Análisis de expresión génica en folículos humanos

Aquí, describimos un protocolo que describe cómo aislar los folículos ováricos humanos del tejido cortical congelado-descongelado para realizar análisis de expresión génica.

El ovario es un órgano heterogéneo compuesto por diferentes tipos de células. Para estudiar los mecanismos moleculares que ocurren durante la foliculogénesis, la localización de proteínas y la expresión génica se pueden realizar en tejido fijo. Sin embargo, para evaluar adecuadamente los niveles de expresión génica en un folículo humano, esta estructura compleja y delicada debe aislarse. Por lo tanto, se ha desarrollado un protocolo adaptado previamente descrito por el laboratorio de Woodruff para separar los folículos (el ovocito y las células de la granulosa) de su entorno circundante. El tejido cortical ovárico se procesa primero manualmente para obtener pequeños fragmentos utilizando dos herramientas: una cortadora de tejidos y una cortadora de tejidos. Luego, el tejido se digiere enzimáticamente con 0,2% de colagenasa y 0,02% de DNasa durante al menos 40 minutos. Esta etapa de digestión se realiza a 37 °C y 5% de_CO2 y se acompaña de pipeteo mecánico del medio cada 10 min. Después de la incubación, los folículos aislados se recogen manualmente utilizando una pipeta microcapilar calibrada bajo aumento al microscopio. Si los folículos todavía están presentes en las piezas de tejido, el procedimiento se completa con microdisección manual. Los folículos se recogen en hielo en un medio de cultivo y se enjuagan dos veces en gotitas de solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de digestión debe controlarse cuidadosamente para evitar el deterioro del folículo. Tan pronto como la estructura de los folículos parece estar comprometida o después de un máximo de 90 minutos, la reacción se detiene con una solución bloqueadora de 4 °C que contiene un 10% de suero bovino fetal. Se debe recolectar un mínimo de 20 folículos aislados (con un tamaño inferior a 75 μm) para obtener una cantidad adecuada de ARN total después de la extracción de ARN para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Después de la extracción, la cuantificación del ARN total de 20 folículos alcanza un valor medio de 5 ng / μL. El ARN total se transcribe en ADNc, y los genes de interés se analizan más a fondo utilizando RT-qPCR.

El ovario es un órgano complejo compuesto de unidades funcionales y estructurales, incluidos los folículos dentro de la corteza y el estroma. La foliculogénesis, el proceso de activación, crecimiento y maduración del folículo desde un estado quiescente primordial hasta un folículo maduro capaz de ser fertilizado y apoyar el desarrollo embrionario temprano, se estudia ampliamente en la investigación¹. Desentrañar los mecanismos que impulsan este fenómeno podría mejorar la atención de la fertilidad para las mujeres². Los análisis en tejido humano fijo permiten evaluar la expresión proteica y la localización génica dentro de las unidades funcionales del ovario ^3,4. Sin embargo, se necesitan técnicas específicas para disociar los folículos de la corteza circundante para evaluar con precisión los niveles de expresión génica dentro de los folículos ováricos. Así, en un estudio previo, se desarrolló una técnica de aislamiento de folículos para permitir análisis de expresión génica directamente desde la unidad funcional del ovario⁵. Se han desarrollado diferentes enfoques, como la digestión enzimática y/o el aislamiento mecánico, así como la microdisección por captura láser, que permiten el aislamiento del folículo dentro de un pedazo de tejido 6,7,8,9. El aislamiento folicular es ampliamente utilizado, ya sea con tejido ovárico humano o animal, para evaluar los perfiles de expresión génica de los folículos en todas las etapas de desarrollo^10,11,12. Sin embargo, un procedimiento de aislamiento óptimo debe tener en cuenta la frágil estructura del folículo dentro de la corteza densa y, por lo tanto, debe realizarse con cuidado para evitar cualquier daño⁷. Este manuscrito describe un procedimiento, adaptado de un protocolo descrito por el laboratorio de Woodruff, para aislar folículos humanos de la corteza ovárica congelada-descongelada con el fin de realizar análisis de expresión génica¹³.

