ヒト卵胞の遺伝子発現解析

ここでは、凍結融解皮質組織からヒト卵巣卵胞を単離して遺伝子発現解析を行う方法を概説するプロトコルについて説明します。

卵巣は、異なる細胞型で構成される不均一な器官です。卵胞形成中に起こる分子機構を研究するために、タンパク質の局在化および遺伝子発現を固定組織上で行うことができる。しかし、ヒトの卵胞における遺伝子発現レベルを適切に評価するためには、この複雑で繊細な構造を分離する必要があります。したがって、ウッドラフの研究室によって以前に記述された適応プロトコルは、卵胞(卵母細胞および顆粒膜細胞)を周囲の環境から分離するために開発されました。卵巣皮質組織は、最初に手動で処理され、組織スライサーと組織チョッパーの2つのツールを使用して小さな断片が得られます。次に、組織を0.2%コラゲナーゼおよび0.02%DNaseで少なくとも40分間酵素消化します。この消化ステップは、37°Cおよび5%_CO2 で行われ、10分ごとに培地の機械的ピペッティングを伴う。インキュベーション後、単離された卵胞は、顕微鏡倍率下で較正されたマイクロキャピラリーピペットを使用して手動で収集されます。卵胞がまだ組織片に存在する場合、手順は手動の微小解剖で完了します。卵胞は培養液中の氷上で収集され、リン酸緩衝生理食塩水の液滴で2回すすがれます。この消化手順は、卵胞の劣化を避けるために慎重に管理する必要があります。卵胞の構造が損なわれているように見えるか、最大90分後に、10%ウシ胎児血清を含む4°Cブロッキング溶液で反応を停止します。リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)のためのRNA抽出後に適切な量の総RNAを得るために、最低20個の単離された卵胞(75μm未満のサイズ)を収集する必要があります。抽出後、20個の卵胞からの総RNAの定量は5 ng / μLの平均値に達します。次に、全RNAをcDNAにレトロ転写し、RT-qPCRを使用して目的の遺伝子をさらに分析します。

卵巣は、皮質内の卵胞および間質を含む機能的および構造的単位からなる複雑な器官である。卵胞形成は、卵胞の活性化、成長、および原始静止状態から受精し、初期の胚発生をサポートすることができる成熟卵胞への成熟までのプロセスであり、研究¹で広く研究されています。この現象を引き起こすメカニズムを解明することで、女性の不妊治療を改善する可能性があります²。固定されたヒト組織の分析により、卵巣の機能単位内のタンパク質発現と遺伝子局在の評価が可能になります^3,4。ただし、卵胞内の遺伝子発現レベルを正確に評価するには、卵胞を周囲の皮質から分離するための特定の技術が必要です。したがって、以前の研究では、卵巣^の機能単位から直接遺伝子発現を分析できるように卵胞分離技術が開発されました5。酵素消化および/または機械的単離、ならびにレーザー捕捉マイクロダイセクションなど、組織片内の卵胞の分離を可能にするさまざまなアプローチが開発されています⁶、^7、8、9。卵胞単離は、ヒトまたは動物の卵巣組織のいずれかで、発生のすべての段階で卵胞の遺伝子発現プロファイルを評価するために広く使用されています^10、11、12。ただし、最適な分離手順は、密な皮質内の卵胞の脆弱な構造を考慮に入れるべきであり、したがって、損傷を避けるために注意して実行する必要があります⁷。この原稿は、Woodruffの研究室によって記述されたプロトコルから適応された、遺伝子発現分析を実行するために凍結融解卵巣皮質からヒト卵胞を分離する手順を説明しています¹³。

凍結ヒト組織からの卵巣卵胞単離の最初のステップは解凍手順です。このプロセスは、前述のように、凍結保存された卵巣組織の移植に使用される臨床プロトコルに基づいて実行されます^14、15。このプロセスは、培地の濃度を下げて卵巣皮質をすすぐことにより、凍結保護剤を除去することを目的としています。次に、卵胞を回収するために酵素的および機械的単離の前に組織を断片化する。異なる段階の卵胞は、関心のあるものを分離するために、高倍率および高品質の光学系を備えた実体顕微鏡を使用して区別することができる。単離された各卵胞は、顕微鏡に統合された定規を使用して測定され、卵胞は、原始卵胞(30 μm)、一次卵胞(60 μm)、二次卵胞(120-200 μm)、および胞状卵胞(>200 μm)の発達段階に応じてプールできます¹⁶。卵胞の形態に従ってさらなる分類を行うことができます:原始卵胞は1層の平らな顆粒膜細胞(GC)を有し、一次卵胞は1層の直方体GCを有し、二次卵胞は少なくとも2層の直方体GCを有し、そしてGC間の空洞の存在は胞状段階を特徴付ける。目的の卵胞が選択されると、RNA抽出が行われます。RNAの量と質は、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)の前に評価されます(図1)。

