ベルベリン治療下での腱線維芽細胞オートファジーの活性化による糖尿病性腱損傷の緩和

ベルベリン(BBR)は、 Coptis chinensis から単離されたイソキノリンアルカロイドであり、抗炎症、抗腫瘍、および2型糖尿病(T2DM)のいくつかの合併症の緩和を含む貴重な薬理学的活性を持っています。しかし、糖尿病性腱損傷の調節におけるBBRの役割は、まだ十分に理解されていません。本研究では、ラット2型糖尿病のモデルを構築し、TdT-Mediated dUTP Nick-end Labeling(TUNEL)アッセイと免疫組織化学分析により、BBR処理後の腱組織における細胞のアポトーシスとオートファジーを評価しました。腱線維芽細胞はラットのアキレス腱から採取し、細胞のアポトーシス、炎症性サイトカインの産生、およびオートファジー活性化の調節におけるBBRの役割を、フローサイトメトリー、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)、およびウェスタンブロット解析を用いて評価しました。私たちは、BBR処理がT2DMラットの腱組織におけるオートファジーの活性化を有意に増加させ、細胞アポトーシスを減少させることを示しました。腱線維芽細胞では、BBRは高グルコース(HG)誘発性細胞アポトーシスと炎症誘発性サイトカインの産生を抑制しました。HG治療は、腱線維芽細胞のオートファジー活性化の減少をもたらしましたが、BBRはオートファジー活性化を回復させました。さらに重要なことに、3-MAによるオートファジーの薬理学的阻害は、HG誘発性腱線維芽細胞損傷に対するBBRの保護効果を弱めました。まとめると、現在の結果は、BBRが腱線維芽細胞のオートファジーを活性化することにより、糖尿病性腱損傷の緩和に役立つことを示しています。

糖尿病(diabetes mellitus, DM)は、高血糖を特徴とする全身性代謝障害です¹。現在、糖尿病は人間の健康と平均余命を脅かす主要な病気の1つになっています²。症例の90%以上が2型糖尿病であり、慢性炎症³、インスリン抵抗性⁴、膵島^β細胞の損傷5を特徴とする代謝性疾患であり、その有病率は世界中で年々増加しています。

2型糖尿病は、心血管系⁶、眼⁷、腎臓⁷、神経⁸に深刻な影響を及ぼし、糖尿病患者を複数の障害のリスクにさらし、さらには生命を脅かす健康リスクさえもたらします。筋骨格系、特に糖尿病性腱の病理学的変化に関する研究はほとんどありませんでした。近年、慢性腱鞘炎の発生率が大幅に増加しています。腱は、エネルギーを貯蔵および供給する能力を動的に調整できます^9,10。腱組織では、腱線維芽細胞は、損傷後の腱の適応と腱の修復を調節する上で重要な役割を果たします^9,11。現在のところ、腱損傷に対する腱線維芽細胞の機能は不明のままです。

イソキノリンアルカロイドとして、BBRは、血糖値の低下、脂質の低下、コレステロールの低下、抗炎症作用、抗菌作用、活性酸素種の除去、神経系機能障害の拮抗など、さまざまな生理学的プロセスで薬理学的効果を発揮します^12,13。BBRは、脂肪組織および骨格筋細胞におけるグルコースの取り込みおよび利用を増加させ、肝臓および骨格筋細胞におけるインスリン受容体の発現をアップレギュレートし、肝臓におけるLDL受容体の発現を増加させ、血漿中のコレステロールおよび糖のレベルを低下させることができる¹⁴。BBRは、DM15,16,17のいくつかの合併症を緩和する上で貴重な薬理学的活性を持っていますが、糖尿病性腱損傷の調節におけるBBRの役割はよく理解されていません。

