ניתוח ארומת תה המבוסס על העשרת אידוי טעמים בסיוע ממס

מוצגת כאן שיטה להעשרה וניתוח המרכיבים הנדיפים של תמציות תה באמצעות אידוי טעמים בסיוע ממס ומיצוי ממס ולאחר מכן ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית גז, שניתן ליישם על כל סוגי דגימות התה.

ארומת תה היא גורם חשוב באיכות התה, אך קשה לנתח אותה בגלל המורכבות, הריכוז הנמוך, הגיוון והחיוניות של המרכיבים הנדיפים של תמצית התה. מחקר זה מציג שיטה להשגה וניתוח של המרכיבים הנדיפים של תמצית תה עם שימור ריחות באמצעות אידוי טעמים בסיוע ממס (SAFE) ומיצוי ממס ואחריו ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה של גז (GC-MS). SAFE היא טכניקת זיקוק בוואקום גבוה שיכולה לבודד תרכובות נדיפות ממטריצות מזון מורכבות ללא כל הפרעה בלתי נדיפה. במאמר זה מוצג הליך מלא שלב אחר שלב לניתוח ארומת תה, כולל הכנת חליטת תה, מיצוי ממס, זיקוק SAFE, ריכוז תמצית וניתוח על ידי GC-MS. הליך זה הוחל על שתי דגימות תה (תה ירוק ותה שחור), והתקבלו תוצאות איכותיות וכמותיות על ההרכב הנדיף של דגימות התה. שיטה זו יכולה לשמש לא רק לניתוח ארומה של סוגים שונים של דגימות תה, אלא גם למחקרים חושיים מולקולריים עליהם.

תה הוא משקה מועדף על אנשים רבים בכל רחבי העולם ^1,2. הארומה של התה היא קריטריון איכות, כמו גם גורם קביעת מחיר עבור עלי תה ^3,4. לפיכך, ניתוח הרכב הארומה ותכולת התה הוא בעל משמעות רבה למחקרים חושיים מולקולריים ולבקרת האיכות של התה. כתוצאה מכך, ניתוח הרכב ארומה היה נושא חשוב במחקר התה בשנים האחרונות ^5,6,7.

התוכן של רכיבי ארומה בתה הוא נמוך מאוד, כפי שהם בדרך כלל רק מהווים 0.01%-0.05% מהמשקל היבש של עלי תה⁸. יתר על כן, הכמות הגדולה של רכיבים בלתי נדיפים במטריצת הדגימה מפריעה באופן משמעותי לניתוח על ידי כרומטוגרפיית גז ^9,10. לכן, הליך הכנת מדגם חיוני כדי לבודד את התרכובות הנדיפות בתה. השיקול המרכזי בשיטת הבידוד וההעשרה הוא מזעור הפרעות המטריצה, ובמקביל מקסום שימור פרופיל הריח המקורי של הדגימה.

אידוי טעמים בסיוע ממס (SAFE), שפותח במקור על ידי אנגל, בר ושיברל, הוא טכניקת זיקוק משופרת בוואקום גבוה המשמשת לבידוד תרכובות נדיפות ממטריצות מזון מורכבות^11,12. מכלול זכוכית קומפקטי המחובר למשאבת ואקום גבוהה (בלחץ הפעלה אופייני של 5 x ^10-3 Pa) יכול לאסוף ביעילות תרכובות נדיפות מתמציות ממס, מזונות שומניים ודגימות מימיות.

מאמר זה תיאר שיטה המשלבת את טכניקת SAFE עם מיצוי ממס כדי לבודד חומרים נדיפים מעירוי תה שחור, ואחריו ניתוח באמצעות GC-MS.