このプロジェクトは、エラスメ病院倫理委員会(ベルギー、ブリュッセル)によって承認されました。このプロトコルに含まれる患者は、2000年に化学療法曝露前に生殖能力温存のための卵巣組織凍結保存(OTC)を受けました。患者は、保管期間の終わりに残りの凍結組織を研究に寄付するための書面による同意に署名しました。

1.凍結保存された卵巣組織の解凍

1. 5つの解凍液を含む6ウェルプレートを準備します。最初のウェルには、Leibovitz-15培地、0.1 mol/Lスクロース、1.5 mol/Lジメチルスルホキシド(DMSO)、および1%ヒト血清アルブミン(HSA)からなる5 mLの凍結保護剤溶液が含まれています。次のウェルには、凍結保護剤の濃度が低下した5 mLのLeibovitz-15培地が含まれています:1 mol / L、0.5 mol / L、および2 x 0 mol / L DMSO。
   注意: 凍結保護剤溶液は、不妊治療クリニックで使用されるプロトコルによって異なる場合があります。
2. 安全規則(極低温手袋、保護メガネ、閉じた靴)に従って液体窒素から卵巣皮質断片を含むバイアルを取り出し、チューブを室温(RT)で30秒間保ちます。
3. バイアルをRTで2分間、穏やかに攪拌しながらバイアルに浸してから、垂直フードの下でバイアルを開き、6ウェルプレートの最初のウェル(氷上)に直接移します。
4. フラグメントを6ウェルプレートの各ウェルに順次移し、それぞれに5 mLのLeibovitz-15培地中の凍結保護剤の濃度が低下します。各培地中の組織を5分間(氷上で)穏やかに攪拌する。

2.卵胞の分離

注:すべての実験は、RNaseフリーの材料を使用して、垂直フードの下で実施されます。

1. 解凍した組織を、10 mLの解剖培地(Leibovitz-15培地、ピルビン酸ナトリウム[2 mmol / L]、L-グルタミン[2 mmol / L]、HSA [0.3%]、ペニシリンG [30 μg / mL]、およびストレプトマイシン[50 μg / mL])で満たされた2 mmグリッドのペトリ皿に移します。必要に応じてメスで組織のサイズを調整します。
   注:臨床プロトコルに応じて、凍結組織のサイズは8 mm x 4 mm x 1 mmから4 mm x 2 mm x 1 mmまでさまざまです。このプロトコルでは、4 mm x 2 mm x 1 mmの2つのストリップが使用されました。
2. ティッシュスライサーの3枚を重ね、2つのブロックの間に断片を置き、ブレードを使用して断片を半分に切断し、ブロックをスライドさせて厚さ0.5mmの断片を2つ得た。
3. ティッシュチョッパーを使用して断片を切断し、より小さな断片を取得します。必要に応じて、組織が完全に粉々になるまでメスで残りの部分を手動で切断します。
4. 断片化した組織を、7 mLの消化培地(0.2%コラゲナーゼと0.02%DNaseを添加した培地[マッコイの5A培地、3 mmol/Lグルタミン、0.1% HSA、30 μg/mLペニシリンG、50 μg/mLトランスフェリン、4 ng/mLセレン、50 μg/mLアスコルビン酸])で満たされたグリッド状のペトリ皿に移します。
5. 皿を5%_CO2 および37°Cのインキュベーターに入れる。 10分ごとに、ペトリ皿をインキュベーターから取り出し、1 mLピペットで上下にピペッティングして組織を洗い流します。
6. 消化培地中で45分間インキュベートした後、ディッシュを5x〜6.3xの倍率範囲の実体顕微鏡下に置き、マイクロキャピラリーピペットを使用して卵胞を回収します。目的の卵胞を選択し、マウスピペットで吸い上げて分離します。
   注意: パイプへの材料の損失や汚染を避けるために、口のピペッティングは慎重に実行する必要があります。
7. 卵胞が皮質の一部に詰まったままの場合は、シリンジの先端で皮質をはがして間質から卵胞を放出することにより、2つの27Gシリンジで機械的に分離します。
   注意: 卵胞の損傷を防ぐため、注射器で卵胞に触れないでください。
8. マイクロキャピラリーを使用して、500 μLの油培養液で覆われた15 μLの校正済み培養培地(1滴あたり1〜10個の卵胞)の滴を含む4ウェルプレートに卵胞を移します。このステップは、収集プロセス中に卵胞の生存率を維持します。手順の最後に、卵胞を5秒間5秒間2回すすぎ、500 μLの油培養液(氷上)で覆われた15 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を2滴にします。
9. 空のチューブにマウスピペット(最大10μL)を使用して、最小限のPBSで20個の卵胞を収集し、チューブを氷上に置きます。
   注:RNAの安定性を得るには、氷上でステップ2.8とステップ2.9を実行することが重要です。標準的なRT-qPCR(SYBRグリーン)に十分なRNAを得るには、約20個の卵胞(<75 μm)が必要です。
10. 消化培地中で最大90分間インキュベートした後、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加した培養培地からなる過剰の冷(4°C)ブロッキング溶液(7.5 mL)をペトリ皿に加えて酵素反応を停止します。
    注:ブロッキング溶液は、実験者がプレートに付着している卵胞または損傷した卵胞(非対称形状またはより暗い色の卵胞)を観察したらすぐに追加できます。卵胞の損傷を避けるために、最大2.5時間以内に卵胞の分離を行い、分離直後にRNA抽出を行うことをお勧めします。

