溶媒を利用したフレーバーエバポレーション濃縮に基づくお茶の香り分析

ここでは、溶媒支援フレーバー蒸発と溶媒抽出、それに続くガスクロマトグラフィー-質量分析を使用して茶抽出物の揮発性成分を濃縮および分析する方法を示し、あらゆる種類の茶サンプルに適用できます。

お茶の香りはお茶の品質にとって重要な要素ですが、お茶抽出物の揮発性成分の複雑さ、低濃度、多様性、および不安定性のために分析が困難です。この研究では、溶媒支援フレーバー蒸発(SAFE)と溶媒抽出とそれに続くガスクロマトグラフィー-質量分析(GC-MS)を使用して、臭気保存を使用して茶抽出物の揮発性成分を取得および分析する方法を紹介します。SAFEは、不揮発性干渉なしに複雑な食品マトリックスから揮発性化合物を分離できる高真空蒸留技術です。この記事では、茶の注入調製、溶媒抽出、SAFE蒸留、抽出濃度、GC-MSによる分析など、茶の香り分析の完全なステップバイステップの手順を紹介します。この手順を2つの茶サンプル(緑茶と紅茶)に適用し、茶サンプルの揮発性組成に関する定性的および定量的結果が得られました。この方法は、各種茶試料の香り分析だけでなく、分子感覚研究にも活用できます。

お茶は世界中の多くの人々に好まれる飲み物です^1,2。お茶の香りは、茶葉の品質基準であると同時に価格決定要因でもあります^3,4。したがって、お茶の香り組成と含有量の分析は、分子感覚研究とお茶の品質管理にとって非常に重要です。その結果、香気組成分析は近年の茶類研究において重要な課題となっている⁵、^6、7。

お茶の香気成分の含有量は、一般的に茶葉の乾燥重量の0.01%〜0.05%しか占めていないため、非常に低くなっています⁸。さらに、試料マトリックス中の多量の不揮発成分は、ガス^{クロマトグラフィー9、10}による分析を著しく妨げる。したがって、茶中の揮発性化合物を単離するには、サンプル調製手順が不可欠です。分離および濃縮法の重要な考慮事項は、マトリックスの干渉を最小限に抑えると同時に、サンプルの元の臭気プロファイルの保存を最大化することです。

もともとEngel、Bahr、およびSchieberleによって開発された溶媒支援フレーバー蒸発(SAFE)は、複雑な食品マトリックスから揮発性化合物を分離するために使用される改良された高真空蒸留技術です^11,12。高真空ポンプ(5 x ^10-3 Paの標準動作圧力下)に接続されたコンパクトなガラスアセンブリは、溶媒抽出物、油性食品、および水性サンプルから揮発性化合物を効率的に収集できます。

この記事では、SAFE技術と溶媒抽出を組み合わせて紅茶注入から揮発性物質を分離し、その後GC-MSを使用して分析する方法について説明しました。

1.内部標準の準備とお茶の注入

1. 原液:パラキシレン-D10( 材料表参照)10.0 mgを無水エタノール10.0 mLに溶解し、内部標準物質の1,000 ppm原液を調製します。
2. 作業溶液:原液1 mL(ステップ1.1)を純水で100 mLに希釈し、内部標準の10 ppm作業溶液を調製します。
   注:作業溶液は、分析と同じ日に調製する必要があります。
3. 茶葉3 g(緑茶と紅茶の両方、 材料表を参照)を三角フラスコに入れ、150 mLの沸騰水を加えます。フラスコをガラス栓で覆います。
4. 5分後、300メッシュのふるいを通してお茶の注入をすばやくろ過します。
5. 使用済みの茶葉を30mLの水で2回洗い、洗浄液とお茶の注入液を混ぜ合わせます。
6. お茶の注入液を氷水浴で素早く室温まで冷却します。
7. 1.00 mLの作業溶液(ステップ1.2)をお茶の注入液に加え、よく混ぜます。