El primer paso del aislamiento del folículo ovárico del tejido humano congelado es el procedimiento de descongelación. Este proceso se realiza con base en el protocolo clínico utilizado para el injerto de tejido ovárico criopreservado, como se describió anteriormente^14,15. El proceso tiene como objetivo eliminar los agentes crioprotectores enjuagando la corteza ovárica en concentraciones decrecientes del medio. Luego, el tejido se fragmenta antes del aislamiento enzimático y mecánico para recuperar los folículos. Los folículos en diferentes etapas se pueden distinguir utilizando un microscopio estereoscópico con alto aumento y óptica de buena calidad para aislar los de interés. Cada folículo aislado se mide utilizando una regla integrada en el microscopio, y los folículos se pueden agrupar de acuerdo con su etapa de desarrollo: folículos primordiales (30 μm), folículos primarios (60 μm), folículos secundarios (120-200 μm) y folículos antrales (>200 μm)¹⁶. Se puede realizar una clasificación adicional de acuerdo con la morfología de los folículos: los folículos primordiales tienen una capa de células de la granulosa aplanada (GC), los folículos primarios tienen una capa de GC cuboidales, los folículos secundarios tienen al menos dos capas de GC cuboidales, y la presencia de una cavidad entre los GC caracteriza la etapa antral. Cuando se seleccionan folículos de interés, se realiza la extracción de ARN. La cantidad y la calidad del ARN se evalúan antes de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) (Figura 1).

Este proyecto fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Erasme (Bruselas, Bélgica). La paciente incluida en este protocolo se sometió a criopreservación de tejido ovárico (OTC) para la preservación de la fertilidad antes de la exposición a la quimioterapia en 2000. La paciente firmó un consentimiento informado por escrito para donar su tejido congelado residual a la investigación al final del período de almacenamiento.

1. Descongelación del tejido ovárico criopreservado

1. Prepare una placa de 6 pocillos que contenga cinco soluciones de descongelación. El primer pocillo contiene 5 ml de solución crioprotectora compuesta de Leibovitz-15 medio, 0,1 mol/L de sacarosa, 1,5 mol/L de dimetilsulfóxido (DMSO) y 1% de albúmina sérica humana (HSA). Los siguientes pocillos contienen 5 ml de medio Leibovitz-15 con concentraciones decrecientes de crioprotector: 1 mol/L, 0,5 mol/L y 2 x 0 mol/L DMSO.
   NOTA: La solución crioprotectora puede diferir según el protocolo utilizado en la clínica de fertilidad.
2. Extraiga un vial que contenga un fragmento cortical ovárico de nitrógeno líquido de acuerdo con las normas de seguridad (guantes criogénicos, gafas protectoras y zapatos cerrados) y mantenga el tubo a temperatura ambiente (RT) durante 30 s.
3. Remoje el vial en agua doble destilada durante 2 minutos en RT con agitación suave antes de abrir el vial bajo una campana vertical y transferirlo directamente al primer pocillo de la placa de 6 pocillos (en hielo).
4. Transfiera el fragmento sucesivamente a cada pocillo de la placa de 6 pocillos, cada uno de los cuales contiene concentraciones decrecientes de crioprotector en 5 ml de medio de Leibovitz-15. Agite suavemente el tejido en cada medio durante 5 minutos (sobre hielo).

2. Aislamiento del folículo

NOTA: Todos los experimentos se llevan a cabo utilizando materiales libres de RNasa y bajo una capucha vertical.