オートファジーは、損傷した細胞小器官を引き出し、代謝恒常性を維持するための代謝産物を提供するために、ほとんどの組織でベースラインレベルで発生する必要があります^18,19。オートファジーはβ細胞の健康に重要な役割を果たし、オートファジーの障害はβ細胞の機能障害や糖尿病の進行と相関しています^20,21。新たな研究では、BBRによるオートファジーの活性化が糖尿病性腎症の改善に寄与することが実証されています²²。以上の知見に基づき、BBRがオートファジーの制御を通じて糖尿病性腱損傷の緩和に役立つかどうかを検討しました。現在の結果は、BBRがHG誘発性腱線維芽細胞の損傷と炎症反応を減少させることを示しました。HGは腱線維芽細胞のオートファジー活性化を減少させましたが、BBR治療はオートファジー活性化を回復させ、その結果、腱線維芽細胞の生存率が上昇し、炎症誘発性サイトカインが減少しました。

この研究は、上海中医薬大学越陽総合伝統中国西洋医学病院の研究倫理委員会によって承認されました。すべての動物実験は、上海中医薬大学越陽総合伝統西洋医学病院の倫理委員会によって承認されました(IACUC番号:YYLAC-2019-1)。雄のWistarラット(200-240 g、8週齢)は、Shanghai SLAC Laboratory Animal Centerから購入しました。

1. T2DMのラットモデル

1. 雄のWistarラット(200-240 g、8週齢)を、12時間の明暗サイクル(20±〜2°C、相対湿度50%〜60%)の気候制御された環境で維持します。実験期間中、 食料 と水を自由に提供します。
2. 動物の苦痛を最小限に抑えるために、優しい取り扱い、毎日のケージの清掃、監視など、努力してください。
3. ラットを対照群(n = 5)、DMモデル群(n = 5)、およびBBR群で治療した糖尿病モデル(n = 5)の3つのグループにランダムに割り当てます。
4. 前述²³に従ってラットDMモデルを確立する。
   1. 新たに調製したクエン酸ナトリウム緩衝液(w / v:2%)に溶解したストレプトゾトシン(STZ)を30 mg / kgの用量でラットに1回静脈内注射します。.STZを含まない等量のクエン酸クエン酸ナトリウムバッファーをコントロールグループ腹腔内に注入します。.
   2. 血液ガス分析装置を使用して血糖値を評価します。示された血糖値(≥16.7 mmol / L、10日間連続)のラットをT2DMモデルに使用します。.
   3. 1週間後、T2DMラットをランダムに2つのグループ(各グループのn = 5)に分けます:未治療のラットまたは200 mg / kg /日のBBRを4週間強制経口投与したラット。

2. 原発性腱線維芽細胞

1. 麻酔下でバルビツール酸(40 mg / kg)の腹腔内注射によりラットを犠牲にし、以前に報告されたようにアキレス腱を取得します²⁴。
2. 腱組織から腱線維芽細胞を分離します²⁵.
   1. 腱組織を手動で細断し、0.2%II型コラゲナーゼを含むDMEMに入れます。37°Cで3時間激しく撹拌します。
   2. 遠心分離により培地を取り出し、10%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMを消化組織に加えます。
   3. 100 μmのストレーナーで腱組織をろ過し、ろ過した溶液を6ウェルプレートに注ぎ、加湿インキュベーター内で腱線維芽細胞を5%_CO2で37°Cに維持します。

3. 細胞生存率アッセイ

注:Cell Counting kit-8(CCK-8)アッセイを使用して、製造元の指示に従って細胞生存率を測定しました。

1. トリプシン処理後、腱線維芽細胞を96ウェルプレート(4 x 10³ 細胞/ウェル)にプレートし、BBR(0、5、10、20、40、および80μM)の存在下または非存在下で、異なる用量のグルコース(0、5、10、20、30、および50 mM)で48時間処理します。
   注:グルコースとBBRはDMEMに溶解しました。
2. CCK-8溶液(10 μL)を各ウェルに加え、細胞を37°Cでさらに2時間インキュベートします。
3. 続いて、マイクロプレートリーダーで各ウェルの吸光度を波長450nmで測定します。