1. הכנת התקן הפנימי ועירוי התה

1. תמיסת מלאי: יש להמיס 10.0 מ"ג של פרקסילן-d10 (ראה טבלת חומרים) ב-10.0 מ"ל אתנול נטול מים להכנת תמיסת מלאי של 1,000 חל"מ בתקן הפנימי.
2. פתרון עבודה: לדלל 1 מ"ל של תמיסת המלאי (שלב 1.1) ל 100 מ"ל עם מים טהורים כדי להכין פתרון עבודה של 10 ppm של התקן הפנימי.
   הערה: יש להכין את פתרון העבודה באותו יום של הניתוח.
3. הכניסו 3 גרם עלי תה (גם לתה ירוק וגם לתה שחור, ראו טבלת חומרים) בצלוחית ארלנמאייר והוסיפו 150 מ"ל מים רותחים. מכסים את הבקבוק בפקק זכוכית.
4. לאחר 5 דקות, סננו במהירות את חליטת התה דרך מסננת של 300 רשתות.
5. לשטוף את עלי תה בילה פעמיים עם 30 מ"ל של מים, ולשלב את פתרון לשטוף עם חליטת תה.
6. מצננים את חליטת התה לטמפרטורת החדר במהירות באמבט מי קרח.
7. הוסף 1.00 מ"ל של פתרון עבודה (שלב 1.2) לתוך עירוי תה, ומערבבים אותם היטב.

2. זיקוק עירוי התה על ידי SAFE ומיצוי נוזלי-נוזלי של התזקיק

1. הכן את מכלול SAFE לפי השלבים הבאים.
   1. התקן את מכלול SAFE (איור 1), וחבר את בקבוק הזיקוק בפינה השמאלית התחתונה (איור 1[3]) ואת בקבוק האיסוף בפינה הימנית התחתונה (איור 1[4]). חבר את צינור המים במחזור בחלק האחורי של מכלול זכוכית SAFE. התקינו את מלכודת הקור (איור 1[5]), וחברו את הצינור למשאבת הוואקום (ראו טבלת חומרים) בפינה הימנית העליונה של מכלול הזכוכית.
      הערה: בדוק את החיבור של צינור המים במחזור; ודא שהכניסה נכנסת למעלה והשקע יוצא מלמטה. השתמש במים שעברו דה-יוניזציה עבור הסירקולציה כדי למנוע מהסולם לחסום את הצינור הלבן במכלול SAFE, מה שיגרום לסירקולציה גרועה של המים הזורמים ולפיצוץ בסופו של דבר של מכלול SAFE. ניתן לערבב את תחתית הזיקוק (איור 1[3]) באמצעות מוט ערבוב כדי להקל על אידוי הדגימה.
   2. הגדר את הטמפרטורה של המים במחזור ל 50 ° C ואת זה של אמבט המים עבור בקבוק הדגימה ל 40 °C (75 °F). סגור את שסתום הוואקום (איור 1[2]).
2. בצע את פעולת משאבת הוואקום.
   1. הפעל את משאבת הוואקום.
   2. בהדרגה להגדיל את המהירות למהירות מקסימלית של 100%.
      הערה: אם המהירות אינה מגיעה ל-100%, בדוק אם המערכת אטומה ואם יש שאריות ממס בתוך המערכת.
   3. לאחר הגעה לוואקום גבוה (רצוי ^10-3 Pa)
      הערה: הוואקום ישתפר כאשר החנקן הנוזלי יתווסף למלכודת הקור.
3. בצע זיקוק דגימה.
   1. הפעל את זרימת המים.
   2. הוסיפו חנקן נוזלי למלכודת הקרה כדי לכסות את החלק החיצוני של בקבוק האיסוף.
   3. שפכו את חליטת התה לתוך משפך הדגימה בפינה השמאלית העליונה (איור 1[1]), ואז כסו אותה בפקק זכוכית.
   4. הכניסו את הדגימה לבקבוק הזיקוק טיפתית. שלוט במהירות נפילת הדגימה כך שהוואקום יישמר בטווח הנכון של סביב ^10-3 Pa.
      הערה: הוסף חנקן נוזלי במהלך התהליך כדי להבטיח שבקבוק האיסוף הנכון תמיד שקוע בחנקן נוזלי. נסו להימנע מהיווצרות עיבוי במלכודת הקרה.
4. כבו את משאבת הוואקום לאחר השלמת הזיקוק.
   1. לחץ על מתג ההפעלה . כאשר "STOP" מהבהב, הקש על מקש Enter כדי לאשר.
   2. נתק את כבל החשמל כאשר מהירות המשאבה המולקולרית יורדת ל- "0".
      הערה: הפעל מחדש רק כאשר המהירות יורדת ל- "0".
5. שחזור המערכת ללחץ אטמוספרי.
   1. הסירו את פקק הטחינה שמעל בקבוק הדגימה.
   2. פתח את הברגת הידית של שסתום הוואקום באיטיות כדי להחזיר את המערכת ללחץ אטמוספרי.
6. הורידו את בקבוק האיסוף עם הדגימה.
   1. הסר את החנקן הנוזלי מחוץ לבקבוק האיסוף לאחר החזרת המערכת ללחץ אטמוספרי.
   2. פתחו את בקבוק האיסוף באיטיות. הורידו את בקבוק האיסוף עם הדגימה בזהירות.
   3. סגור את המים הזורמים.
7. ביצוע מיצוי נוזלי-נוזלי של תזקיק SAFE.
   1. תנו לתזקיק SAFE בבקבוק להתחמם לטמפרטורת החדר.
   2. חלצו את התזקיק SAFE שלוש פעמים עם 50 מ"ל של דיכלורומתאן (ראו טבלת חומרים).
   3. ערבבו את שכבות הדיכלורומתאן. יבשו את התמצית עם נתרן גופרתי נטול מים (ראו טבלת חומרים).
      הערה: נתרן גופרתי נטול מים בממס נחשב יבש מספיק כאשר הוא כבר לא צמנטי ויכול לזרום בחופשיות.
   4. רכזים את התמצית לכ-2 מ"ל באמצעות זרם חנקן עדין.
   5. מעבירים לבקבוקון דגימה של 1-2 מ"ל, ומתרכזים עוד יותר ל-200 מיקרוליטר באמצעות זרם חנקן עדין.