1. Transfiera el tejido descongelado a una placa de Petri cuadriculada de 2 mm llena con 10 ml de medio de disección (medio Leibovitz-15, piruvato de sodio [2 mmol / L], L-glutamina [2 mmol / L], HSA [0.3%], penicilina G [30 μg / ml] y estreptomicina [50 μg / ml]). Ajuste el tamaño del tejido con un bisturí si es necesario.
   NOTA: Dependiendo del protocolo clínico, el tamaño del tejido congelado puede variar de 8 mm x 4 mm x 1 mm a 4 mm x 2 mm x 1 mm. Para este protocolo, se utilizaron dos tiras de 4 mm x 2 mm x 1 mm.
2. Apilar las tres piezas de la cortadora de tejido, colocar el fragmento entre los dos bloques y cortar el fragmento por la mitad con una cuchilla, deslizándose a través de los bloques para obtener dos fragmentos de 0,5 mm de espesor.
3. Utilice el picador de tejido para cortar el fragmento y obtener trozos más pequeños. Si es necesario, corte las piezas restantes manualmente con un bisturí hasta que el tejido esté totalmente destrozado.
4. Transfiera el tejido fragmentado a una placa de Petri cuadriculada llena de 7 ml de medio de digestión (medio de cultivo [medio 5A de McCoy, 3 mmol / L de glutamina, 0.1% HSA, 30 μg / ml de penicilina G, 50 μg / ml de estreptomicina, 2.5 μg / ml de transferrina, 4 ng / ml de selenio y 50 μg / ml de ácido ascórbico] suplementado con 0.2% de colagenasa y 0.02% de DNasa).
5. Poner el plato en la incubadora al 5% de_CO2 y 37 °C. Cada 10 minutos, saque la placa de Petri de la incubadora y enjuague el tejido pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 ml.
6. Después de 45 minutos de incubación en el medio de digestión, coloque el plato bajo un microscopio estereoscópico con un rango de aumento de 5x-6.3x y recupere los folículos con una pipeta microcapilar. Seleccione los folículos de interés y aíslelos succionándolos con una pipeta bucal.
   NOTA: El pipeteo de boca debe realizarse con cuidado para evitar la pérdida de material en la tubería y la contaminación.
7. Si los folículos permanecen atrapados en un pedazo de corteza, aíslelos mecánicamente con dos jeringas de 27 G arrancando la corteza con la punta de las jeringas para liberar los folículos del estroma.
   NOTA: No toque los folículos con las jeringas para evitar dañarlos.
8. Transfiera los folículos con el microcapilar en una placa de 4 pocillos que contenga gotas de 15 μL del medio de cultivo calibrado cubierto por 500 μL de cultivo oleoso (1 a 10 folículos por gota). Este paso mantiene la viabilidad del folículo durante el proceso de recolección. Al final del procedimiento, enjuague los folículos dos veces durante 5 s cada vez en dos gotas de 15 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) cubierta por 500 μL de cultivo de aceite (en hielo).
9. Recoja 20 folículos con una cantidad mínima de PBS usando la pipeta bucal (máximo 10 μL) en un tubo vacío y mantenga el tubo en hielo.
   NOTA: Para la estabilidad del ARN, es crucial realizar los pasos 2.8 y 2.9 en hielo. Se necesitan alrededor de 20 folículos (<75 μm) para tener suficiente ARN para la RT-qPCR estándar (SYBR Green).
10. Después de un máximo de 90 minutos de incubación en el medio de digestión, detener la reacción enzimática añadiendo a la placa de Petri un exceso de solución bloqueante fría (4 °C) (7,5 ml) compuesta de medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%.
    NOTA: La solución de bloqueo se puede agregar tan pronto como el experimentador observe folículos pegados a la placa o folículos dañados (forma asimétrica o folículos de color más oscuro). Se aconseja realizar el aislamiento del folículo en un plazo máximo de 2,5 h para evitar el daño folicular y realizar la extracción de ARN inmediatamente después del aislamiento.

3. Extracción de ARN

NOTA: La extracción de ARN se realiza siguiendo las instrucciones proporcionadas con un kit de extracción de ARN adaptando los volúmenes de elución.