4. 細胞アポトーシス解析

注:ヨウ化プロピジウム(PI)およびアネキシンV-FITCフローサイトメトリーアッセイを使用して、腱線維芽細胞のアポトーシス速度を分析しました。

1. 腱線維芽細胞(5 x 10⁵ 細胞)をDMEMの6ウェルプレートに24時間播種します。
2. 各ウェルからDMEMを吸引して廃棄します。HG(30 mM)を含む新鮮なDMEMで、BBR(20 μM)の存在下または非存在下で24時間細胞を処理します。
3. 1x PBS中の0.25%トリプシンで細胞を剥離し、PBSで細胞を回収し、2000 x g で5分間遠心分離します。
4. 細胞を結合バッファー(材料表)に再懸濁し、10 μLのFITC標識アネキシンVと5 μLのPIで、室温(RT)で15分間暗所で染色します。
5. 次に、フローサイトメーターで細胞を解析します。

5. 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)

1. 腱線維芽細胞を採取し、メーカーの推奨に従ってRNA抽出キット(Table of Materials)を使用して均質化します。
2. Moloneyのマウス白血病ウイルス逆転写酵素およびOligo(dT)プライマーを用いて逆転写PCRを実施します(材料表)。
3. リアルタイムPCRシステム上でSYBRグリーンqPCR Mixを使用してqRT-PCRを実施します。サイクル条件は、95°Cで10分間の変性、95°Cで20秒間、55°Cで20秒間、および72°Cで30秒間の45サイクルです。
   注:IL-1β、IL-6、IL-10のプライマーの詳細については、 材料表を参照してください。β-アクチンをリファレンス遺伝子として用いた。
4. 前述のように、^2-ΔΔCT 式を使用して相対式レベルを計算します²⁶ 。

6. ウェスタンブロット解析

1. BBR(20 μM)の存在下または非存在下でHG(30 mM)で24時間処理した後、腱線維芽細胞をRIPAバッファーで溶解し(Table of Materials)、ビシンコニン酸アッセイを使用して総タンパク質濃度を定量します。
2. RTで10% SDS-PAGEにより各サンプルから等量のタンパク質(50 μg)を分離し、次いで4°Cで2時間ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに移します。
3. TBST中の5%脱脂粉乳中のメンブレンをブロックし、抗LC3B抗体(1:1500)、抗p62抗体(1:2000)、および抗β-アクチン抗体(1:3500)の一次抗体と4°Cで一晩インキュベートします。
4. TBSTで洗浄した後、メンブレンをヤギ抗ウサギH&L HRP標識二次抗体(1:5000)と室温で1時間インキュベートします。
5. ECL化学発光キットを使用して、特異的ブロットを可視化し、デンシトメトリーによるオートラジオグラムを定量化します。

7. 免疫組織化学分析(IHC)

1. パラフィン包埋した足腱組織を6μmの厚さに切片します。
2. 切片を4%ホルマリンで固定した後、切片を抗LC3抗体(1:200)と共に4°Cで一晩インキュベートします。
3. 10 mM PBS(pH7.4、Tween 20)で3回洗浄した後、すべての切片をヤギ抗ウサギHRP標識二次抗体(1:1000)と37°Cで1時間インキュベートし、DABとヘマトキシリンで室温で60分間染色します。
4. 倒立顕微鏡を使用して、染色されたスライドを20倍の倍率で画像化します。

8. TUNELアッセイ

注:腱組織の細胞アポトーシスは、製造元の指示に従ってTUNELアッセイキットを使用して分析しました。

1. パラフィン包埋した足腱組織を6μmの厚さに切片します。
2. 切片をキシレンで脱パラフィンし、等級付けされた一連のエタノールで再水和します。
3. 室温で3%過酸化水素に浸漬した後、切片をTUNEL反応混合物と共に37°Cで1時間インキュベートします。
4. DAPIを使用して核を対比染色します。蛍光顕微鏡(20倍)で染色した細胞を観察し、TUNEL陽性細胞の割合を決定します。