2.SAFEによる茶注入の蒸留と留出物の液液抽出

1. 以下の手順に従ってSAFEアセンブリを準備します。
   1. SAFEアセンブリを取り付け(図1)、左下の蒸留ボトル(図1[3])と右下の収集ボトル(図1[4])を接続します。SAFEガラスアセンブリの背面にある循環水管を接続します。コールドトラップを取り付け(図1[5])、ガラスアセンブリの右上にある真空ポンプ(材料表を参照)にチューブを接続します。
      注意: 循環水管の接続を確認してください。入口が上部に入り、出口が下部から出ることを確認します。循環に脱イオン水を使用して、スケールがSAFEアセンブリの白いチューブを塞ぐのを防ぎ、循環水の循環が悪くなり、最終的にSAFEアセンブリが爆発するのを防ぎます。蒸留塔(図1[3])は、サンプルの蒸発を促進するために攪拌バーで攪拌することができます。
   2. 循環水の温度を50°Cに、サンプルフラスコ用ウォーターバスの温度を40°Cに設定する。 真空バルブを閉じます(図1[2])。
2. 真空ポンプの操作を行います。
   1. 真空ポンプの電源を入れます。
   2. 徐々に速度を上げて最高速度100%にします。
      注意: 速度が100%に達しない場合は、システムが気密であるかどうか、およびシステム内に溶剤の残留物がないかどうかを確認してください。
   3. 高真空(好ましくは10^〜3Pa )に達した後
      注意: 液体窒素をコールドトラップに追加すると、真空が改善されます。
3. サンプル蒸留を行います。
   1. 水の循環を開始します。
   2. コールドトラップに液体窒素を加えて、収集ボトルの外側を覆います。
   3. 左上のサンプル漏斗にお茶の注入を注ぎ(図1[1])、ガラス栓で覆います。
   4. サンプルを蒸留フラスコに滴下します。真空が約^10-3 Paの適切な範囲に保たれるようにサンプルドロップ速度を制御します。
      注意: プロセス中に液体窒素を追加して、適切な収集ボトルが常に液体窒素に沈むようにします。コールドトラップでの凝縮液の形成を避けるようにしてください。
4. 蒸留が完了したら、真空ポンプをオフにします。
   1. 電源スイッチを押します。「STOP」が点滅したら、Enterキーを押して確認します。
   2. 分子ポンプの速度が「0」に低下したら、電源コードを抜いてください。
      注意: 速度が「0」に低下した場合にのみ再起動してください。
5. システムを大気圧に戻します。
   1. サンプリングボトルの上にある研削プラグを取り外します。
   2. 真空バルブのノブをゆっくりと緩めて、システムを大気圧に戻します。
6. サンプルの入った収集ボトルを降ろします。
   1. システムを大気圧に回復した後、収集ボトルの外側の液体窒素を取り除きます。
   2. 収集ボトルのネジをゆっくりと緩めます。サンプルの入った収集ボトルを慎重に降ろします。
   3. 循環水を閉じます。
7. SAFE留出物の液液抽出を行います。
   1. ボトル内のSAFE留出物を室温まで温めます。
   2. SAFE留出物を50 mLのジクロロメタンで3回抽出します( 材料の表を参照)。
   3. ジクロロメタン層を結合します。抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させる( 材料表参照)。
      注:溶媒中の無水硫酸ナトリウムは、セメントで固められなくなり、自由に流れることができるときに十分に乾燥していると見なされます。
   4. 穏やかな窒素流を使用して抽出物を約2 mLに濃縮します。
   5. 1〜2 mLのサンプルバイアルに移し、穏やかな窒素気流を使用してさらに200 μLに濃縮します。