3. RNA抽出

注:RNA抽出は、RNA抽出キットに付属の手順に従って、溶出量を調整して実行します。

1. RNA抽出キットに付属の溶解液100 μLをケミカルフード下の卵胞入りチューブに加え、高速(2,500 rpm/min)で渦巻させて卵胞の構造を破壊し、単離した卵胞を懸濁させます。50 μLのエタノール(100%)をチューブに加え、高速で短時間ボルテックスします。
   注:溶解バッファーには2-メルカプトエタノールとチオシアン酸が含まれているため、このステップはケミカルフードの下で注意して実行する必要があります。
2. チューブの全容量(約160 μL)をカラムと収集チューブで構成されるマイクロフィルターカートリッジアセンブリに移し、4°Cで16,363 x g で10秒間遠心分離します。 キットに付属の洗浄液180 μLでカラムを洗浄し、4°Cで16,363 x g でチューブを10秒間遠心分離します。
3. キットに付属の洗浄液2/3 180 μLをカラムに加え、4°Cで16,363 x g で10秒間遠心分離します。 この手順を 2 回実行します。最後にもう一度チューブを遠心分離してフィルターを乾燥させ、新しい収集チューブをカートリッジの下に置きます。
4. 核酸の溶出は、次の 2 つのステップで実行します。
   1. まず、8 μLの温かい溶出溶液(75 °C)をフィルターに加え、RTで1分間待ち、4°Cで16,363 x g で30秒間遠心分離します。
   2. 7 μLの溶出溶液でこの手順を繰り返します。
      注:溶出した核酸を含むチューブは氷上に保管する必要があります。DNA汚染を避けるために、DNA分解の補足ステップであるステップ3.5を強くお勧めします。
5. チューブを2 IU DNaseおよび1x DNaseバッファーで37°Cで20分間インキュベートします。 1/10 DNase不活化試薬でRTで2分間酵素活性をブロックします。
6. チューブを4°Cで16,363 x g で1.5分間遠心分離します。 最後に、RNAを含む懸濁液を収集し、新しいチューブに移します。
7. 分光光度計(NanoDrop 2000ソフトウェア>核酸>RNA)を使用して、サンプル中に存在するRNAの量を評価します。1 μLの溶出溶液をブランクとして使用し、1 μLの溶液で単離された卵胞から抽出したRNA量を測定します。
8. RNA純度(約2.0)については、260/280の比率を確認してください。サンプルを-80°Cで保存するか、直接レトロ転写してRT-qPCRを実行します。
   注:RNAの完全性を評価するために、サンプルは-80°Cでの凍結の前後に高分解能自動電気泳動システムで処理できます。 この研究では、逆転写に続いて、RT-qPCRを次のサイクルで実行しました。
   50°Cで20秒、95°Cで10分間ステージを保持
   95°Cで15秒、60°Cで1分間の40回のPCRサイクル
   95°Cで15秒、60°Cで1分、95°Cで30秒、60°Cで15秒のメルトカーブステージ