9. 統計分析

1. 適切なソフトウェアアプリケーションを使用して統計分析を実行する
   注:ここでは、データは3つの独立した実験の平均±標準偏差(SD)として示されています。統計解析はSPSS 23.0を用いて行った。スチューデントのt検定はグループ間の差を比較するために実行され、一元配置分散分析(ANOVA)は複数のグループ分析に対して実行されました。 差は、p が0.05<ときに統計的に有意でした。

糖尿病性腱損傷の緩和におけるBBRの薬理学的役割を評価するために、DMラットの足腱組織における細胞アポトーシスおよびオートファジー活性化をBBRの存在下または非存在下で評価した。 図1A は、DMラットの腱組織では、対照ラットと比較してLC3(オートファジーマーカー)のタンパク質レベルが低下したのに対し、BBR処理はオートファジー活性化を有意に回復させたことを示しました。さらに、DMラットの腱組織では、正常組織と比較して細胞アポトーシスが上昇しましたが、BBRは細胞アポトーシスを有意に減少させました(図1B)。これらの結果は、BBRがDMラットの腱組織におけるオートファジーの活性化を増加させ、細胞のアポトーシスを減少させることを示しています。

次に、腱線維芽細胞の生存率とアポトーシスの調節におけるBBRの役割を in vitroで評価しました。 図2A は、腱線維芽細胞の生存率が用量依存的に低下し、30mMのHGが腱線維芽細胞の損傷を誘発するのに適していることを示しました。次に、HGの存在下での腱線維芽細胞に対するBBRの保護的役割を調査しました。 図2Bに示すように、BBRによる腱線維芽細胞の前処理は、HG(30mM)の存在下での細胞生存率の増加に寄与しました。BBR(20μM)は、追跡調査で腱線維芽細胞の治療に使用されました。さらに、腱線維芽細胞のアポトーシスは、フローサイトメトリーを使用してHGまたは/およびBBRの存在下で測定されました。 図2C、D は、HG処理後にアポトーシス細胞の割合が有意に増加したのに対し、BBRはHG誘発性腱線維芽細胞アポトーシスを減少させたことを明らかにした。

慢性炎症は、糖尿病合併症と関連し、インスリン抵抗性の一因となる2型糖尿病の特徴です。したがって、HG処理された腱線維芽細胞の炎症因子IL-1β、IL-6、およびIL-10を測定して、炎症反応に対するBBRの影響を決定しました。qRT-PCRの結果は、炎症誘発性サイトカインIL-1βおよびIL-6が有意に増加したことを示しました。対照的に、抗炎症性サイトカインIL-10はHG治療後に減少し(図3A-C)、HGが腱線維芽細胞の炎症誘発性反応を引き起こしたことを示しています。さらに重要なことに、BBR治療は腱線維芽細胞のHG誘発性炎症誘発反応を抑制しました(図3A-C)。

腱線維芽細胞のオートファジー活性化の制御におけるBBRの役割を調べるために、BBRの存在下または非存在下で腱線維芽細胞をHGで処理し、その後、オートファジーの活性化をアッセイしました。 図4Aに示すように、HG処理はLC3緑色抹濁細胞の減少によって証明されるように、腱線維芽細胞のオートファジー活性化を減少させましたが、BBRはHG処理された腱線維芽細胞のオートファジーの活性化を明らかに回復させました。さらに、オートファジーマーカーLC3-IIおよびオートファジー基質p62をウェスタンブロット分析を用いて評価しました。 図4B、C は、HGが腱線維芽細胞におけるLC3 タンパク質発現を減少させ、p62タンパク質発現を増強することを示し、HGが腱線維芽細胞のオートファジーを不活性化したことを示しました。予想通り、BBRはHG処理した腱線維芽細胞のオートファジー活性化を回復させました(図4B、C)。