1. Suspender los folículos aislados añadiendo 100 μL de la solución de lisis proporcionada con el kit de extracción de ARN al tubo que contiene los folículos bajo una campana química, y vórtice a alta velocidad (2.500 rpm/min) para romper la estructura de los folículos. Agregue 50 μL de etanol (100%) al tubo y haga un vórtice brevemente a alta velocidad.
   NOTA: Como el tampón de lisis contiene 2-mercaptoetanol y ácido tiociánico, este paso debe realizarse con precaución bajo una campana química.
2. Transfiera el volumen total del tubo (aproximadamente 160 μL) a un conjunto de cartucho de microfiltro que comprenda una columna y un tubo colector, y centrifugarlo durante 10 s a 16,363 x g a 4 °C. Lavar la columna con 180 μL de solución de lavado 1, suministrada con el kit, y centrifugar el tubo durante 10 s a 16,363 x g a 4 °C.
3. Añadir 180 μL de solución de lavado 2/3, suministrada con el kit, a la columna y centrifugar durante 10 s a 16,363 x g a 4 °C. Realice este paso dos veces. Centrifugar el tubo por última vez durante 1 minuto para secar el filtro y colocar un nuevo tubo de recolección debajo del cartucho.
4. Realizar la elución de los ácidos nucleicos en dos pasos:
   1. Primero, agregue 8 μL de solución de elución caliente (75 °C) al filtro, espere 1 min a RT y centrifugar durante 30 s a 16,363 x g a 4 °C.
   2. Repita este paso con 7 μL de solución de elución.
      NOTA: El tubo que contiene los ácidos nucleicos eluidos debe mantenerse en hielo. Para evitar la contaminación del ADN, se recomienda encarecidamente un paso suplementario de degradación del ADN: paso 3.5.
5. Incubar el tubo con 2 UI de DNasa y 1x tampón DNasa durante 20 min a 37 °C. Bloquear la actividad enzimática con 1/10 de reactivo de inactivación de DNasa durante 2 min en RT.
6. Centrifugar el tubo durante 1,5 min a 16.363 x g a 4 °C. Finalmente, recoge la suspensión que contiene el ARN y transfiérela a un nuevo tubo.
7. Evaluar la cantidad de ARN presente en la muestra utilizando un espectrofotómetro (software NanoDrop 2000 > Ácido Nucleico > ARN). Use 1 μL de solución de elución como blanco y mida la cantidad de ARN extraída de folículos aislados con 1 μL de solución.
8. Verifique la relación 260/280 para la pureza del ARN (alrededor de 2.0). Conservar la muestra a −80 °C, o retrotranscribirla directamente para realizar RT-qPCR.
   NOTA: Para evaluar la integridad del ARN, la muestra se puede procesar con un sistema de electroforesis automatizado de alta resolución antes o después de la congelación a -80 °C. En este trabajo, después de la retrotranscripción, se realizó RT-qPCR con el siguiente ciclo:
   Mantenga el escenario con 20 s a 50 °C y 10 min a 95 °C
   40 ciclos de PCR con 15 s a 95 °C y 1 min a 60 °C
   Etapa de curva de fusión con 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C, 30 s a 95 °C y 15 s a 60 °C

Usando este procedimiento de aislamiento, el experimentador puede recuperar folículos del entorno estromal para realizar análisis específicos de expresión génica. Según el tamaño y la morfología de los folículos, es posible diferenciar las diferentes etapas de la foliculogénesis. El experimentador puede seleccionar folículos de interés según su tamaño utilizando una pipeta microcapilar adaptada. Mediante el uso de un microcapilar de máximo 75 μm, es posible discriminar folículos primordiales y primarios de folículos secundarios, antrales y maduros. Además, el experimentador puede confirmar la etapa del folículo de acuerdo con la morfología del folículo. Cuando se estudia la activación del folículo, se seleccionan los folículos quiescentes y primarios, y se necesitan aproximadamente 20 folículos para alcanzar una concentración de ARN de alrededor de 5 ng / μL.