3. GC-MS分析とデータ処理

1. プロトコルセクション2で調製したアロマ濃縮物を、溶融シリカキャピラリーカラムを備えたGC-MSシステム(図2)を使用して分析します( 材料表を参照)。
2. キャリアガスとして線速40cm/sのヘリウムを使用します。
3. 3 μLの濃縮液をスプリットレス注入モードで注入します。
4. GCオーブンの温度プログラムを設定します:(1)40°Cで5分間保持します。(2)5°C /分で200°Cに上昇します。(3)10°C /分で280°Cに上昇します。(4)280°Cで10分間保持します。
5. 質量選択検出器をポジティブEIモード¹³ で動作させ、質量スキャン範囲は70eVで30m/zから350m/zです。
6. 自動マススペクトルデコンボリューションおよび同定システム(AMDIS、 材料表を参照)を使用してGC-MSデータをデコンボリューションします。
7. NIST(米国国立標準技術研究所)17質量分析計^{検索プログラム3}を使用して、デコンボリューション後のデータを照合および認定します。
8. 同じGC条件下でn−アルカン(C5−C25、材料表参照)のセットの結果に基づいて化合物¹⁴の保持指数を計算する。
9. NIST質量分析ライブラリと保持指数の同時マッチングに基づいて保持指数データベースを使用してGCピークを特定します。
10. TIC(トータルイオンクロマトグラフィー)ピーク面積を使用して、内部標準に対するSAFEサンプル中の各揮発性成分の濃度を計算します。
11. お茶の注入準備から始めて、分析を3回繰り返します。

上記の分析手順は、紅茶および緑茶サンプルの香り分析の例を使用してこのセクションで説明されています。

代表的なGC-MSクロマトグラムを図3に示します。図3Aはn-アルカンの集合を示し、図3Bは内部標準のプロファイルを示す。緑茶及び紅茶サンプルからの抽出物についての評価結果をそれぞれ図3C及び図3Dに示す。内部標準を分析することにより、安定したベースラインを持つ1つの決定的なピークを検出できます(図3B)。GCクロマトグラムは、総イオンカウント後に緑茶および紅茶注入抽出物から得られた完全なGCプロファイルを示しています。

緑茶および紅茶のサンプルから合計104のアロマ化合物が、保持指数と組み合わせた質量分析マッチングによって同定されました。相対定量は、内部標準に対する化合物のピーク面積により算出した。定性的および定量的結果に従って描かれたヒートマップは、緑茶および紅茶サンプルの内部標準に対する香気化合物含有量を示しています(図4)。

図1:SAFEシステムの概略図 。 (1)サンプル収集用のサンプルボトル。(2)真空バルブ;サンプルを追加する前にシステムを閉じたままにし、サンプルのドロップフローを適切に調整する必要があります。(3)試料蒸留用の蒸留瓶。(4)蒸留試料の採取用の採取瓶。(5)収集ボトルで収集されなかったサンプルを回収し、溶媒が真空ポンプに入るのを防ぐためのコールドトラップ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:GC-MSDシステムの概略図。GC/MSシステムには、(1)マルチモード注入ポート、(2)ヘリウムキャリアフローを制御するフロー制御モジュール(PCM)、(3)60 m x 0.25 m x 0.25 m 5 msキャピラリーカラム、(4)GCカラムオーブンが装備されています。注入されたサンプル中の茶抽出物はGCカラムで分離され、そこを通ってキャリアガスが流れ、オーブン温度が上昇します。成分はEIイオン源によってイオン化され、質量分析器で分析されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:成功したGC-MS分析からの典型的なトータルイオンクロマトグラム 。 (a)n-アルカンのクロマトグラム。すべてのn-アルカンピークは、対応する炭素数に割り当てられています。(b)内部標準物質(パラキシレン-d10)のクロマトグラム。(C)緑茶注入の代表的なアロマプロファイル。(D)紅茶注入の代表的なアロマプロファイル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:紅茶(BT)および緑茶(GT)サンプルで同定された104のアロマ化合物のヒートマップ。 ヒートマップの右側にあるカラーノートの横にある数字は、化合物の含有量を示しています(内部標準に対する相対値)。色深度は、物質含有量のレベルを示します。色が濃いほど、相対的な含有量は高くなります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