3. ניתוח GC-MS ועיבוד נתונים

1. נתחו את תרכיזי הארומה שהוכנו בפרוטוקול סעיף 2 באמצעות מערכת GC-MS (איור 2) המצוידת בעמודי נימי סיליקה מאוחים (ראו טבלת חומרים).
2. השתמש בהליום כגז מוביל במהירות ליניארית של 40 ס"מ לשנייה.
3. יש להזריק 3 μL של התרכיז במצב הזרקה מפוצלת.
4. הגדר את תוכנית טמפרטורת תנור GC: (1) החזק ב- 40 ° C למשך 5 דקות; (2) להגדיל ל-200°C ב-5°C לדקה; (3) להגדיל ל-280°C ב-10°C/min; (4) להחזיק בטמפרטורה של 280°C למשך 10 דקות.
5. הפעל את גלאי סלקטיבי המסה במצב EI חיובי¹³ עם טווח סריקת מסה בין 30 m/z ל- 350 m/z ב- 70 eV.
6. נטרל את נתוני GC-MS באמצעות Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System (AMDIS, ראה טבלת חומרים).
7. התאם ואשר את הנתונים לאחר deconvolution באמצעות NIST (המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה) 17 תוכנית חיפוש ספקטרומטר מסה³.
8. חשב את מדד השמירה של תרכובות¹⁴ בהתבסס על התוצאה של קבוצה של n-אלקנים (C5-C25, ראה טבלת חומרים) באותם תנאי GC.
9. זהה את פסגות GC באמצעות ספריית ספקטרומטריית המסות של NIST ומסד הנתונים של אינדקס השמירה בהתבסס על התאמה בו זמנית של אינדקסי המסה והשמירה.
10. חשב את הריכוז של כל רכיב נדיף במדגם SAFE ביחס לתקן הפנימי באמצעות אזור השיא TIC (כרומטוגרפיית יונים כוללת).
11. חזור על הניתוח שלוש פעמים, החל הכנת חליטת תה.

ההליך האנליטי המתואר לעיל מומחש בסעיף זה באמצעות הדוגמה של ניתוח ארומה של דגימות תה שחור ותה ירוק.