Se procesaron dos fragmentos ováricos homogeneizados (4 mm x 2 mm x 1 mm) de la misma paciente para aislar folículos mediante este protocolo (Figura 2). Después de un procedimiento de aislamiento de 1,5 h, se recuperaron dos poblaciones de folículos de acuerdo con las etapas de desarrollo para comparar la cantidad de ARN y resaltar la relevancia de la selección de folículos: 20 folículos de <75 μm (tubo 1) y 15 folículos de <200 μm (tubo 2). Luego, se realizó la extracción de ARN y se obtuvieron 4,8 ng/μL de ARN total del tubo 1 y 10,5 ng/μL de ARN total del tubo 2 utilizando un espectrofotómetro para la cuantificación (Tabla 1). Usando este sistema de espectrofotómetro de microvolumen, también se midió la relación 260/280 para evaluar la pureza del ARN. Esta proporción refleja la contaminación potencial por proteínas u otros reactivos durante la extracción y debe ser cercana a 2.0 para muestras de ARN. Las relaciones 260/280 fueron 1,89 y 1,74 en el tubo 1 y el tubo 2, respectivamente, validando la pureza de las muestras (Tabla 1). La calidad del ARN se verificó procesando las muestras con electroforesis automatizada de alta resolución. Después de este procedimiento, se estimó el número de integridad del ARN (RIN). El valor RIN, de 1 (degradado) a 10 (intacto), refleja el nivel de degradación del ARN en una muestra. Los valores de RIN fueron de 7,1 y 7,9 en el tubo 1 y el tubo 2, respectivamente, validando la calidad del ARN de nuestras muestras (Tabla 1). Para realizar una RT-qPCR, el volumen total de ARN extraído se transcripcionó primero en ADNc. Luego, se agregaron 1.25 ng de ADNc por pocillo en una placa de 96 pocillos, con cebadores para el mantenimiento de la casa y genes objetivo (hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa [HPRT], ligando kit [KL] y factor de diferenciación de crecimiento 9 [GDF9]) y mezcla maestra SYBR Green^17,18. Después de ejecutar un ciclo estándar en un sistema de PCR en tiempo real, los umbrales de ciclo (Ct) obtenidos fueron 30,87 (tubo 1) y 29,56 (tubo 2) para HPRT, 33,5 (tubo 1) y 31,77 (tubo 2) para KL, y 30,71 (tubo 1) y 30,57 (tubo 2) para GDF9 (Tabla 1).

Figura 1: Representación esquemática del método para evaluar la extracción de ARN de folículos ováricos humanos aislados. En este manuscrito se describen tres pasos: la descongelación del tejido, el procedimiento de aislamiento, incluido el procesamiento mecánico y enzimático, y la extracción de ARN de los folículos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Folículos recolectados siguiendo el protocolo de aislamiento. (A) Tejido cortical descongelado. (B) La cortadora de tejido y (C) el cortador de tejido utilizado para fragmentar el tejido. (D-E) Imágenes de folículos aislados recuperados observados con un microscopio estereoscópico con un ocular de 10x y un amplio rango de zoom (1x-6.3x); Se utilizaron ajustes de aumento de 50x-63x para la identificación de folículos primordiales y primarios. Escalas: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Pureza, RIN y umbrales de ciclo de dos fragmentos ováricos homogeneizados.

La criopreservación del tejido ovárico es un enfoque prometedor para preservar la fertilidad de los pacientes con cáncer. En la clínica, el tejido cortical descongelado es injertado de nuevo en la paciente después de la remisión, permitiendo la reanudación de la función ovárica y la fertilidad^19,20. Además del uso clínico, los fragmentos ováricos residuales también pueden ser donados para la investigación al final del período de almacenamiento para estudiar los mecanismos que regulan la foliculogénesis. Además, este tejido es particularmente útil para desarrollar alternativas al injerto cuando no es factible, como los sistemas de cultivo in vitro o los ovarios artificiales. Sin embargo, las variaciones tanto dentro como entre los pacientes limitan la viabilidad y reproducibilidad de los experimentos y la interpretación de los resultados. De hecho, la densidad folicular disminuye dramáticamente con la edad, y los folículos no están distribuidos equitativamente entre los fragmentos²¹. Como el número de fragmentos disponibles es limitado, el tejido humano debe usarse con técnicas de vanguardia. Una amplia gama de técnicas como inmunohistoquímica e inmunofluorescencia, así como la hibridación in situ, pueden ser realizadas en tejido fijo para evaluar la localización de proteínas y genes ^3,18. Para estudiar los mecanismos moleculares que regulan la foliculogénesis dentro de las unidades funcionales del ovario en diferentes etapas de desarrollo, se requiere el aislamiento de los folículos.

Varios estudios han explorado métodos efectivos para separar los folículos del tejido circundante en especies humanas y animales²². El número de folículos recuperados y la calidad del ARN después de la extracción pueden variar según las técnicas utilizadas. Para estudiar la activación del folículo (es decir, los folículos primordiales y primarios), se necesitan al menos 20 folículos agrupados para realizar la RT-qPCR estándar. Mediante el uso de métodos alternativos como la amplificación de ARN o ADNc o la PCR anidada, es posible trabajar con menos folículos^23,24.