この単離手順を使用して、実験者は間質環境から卵胞を回収し、特定の遺伝子発現分析を行うことができます。卵胞の大きさと形態に基づいて、卵胞形成のさまざまな段階を区別することが可能です。実験者は、適合したマイクロキャピラリーピペットを使用して、サイズに応じて目的の卵胞を選択できます。最大75μmのマイクロキャピラリーを使用することにより、原始卵胞と一次卵胞を二次卵胞、胞状卵胞、成熟卵胞から識別することができます。さらに、実験者は卵胞の形態に応じて卵胞の段階を確認することができます。卵胞の活性化を研究する場合、静止卵胞と一次卵胞が選択され、約5 ng / μLのRNA濃度に達するには約20個の卵胞が必要です。

同じ患者からの2つの均質化された卵巣断片(4 mm x 2 mm x 1 mm)を処理し、このプロトコルを使用して卵胞を分離しました(図2)。1.5時間の単離手順の後、RNA量を比較し、卵胞選択の関連性を強調するために、発達段階に従って2つの卵胞集団を回収しました:<75μmの20個の卵胞(チューブ1)と<200μmの15個の卵胞(チューブ2)。その後、RNA抽出を行い、定量用の分光光度計を用いて、チューブ1から4.8 ng/μLの全RNAおよびチューブ2から10.5 ng/μLの全RNAを得た(表1)。このマイクロボリューム分光光度計システムを用いて、RNA純度を評価するために260/280比も測定した。この比率は、抽出中のタンパク質または他の試薬による潜在的な汚染を反映しており、RNAサンプルの場合は2.0に近い必要があります。チューブ1とチューブ2の260/280比はそれぞれ1.89と1.74であり、サンプルの純度を検証しました(表1)。次に、高分解能自動電気泳動でサンプルを処理することにより、RNAの品質を検証しました。この手順に続いて、RNA完全性数(RIN)を推定した。1(分解)から10(無傷)までのRIN値は、サンプル中のRNAの分解レベルを反映しています。RIN値はチューブ1とチューブ2でそれぞれ7.1と7.9であり、サンプルからのRNAの品質を検証しました(表1)。RT-qPCRを実行するために、抽出されたRNAの全量を最初にcDNAにレトロ転写した。次に、ハウスキーピングおよび標的遺伝子(ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ[HPRT]、キットリガンド[KL]、および成長分化因子9[GDF9])およびSYBR Greenマスターミックス^17,18のプライマーとともに、96ウェルプレートにウェルあたり1.25 ngのcDNAを添加しました。リアルタイムPCRシステムで標準サイクルを実行した後、得られたサイクル閾値(Ct)は、HPRTで30.87(チューブ1)および29.56(チューブ2)、KLで33.5(チューブ1)および31.77(チューブ2)、GDF9で30.71(チューブ1)および30.57(チューブ2)であった(表1)。

図1:単離されたヒト卵巣卵胞からのRNA抽出を評価する方法の概略図。この原稿には、組織融解、機械的および酵素的処理を含む単離手順、および卵胞からのRNA抽出の3つのステップが記載されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:分離プロトコルに従って収集された卵胞。 (A)解凍した皮質組織。(B)組織を断片化するために用いられる組織スライサーおよび(C)組織チョッパー。(D-E)10倍の接眼レンズと広いズーム範囲(1x-6.3x)を備えた実体顕微鏡で観察された回収された孤立した卵胞の画像。50X〜63Xの倍率設定は、原始卵胞および一次卵胞の識別に使用されました。スケールバー:100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:2つの均質化された卵巣断片の純度、RIN、およびサイクル閾値。

卵巣組織の凍結保存は、がん患者の生殖能力を維持するための有望なアプローチです。診療所では、融解した皮質組織が寛解後に患者に移植され、卵巣機能と生殖能力の再開が可能になります^19,20。臨床使用に加えて、卵胞形成を調節するメカニズムを研究するために、保存期間の終わりに研究のために残留卵巣断片を提供することもできます。さらに、この組織は、in vitro培養システムや人工卵巣など、移植が不可能な場合に移植に代わるものを開発するのに特に有用です。ただし、患者内および患者間のばらつきは、実験の実現可能性と再現性、および結果の解釈を制限します。.実際、卵胞密度は年齢とともに劇的に減少し、卵胞は断片²¹間で均等に分布していません。利用可能な断片の数は限られているため、ヒト組織は最先端の技術で使用する必要があります。免疫組織化学および免疫蛍光法、ならびにin situハイブリダイゼーションなどの幅広い技術を固定組織上で実施して、タンパク質および遺伝子局在を評価することができる^3,18。発達の異なる段階で卵巣の機能単位内の卵胞形成を調節する分子メカニズムを研究するためには、卵胞の単離が必要である。