最後に、オートファジーが腱線維芽細胞のHG誘発性損傷を緩和するBBRの役割を媒介するかどうかを調査しました。この目的のために、オートファジーの特異的阻害剤である3-MAを使用して、BBRの存在下でオートファジーを不活性化し、その後、細胞生存率と炎症誘発性サイトカインを評価しました。図5A,Bに示すように、オートファジーの薬理学的阻害は、BBR治療単独と比較して腱線維芽細胞のアポトーシスを増加させました。同様に、3-MA治療は、BBR治療単独と比較して、腱線維芽細胞の生存率を有意に低下させた(図5C)。また、3-MA治療は、BBR治療単独と比較して炎症誘発性サイトカインのレベルを増加させました(図5D)。まとめると、これらのデータは、BBRが腱線維芽細胞のオートファジーを活性化することにより、糖尿病性腱損傷を緩和することを示しています。

図1:BBRは、DMラットの腱組織におけるオートファジー活性化の増加と細胞アポトーシスの減少を示しました。 (A)対照ラット(n = 5)、DMラット(n = 5)、およびBBR治療DMラット(n = 5)の足腱組織におけるLC3タンパク質発現の免疫組織化学的分析。スキャンバー = 50 μm. 倍率 20倍 (B) 対照ラット (n = 5)、DM ラット (n = 5)、および BBR 処理 DM ラット (n = 5) の足腱組織における TUNEL 染色を使用して細胞アポトーシスを分析しました。スキャンバー = 20 μm. 倍率 20倍。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2:BBRは、腱線維芽細胞のHG誘発性アポトーシスを減少させた(A)腱線維芽細胞の生存率は、HGの異なる用量(0、5、10、20、30、50 mM)での治療後にCCK-8アッセイを使用して評価された。(B)BBR(0、5、10、20、40、および80μM)の存在下で30mMのHGで処理した後、CCK-8アッセイを使用して腱線維芽細胞の生存率を評価しました。(C,D)腱線維芽細胞の細胞アポトーシスは、BBR(20 μM)の存在下または非存在下でHG(30 mM)で処理した後、フローサイトメトリーを使用して評価しました。* p < 0.05、** p < 0.01。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:BBRは、腱線維芽細胞におけるHG誘発性炎症反応を緩和した。 (A-C)腱線維芽細胞中の炎症因子(A)IL-1β、(B)IL-6、および(C)IL-10のmRNAレベルを、BBR(20μM)の存在下または非存在下でHG(30mM)で処理した後、qRT-PCRによって測定しました。* p < 0.05、** p < 0.01。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:HG処理した腱線維芽細胞におけるBBRによるオートファジー活性化の回復 (A)LC3レベルは、BBR(20 μM)の存在下または非存在下でHG(30 mM)で処理した後の腱線維芽細胞の免疫蛍光分析により評価されました。スキャンバー = 10 nm。倍率60倍 (B) HG (30 mM) による BBR (20 μM) の存在下または非存在下での腱線維芽細胞の LC3 および P62 のタンパク質レベルのウェスタンブロット分析。* p < 0.05、** p < 0.01。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

(A,B) 腱線維芽細胞の細胞アポトーシスは、BBR(20 μM)単独またはHG(30 mM)存在下でBBRと3-MA(5 mm)を併用した後、フローサイトメトリーを用いて評価した。(C)腱線維芽細胞の生存率は、BBR(20μM)単独またはHG(30mM)の存在下でBBRと3-MA(5mm)を併用して処理した後、CCK-8アッセイを使用して評価しました。(D)BBR(20 μM)単独またはHG(30 mM)存在下でのBBRと3-MA(5 mm)の併用による治療後の腱線維芽細胞中のIL-1βおよびIL-6 mRNAレベルのqPCR分析。** p < 0.01.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

腱損傷は、DM²⁷ の患者によく見られる合併症です。腱線維芽細胞は、創傷治癒過程において重要な役割を果たす^28,29。本研究では、i)BBRがDMラットの腱組織におけるオートファジー活性化を増加させ、細胞アポトーシスを減少させること、ii)BBRがHG誘導性腱線維芽細胞のアポトーシスを減少させること、iii)BBRが腱線維芽細胞におけるHG誘発性炎症反応を緩和したこと、iv)HG処理された腱線維芽細胞におけるBBRによるオートファジー活性化の回復、v)BBRがオートファジーを活性化することにより、HGによる腱線維芽細胞の損傷を緩和したことが確認されました。現在の結果は、腱損傷における腱線維芽細胞オートファジーの調節におけるBBRの重要な役割を明らかにし、糖尿病性腱損傷の治療に新たな機会を提供する可能性があります。