כרומטוגרמה מייצגת של GC-MS מוצגת באיור 3. איור 3A מראה קבוצה של n-אלקנים, ואיור 3B מראה את הפרופיל של תקן פנימי. תוצאות ההערכה של התמציות מדגימות התה הירוק והתה השחור מוצגות באיור 3C ובאיור 3D, בהתאמה. על-ידי ניתוח התקנים הפנימיים, ניתן לזהות שיא סופי אחד עם קו בסיס יציב (איור 3B). כרומטוגרמה GC מראה את פרופילי GC המלאים המתקבלים מתמציות חליטת תה ירוק ותה שחור לאחר ספירת היונים הכוללת.

בסך הכל זוהו 104 תרכובות ארומה בדגימות התה הירוק והתה השחור על ידי התאמת ספקטרומטריית מסה בשילוב עם מדד השימור. הכימות היחסי חושב לפי שטח השיא של המתחם ביחס לתקן הפנימי. מפת החום, המשורטטת על פי התוצאות האיכותיות והכמותיות, מציגה את תכולת תרכובת הארומה ביחס לתקן הפנימי של דגימות התה הירוק והתה השחור (איור 4).

איור 1: תרשים סכמטי של מערכת SAFE. (1) בקבוק הדגימה לאוסף הדגימות. (2) שסתום הוואקום; יש לשמור על המערכת סגורה לפני הוספת דגימות, ולהתאים את זרימת הטיפה של הדגימה בהתאם. (3) בקבוק הזיקוק לזיקוק הדגימה. (4) בקבוק האיסוף לאיסוף הדגימה המזוקקת. (5) מלכודת הקור להשבת דגימות שלא נאספו על ידי בקבוק האיסוף ולמניעת כניסת הממס למשאבת הוואקום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דיאגרמה סכמטית של מערכת GC-MSD. מערכת GC/MS מצוידת (1) ביציאת הזרקה מרובת מצבים, (2) מודול בקרת זרימה (PCM) השולט בזרימת נשא ההליום, (3) עמוד נימי 60 מ' x 0.25 מ' x 0.25 מ' 5 אלפיות השנייה, ו-(4) תנור עמודים GC. תמציות התה בדגימה המוזרקת מופרדות בעמודת GC, דרכה זורם גז המוביל וטמפרטורת התנור עולה. הרכיבים מיוננים על ידי מקור יוני EI ולאחר מכן מנותחים במנתח מסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: כרומטוגרמה טיפוסית של יונים כוללים מניתוח מוצלח של GC-MS. (A) הכרומטוגרמה של n-אלקנים. כל פסגות n-alkane מוקצות למספר הפחמן המתאים. (B) הכרומטוגרמה של התקן הפנימי (פרקסילן-d10). (C) פרופיל ארומה מייצג של חליטת תה ירוק. (D) פרופיל ארומה מייצג של חליטת תה שחור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מפת חום של 104 תרכובות ארומה שזוהו בדגימות תה שחור (BT) ותה ירוק (GT). המספר ליד הערת הצבע בצד ימין של מפת החום מציין את תוכן המתחם (יחסית לתקן הפנימי). עומק הצבע מציין את רמת תכולת החומר; ככל שהצבע עמוק יותר, כך התוכן היחסי גבוה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מאמר זה מתאר שיטה יעילה לניתוח תרכובות נדיפות בחליטות תה באמצעות ניתוח SAFE ו- GC-MS.

חליטות תה יש מטריצה מורכבת עם תוכן גבוה של רכיבים לא נדיפים. מספר שיטות תוארו בספרות לבידוד המרכיבים הנדיפים חליטות תה. שיטה נפוצה היא מיצוי זיקוק סימולטני (SDE)^15,16. עם זאת, הוא אינו מתאים לניתוח ניחוחות תה מכיוון שיש להרתיח את עלי התה במים במשך כל תהליך הזיקוק/מיצוי, מה שגורם למרכיבי התה לעבור תגובה כימית ובכך מניב פרופיל ריח שונה מאוד מהמדגם המקורי¹⁷. SAFE מזקיק את חליטת התה בטמפרטורה נמוכה תחת ואקום גבוה, ובכך ממזער שינויים באנאליטים ומאפשר לשמר את הרכב הארומה המקורי.