この記事では、SAFEおよびGC-MS分析を使用してお茶の注入中の揮発性化合物を効率的に分析する方法について説明します。

茶の注入は、不揮発性成分を多く含む複雑なマトリックスを持っています。茶の注入から揮発性成分を単離するためのいくつかの方法が文献に記載されている。一般的な方法は同時蒸留抽出(SDE)^です15,16。しかし、茶葉は蒸留/抽出プロセス全体で水で煮沸する必要があり、その結果、茶成分が化学反応を起こし、元のサンプルとは非常に異なる匂いプロファイルが得られるため、茶の香りの分析には適していません¹⁷。SAFEは、高真空下で低温でお茶の注入を蒸留するため、分析対象物の変化を最小限に抑え、元の香り組成を維持することができます。

固相マイクロ抽出(SPME)は、茶の香り分析に一般的に使用される別の方法である^18、19。その利点は、シンプルで無溶剤の手順にあります。しかしながら、香気成分の繊維吸着の選択性は、試料の香気特性を反映した定量的プロファイルを得ることを困難にし、茶香気分析のためのこの方法の適用を制限する²⁰。

高真空転写(HVT)技術は、アロマ分析でアーチファクトが形成される可能性を減らすために開発されました²¹。しかし、HVTは沸点が高く極性の強い物質の抽出収率が低く、使用範囲が限られています。

上記のカスタム方法とは異なり、茶注入のSAFE留出物は、いかなる不揮発性成分も含まない²²、^23、24。留出物中の香気は有機溶媒を用いて定量的に抽出できるため、元のサンプルに近い臭気プロファイルの抽出物を得ることができます。Engelら¹¹は、効率を確認するためにHVTまたはSAFE蒸留を使用してn-アルカンの混合物を蒸留しました。SAFEシステムを使用した留出物収率は、各アルカンのHVTよりも有意に高いことがわかりました。さらに、沸点が285°C未満のアルカンは、SAFEによって完全に回収することができました。

分析をさらに成功させるには、実験の詳細に細心の注意を払う必要があります。(1)SAFE蒸留中の真空圧は、揮発性成分の回収に影響を与える可能性があり、サンプル添加を遅くするなどして、高レベルに維持する必要があります。(2)右上のコールドトラップで溶媒の揮発分が凝縮したり、真空ポンプに入ったりしないように、システムが大気圧に戻る前に回収ボトルを液体窒素に浸す必要があります。(3)循環水が最初にオンになり、最後にオフになるようにする必要があります。循環水は、液体窒素を除去した後にのみオフにする必要があります。そうしないと、デバイスがフリーズします。(4)熱伝達を助けるために、水浴を磁石で攪拌する必要があります。

本研究では、溶媒抽出の前にSAFE蒸留を行った。逆の手順も実行可能であり、これは、大量の茶注入が最初に抽出され、次に得られた抽出物がSAFEによって蒸留される場合に特に有利であろう。有機溶媒を用いた注入抽出の課題は、エマルジョンの形成の可能性である。この場合、有機層を回収するために、遠心分離や異なる溶媒の選択など、追加のステップが必要です。実験後、SAFEガラスアセンブリを清掃する必要があります。エタノールまたはアセトンを洗浄溶媒として使用することができる。部品は使用前に乾燥させる必要があります。

要約すると、このプロトコルは、SAFE蒸留とそれに続く溶媒抽出を使用して、元の茶サンプルに近い臭気プロファイルを有するアロマ濃縮物を得る方法を提案します。この方法は、例えばインスタント茶粉末および濃縮茶を含むあらゆる種類の茶試料に適用することができ、茶の分子感覚研究によく適している。

著者は開示するものは何もありません。

この研究は、中国国家自然科学財団(32002094、32102444)、MOFおよびMARAの中国農業研究システム(CARS-19)、および中国農業科学院イノベーションプロジェクト(CAAS-ASTIP-TRI)の支援を受けました。