この研究では、T2DMのラットモデルを使用して、腱損傷に対するBBRの保護的役割を調査しました。T2DMモデルは、前述のように30 mg / kgの用量でSTZを単回静脈内注射することにより成功裏に確立されました^23,30。これは、腱損傷の緩和に対するBBRの効果を評価するための重要なステップです。モデルを確認するために、血糖値をアッセイし、示された血糖値(≥16.7 mmol / L、10日間連続)のラットをその後の研究に使用しました。T2DMモデルの構築に若干の修正が加えられました。ここでは、ラットの治療に40 mg / kgの代わりに30 mg / kgのSTZが適用されました。T2DMのラットモデルは実験的研究で広く使用されていますが、腱損傷にモデルを適用した研究はほとんどありません。

以前の研究では、慢性低悪性度炎症 (CLGI) が 2 型糖尿病の発症に関連しており、インスリン抵抗性に寄与することが示されています。特に、CLGIは、糖尿病性足疾患、心血管障害、腎臓病、網膜症、慢性創傷など、さまざまな糖尿病合併症の一因となる重要な要素です。以前の研究では、腱の恒常性がHGによって修飾され、腱のAMPK/Egr1経路の下流遺伝子の発現が抑制されることが示されました³¹。オートファジーは自然免疫応答の効果的な調節因子であり、オートファジーはインフラマソームの活性化と炎症誘発性サイトカインの産生を抑制する可能性があります³²。Hudgensらは、多血小板血漿が腱線維芽細胞の炎症誘発性反応を引き起こし、その結果、酸化ストレス経路が活性化されることを示しました³³。 現在の研究では、HG治療が腱線維芽細胞の炎症誘発性反応を誘発するのに対し、BBRはHG誘発性炎症性サイトカインの分泌を減少させることをさらに示しました。さらに重要なことに、BBRはオートファジーを活性化することにより、腱線維芽細胞の炎症誘発性反応を抑制します。さらに、BBRはオートファジーを活性化することにより、腱線維芽細胞のHG誘発性アポトーシスも抑制します。

BBRは、インスリン抵抗性を改善し、グルコースと脂質を減らすための代謝性疾患の臨床治療や、高血圧、高脂血症、糖尿病、肥満、脂肪肝、およびその他の状態の補助療法として広く使用されています。例えば、BBRはHG^の存在下で網膜ミュラー細胞のアポトーシスを減少させることができる。糖尿病性心疾患では、BBR投与は、心臓内のIGF-1R、コラーゲンI、およびα-SMAレベルを抑制することにより、心臓の線維化および機能障害を改善することができる³⁵。糖尿病性末梢神経障害では、BBRはROSの生成と炎症誘発性因子の産生を抑制することにより、HG誘発性神経炎症と神経細胞の損傷を軽減します^36,37。BBRはまた、炎症反応を調節し、糸球体細胞のアポトーシスを阻害するため、糖尿病性腎症の発症を遅らせる³⁸。本研究では、BBRがHGによる腱損傷を弱め、BBRの保護効果は腱線維芽細胞のオートファジーを活性化することで媒介されることが示されました。BBRは多くの疾患において良好な治療的役割を果たしているが、その臨床応用は経口投与による吸収不良や静脈内投与による重篤な副作用(血圧低下と呼吸停止)によって制限されている^39,40。

著者は、この記事の内容に関連すると宣言する利益相反はありません。

本研究は、上海中医学開発のさらなる加速のための上海3カ年行動計画プロジェクト[ZY(2018-2020)-CCCX-4005]の助成を受けて行われました。