מיקרו-מיצוי בשלב מוצק (SPME) היא שיטה נוספת הנפוצה לניתוח ארומה של תה^18,19. יתרונותיו טמונים בהליך הפשוט ונטול הממסים. עם זאת, הסלקטיביות של ספיחת הסיבים של רכיבי הארומה מקשה על קבלת פרופיל כמותי המשקף את מאפייני הארומה של המדגם, המגביל את היישום של שיטה זו לניתוח ארומה תה²⁰.

טכניקת העברת ואקום גבוהה (HVT) פותחה כדי להפחית את הסיכוי להיווצרות ממצאים בניתוחי ארומה²¹. עם זאת, HVT יש תפוקת מיצוי נמוכה עבור חומרים עם נקודות רתיחה גבוהות קוטביות חזקה, אשר מגביל את היקף השימוש בו.

שלא כמו בשיטות המותאמות אישית לעיל, תזקיק SAFE של חליטת תה אינו מכיל רכיבים בלתי נדיפים^22,23,24. את הארומה בתזקיק ניתן למצות באופן כמותי באמצעות ממיסים אורגניים, כלומר ניתן לקבל תמצית בעלת פרופיל ריח קרוב לדגימה המקורית. Engel et ^al.11 תערובות מזוקקות של n-alkanes באמצעות זיקוק HVT או SAFE כדי לבדוק את היעילות. תפוקת התזקיקים באמצעות מערכת SAFE נמצאה גבוהה משמעותית מזו של HVT עבור כל אלקנה. בנוסף, אלקנים עם נקודות רתיחה מתחת 285 °C יכול להיות התאושש לחלוטין על ידי SAFE.

יש להקדיש תשומת לב רבה לפרטי הניסוי לצורך ניתוחים מוצלחים נוספים. (1) לחץ הוואקום במהלך זיקוק SAFE יכול להשפיע על התאוששות הרכיבים הנדיפים ויש לשמור עליו ברמה גבוהה, למשל על ידי האטת תוספת הדגימה. (2) יש לוודא שבקבוק האיסוף שקוע בחנקן נוזלי לפני שהמערכת חוזרת ללחץ אטמוספרי, כדי למנוע מחומרים נדיפים של ממסים להתעבות על ידי מלכודת הקור הימנית העליונה או להיכנס למשאבת הוואקום. (3) יש לוודא שהמים הזורמים מופעלים ראשונים ונכבים אחרונים. יש לכבות את המים במחזור רק לאחר הסרת החנקן הנוזלי; אחרת, הוא יקפיא את המכשיר. (4) יש לערבב את אמבט המים במגנט כדי לסייע בהעברת החום.

במחקר זה, זיקוק SAFE בוצע לפני מיצוי הממס. הליך הפוך הוא גם אפשרי, וזה יהיה יתרון במיוחד אם כמות גדולה של חליטת תה מופק הראשון תמצית ולאחר מכן תמצית המתקבל מזוקק על ידי SAFE. האתגר של מיצוי עירוי באמצעות ממס אורגני הוא היווצרות אפשרית של תחליב. במקרה זה, נדרשים צעדים נוספים כדי לשחזר את השכבה האורגנית, כגון צנטריפוגה או בחירת ממיסים שונים. לאחר הניסוי יש לנקות את מכלול הזכוכית SAFE. אתנול או אצטון יכולים לשמש כממס ניקוי. יש לייבש את החלקים לפני השימוש.

לסיכום, פרוטוקול זה מציע שיטה לקבלת תרכיז ארומה עם פרופיל ריח קרוב לדגימת התה המקורית באמצעות זיקוק SAFE ואחריו מיצוי ממס. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל סוגי דגימות התה, כולל, למשל, אבקות תה נמס ותרכיזי תה, והיא מתאימה היטב למחקרים סנסוריים מולקולריים של תה.

למחברים אין מה לחשוף.

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32002094, 32102444), מערכת המחקר החקלאי של סין של MOF ו- MARA (CARS-19), ופרויקט החדשנות של האקדמיה הסינית למדעי החקלאות (CAAS-ASTIP-TRI).