いくつかの研究は、人間と動物の種の周囲の組織から卵胞を分離する効果的な方法を探求しています²²。抽出後の卵胞の数とRNAの質は、使用する技術によって異なります。卵胞の活性化(すなわち、原始卵胞および一次卵胞)を研究するには、標準的なRT-qPCRを実行するために少なくとも20個のプールされた卵胞が必要です。RNAまたはcDNA増幅またはネストPCRなどの代替方法を使用することにより、より少ない卵胞で作業することが可能である^23、24。

卵巣皮質の密集した性質により、卵胞の隔離が困難になり、酵素的分離と機械的分離の組み合わせを含む方法が使用されるようになりました²⁵。コラゲナーゼやDNase²⁶など、さまざまな種類の酵素を使用できます。しかし、研究では、酵素消化後の卵胞の損傷が報告されており、in vitroでの発達にさらに影響を及ぼしています^27,28。卵胞の完全性を維持するために、いくつかのチームは現在、適応された酵素消化プロトコルを使用しているか、その後の卵胞培養のために機械的分離のみを行っています²⁵、^29、30、31。この原稿は、定量的PCR分析のために単離された卵胞を得るための簡単で効率的な方法を報告しています。それにもかかわらず、すべての実験は、最適な結果に到達する前に学習曲線を必要とします。

基礎研究の目的で、以前のプロトコルの改訂版が作成され、その完全性に影響を与えることなく大量の卵胞を回収しました¹³。遺伝子発現解析の処理は、RNA品質を最適化するために単離後に直接実行されます。変性した卵胞を選択するリスクを制限するために、長時間の消化を避けることも重要です。したがって、消化ステップは、このプロトコルにおいて依然として重要です。3つのポイントは特に注意を必要とします:(1)均質な酵素作用を提供するために10分ごとの酵素反応中の組織のフラッシング。(2)手順中に健康な卵胞を選択し、損傷が観察されたらすぐにブロッキング溶液との反応を停止することにより、卵胞の完全性を制御する。(3)コラゲナーゼ濃度の適応は、組織の硬さが年齢に応じて患者間で異なり得るようにする。コラゲナーゼの濃度は、損傷を防ぐために(すなわち、思春期前の患者において)場合によっては(0.12%に)減らすことができる³²。

このプロトコルの最後の部分では、単離された卵胞からのRNA抽出は、適応された指示に従って実行されました。これにより、RT-qPCRやRNAシーケンシングなどの幅広い実験が可能になり、卵母細胞や顆粒膜細胞に特異的なさまざまな細胞プロセスに関する基本的な情報が得られます。組織からRNAを抽出するための多数のプロトコルとキットが利用可能です。本研究室では、RT-qPCRによる遺伝子発現解析を行うのに十分な量のRNAを抽出することができる効率的な手法を報告しました。RNAの完全性を維持するために、卵胞の単離後に直接RNA抽出を強くお勧めしますが、抽出を同じ日に実行できない場合は、単離した卵胞を-80°Cで凍結することもできます。RNA量は卵胞のサイズによって異なる場合があり、静止卵胞とプールすると、成長する卵胞が分析を妨げる可能性があります。サイズに基づく選択は、研究の目的に応じて、特に卵胞形成の最初のステップにとって非常に重要です。しかし、サイズのみに基づく始原卵と初代卵胞の区別は、始原卵胞の遺伝子発現レベルを適切に評価するという点で依然として困難です。原糸状卵胞と一次卵胞の形態に基づいて選択することができますが、倍率63倍の実体顕微鏡でそれらを区別することは困難です。

結論として、実験者は卵胞分離の課題を認識し、結果を分析する際にそれらを考慮に入れる必要があります。(1)患者間の卵胞密度の内/相互変動など、重要なパラメータを考慮する必要があります。(2)卵胞単離中の卵胞完全性;(3)異なる卵胞段階間の区別;(4)RNAの安定性と完全性。

著者は競合する利益を宣言しません。

この研究は、Excellence of Science(EOS)助成金(ID:30443682)によってサポートされました。ベルギー国立科学財団(FNRS)の准研究員。