La naturaleza densa de la corteza ovárica hace que el aislamiento del folículo sea un desafío, lo que ha llevado al uso de métodos que involucran una combinación de aislamiento enzimático y mecánico²⁵. Se pueden utilizar diferentes tipos de enzimas, como la colagenasa y la DNasa²⁶. Sin embargo, estudios han reportado daño folicular después de la digestión enzimática, impactando aún más el desarrollo in vitro ^27,28. Para mantener la integridad del folículo, varios equipos están utilizando actualmente protocolos de digestión enzimática adaptados o realizando solo aislamiento mecánico para el cultivo folicular posterior 25,29,30,31. Este manuscrito reporta un método simple y eficiente para obtener folículos aislados para el análisis cuantitativo de PCR. Sin embargo, todos los experimentos requieren una curva de aprendizaje antes de alcanzar resultados óptimos.

Para fines de investigación fundamental, se desarrolló una revisión de un protocolo anterior para recuperar una gran cantidad de folículos sin afectar su integridad¹³. El procesamiento para el análisis de expresión génica se realiza directamente después del aislamiento para optimizar la calidad del ARN. También es crucial evitar la digestión prolongada para limitar el riesgo de seleccionar folículos degenerados. Por lo tanto, el paso de digestión sigue siendo crucial en este protocolo. Tres puntos requieren atención específica: (1) el lavado del tejido durante la reacción enzimática cada 10 minutos para proporcionar una acción enzimática homogénea; (2) el control de la integridad del folículo seleccionando folículos sanos durante el procedimiento y deteniendo la reacción con solución de bloqueo tan pronto como se observe daño; (3) la adaptación de la concentración de colagenasa, ya que la rigidez tisular puede variar entre pacientes según la edad. La concentración de colagenasa puede ser disminuida (hasta 0,12%) en algunos casos para prevenir daños (es decir, en pacientes prepúberes)³².

En la última parte de este protocolo, la extracción de ARN de folículos aislados se realizó siguiendo instrucciones adaptadas. Esto permite una amplia gama de experimentos, como RT-qPCR o secuenciación de ARN, que proporcionan información fundamental sobre diversos procesos celulares específicos de las células de ovocitos y granulosa. Numerosos protocolos y kits están disponibles para extraer ARN del tejido. Hemos reportado aquí una técnica eficiente utilizada en nuestro laboratorio que permite la extracción de una cantidad suficiente de ARN para realizar análisis de expresión génica por RT-qPCR. Si bien la extracción directa de ARN es muy recomendable después del aislamiento del folículo para mantener la integridad del ARN, también es posible congelar los folículos aislados a -80 ° C si la extracción no se puede realizar el mismo día. La cantidad de ARN puede variar según el tamaño de los folículos, y los folículos en crecimiento pueden interferir con el análisis si se combinan con los folículos quiescentes. La selección basada en el tamaño es extremadamente relevante, dependiendo de los objetivos del estudio, especialmente para el primer paso de la foliculogénesis. Sin embargo, la diferenciación entre folículos primordiales y primarios basada solo en el tamaño sigue siendo un desafío en términos de evaluar adecuadamente los niveles de expresión génica del folículo primordial. La selección de los folículos primordiales y primarios se puede realizar en función de su morfología, pero la discriminación entre ellos con un microscopio estereoscópico a un aumento de 63x es difícil.

En conclusión, el experimentador debe ser consciente de los desafíos del aislamiento del folículo y tenerlos en cuenta al analizar los resultados. Se deben considerar parámetros importantes, como (1) intra/inter-variaciones en la densidad del folículo entre pacientes; (2) integridad del folículo durante el aislamiento del folículo; (3) diferenciación entre diferentes etapas de los folículos; y (4) estabilidad e integridad del ARN.

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

Este trabajo fue apoyado por una subvención de Excelencia de la Ciencia (EOS) (ID: 30443682). I.D. es investigador asociado en Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).