto replicano le caratteristiche meccaniche e biochimiche del microambiente tumorale, consentendo lo sviluppo di modelli che riflettono meglio la crescita tumorale, le metastasi e le risposte al trattamento. SBMe è la matrice biologica più utilizzata, in particolare per gli organoidi 3D^13,14. Come ECM naturale derivata dal sarcoma del topo Engelbreth-Holm Swarm, ha una composizione peculiare di collagene di tipo IV, laminina, entattina e perlecan. Questi componenti possono essere trovati in molti tessuti normali, consentendo così alla SBMe di assomigliare meglio alle complesse membrane basali. La SBMe consente l'auto-organizzazione cellulare in strutture che imitano da vicino le caratteristiche del tessuto in vivo ¹⁴. Tuttavia, è caratterizzato da un comportamento reologico complesso e da basse proprietà meccaniche e non può essere stampato con sistemi di erogazione pneumatici standard in quanto verrebbe espulso dalla cartuccia con un comportamento incontrollabile¹⁶. Per questo motivo, è difficilmente biostampato puro e viene spesso miscelato con altri idrogel 13,20,21,22 (anche se possono introdurre ulteriori variabilità), oppure viene biostampato in chip microfluidici per ottenere un supporto meccanico²³.

Nel nostro lavoro precedente, abbiamo proposto una strategia modificata per biostampare costrutti realizzati con SBMe pura utilizzando il dosaggio volumetrico¹⁶. Il sistema originale era una stampante 3D disponibile in commercio con un estrusore modificato. Nello specifico, quella originale è stata sostituita da una pompa a siringa realizzata su misura, mentre la struttura complessiva e l'elettronica sono rimaste le stesse. Questo sistema era in grado di stampare strutture monostrato e multistrato con una buona fedeltà di forma, ma presentava ancora due problemi principali: i doppi assi Z, che causavano alcuni problemi nella costruzione degli strati successivi, e gli errori di auto-homing, che creavano problemi di ripetibilità sperimentale. In questo lavoro, forniamo istruzioni per costruire un sistema completamente su misura per superare queste limitazioni creando una struttura sterilizzabile con un solo motore Z. Questa nuova versione del sistema si basa ancora sull'elettronica preesistente, mentre la struttura complessiva è composta principalmente da parti stampate in 3D. Ci sono due passaggi fondamentali fondamentali nella costruzione della stampante: uno è quello di tendere correttamente le cinghie per ottenere il corretto movimento sugli assi X e Y, e il secondo è quello di calibrare adeguatamente il sistema prima di ogni stampa. Potrebbero esserci anche alcuni problemi con il cursore Z in quanto è una superficie sottile e piatta e potrebbe vibrare mentre si muove su e giù se la velocità è troppo alta. Un'ulteriore caratteristica per ovviare al problema potrebbe essere l'aggiunta di una barra metallica per irrigidire il substrato.

Un passaggio cruciale è anche la manipolazione di SBMe, poiché la gelificazione precoce può influenzare la risospensione con le cellule e il processo di bioprinting. A causa del comportamento termosensibile e delle complesse proprietà reologiche della matrice, insieme all'utilizzo della biostampante volumetrica-estrusiva, per la stampa di organoidi o pinze a piccole celle direttamente incorporate nella matrice, è di fondamentale importanza seguire il protocollo fornito. Infatti, la matrice è liquida a 4 °C e inizia a gelificare al di sopra dei 6 °C, quindi richiede particolare attenzione nel processo di manipolazione¹⁵. Per questo motivo, i protocolli comunemente utilizzati in letteratura suggeriscono la semina nelle due fasi successive: prima matrice e seconda, sospensione cellulare. Ciò è dovuto principalmente alla sedimentazione, soprattutto quando si tratta di aggregati cellulari. Utilizzando il nostro protocollo, abbiamo invece dimostrato la possibilità di eseguire il seeding in un unico passaggio, permettendo anche la creazione di costrutti di grandi dimensioni. Pertanto, a causa della natura termosensibile della matrice, per la buona riuscita del protocollo, è molto importante mantenerla sempre a 4 °C durante l'intero processo fino alle fasi finali. Qualsiasi brusco cambiamento di temperatura ne provoca la gelificazione e l'interruzione del processo. In particolare, è fondamentale evitare reticolazione indesiderata durante il riempimento della siringa perché ciò potrebbe ostacolare la corretta rimozione delle bolle d'aria.

Un altro aspetto importante quando si ha a che fare con lunghi saggi di coltura cellulare è la stabilità della matrice biologica nel tempo e il possibile rigonfiamento in ambienti acquosi che può influenzare la ritenzione della forma dei costrutti. In letteratura, il meccanismo alla base del rigonfiamento nella SBMe è sconosciuto, anche se le matrici 3D di altri componenti della MEC hanno mostrato una quantità significativa di rigonfiamento osmotico^24,25. Di solito dipende dalla concentrazione ionica della soluzione, nonché dalla concentrazione proteica della matrice biologica e dal processo di fabbricazione. In alcuni casi, la SBMe ha mostrato un aumento di peso fino al 40%²⁶. Poiché i segnali biologici e le proprietà meccaniche possono influenzare l'assemblaggio e la crescita degli organoidi, abbiamo testato il comportamento del rigonfiamento nelle condizioni sperimentali efficaci. I risultati ottenuti non mostrano rigonfiamenti significativi in mezzi acquosi con un aumento massimo del 4% del suo peso iniziale prima di iniziare la degradazione.

Per quanto riguarda la degradazione, le eterogeneità SBMe nella composizione e nella densità dei legami incrociati possono causare una certa imprevedibilità. Oltre al rigonfiamento, anche la degradazione non viene studiata in profondità, quindi abbiamo testato i nostri costrutti specifici per garantirne la durata a lungo termine. I risultati sottolineano la loro stabilità strutturale nell'arco di 2 settimane, pari al 75% del tasso di degradazione alla fine del test. Nel complesso, il sistema e il protocollo fornito possono essere molto vantaggiosi sia per gli esperimenti di screening farmacologico che per gli esperimenti di modellazione delle malattie, consentendo così la produzione di costrutti SBMe stabili senza la necessità di miscelare con altri idrogel. Questa strategia potrebbe essere promettente anche per esperimenti di co-coltura, come il bioprinting coassiale.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dall'Accelerator Award n° A26815 dal titolo: "Single-cell cancer evolution in the clinic" finanziato attraverso una partnership tra Cancer Research UK e Fondazione AIRC (n° 22790) e dall'Unione Europea - Next Generation EU, Mission 4, Component 1, CUP D53D23003310006.