高分解能クライオ電子線トモグラフィーのための3D相関集束イオンビームミリングによるサンプル調製

ここでは、クライオ電子線トモグラフィー用の細胞サンプルの調製をガイドするための3D相関集束イオンビームミリングのパイプラインを紹介します。目的の蛍光タグ付きタンパク質の3D位置は、まずクライオ蛍光顕微鏡で決定され、次にミリングの標的となります。このプロトコルは、哺乳類、酵母、および細菌細胞に適しています。

クライオ電子線トモグラフィー(クライオET)は、細胞の微細構造と分子複合体を天然の凍結水和状態で調べるために最適な方法となっています。ただし、クライオETでは、入射電子ビームを散乱または遮断しないようにサンプルが十分に薄い必要があります。厚い細胞サンプルの場合、これはクライオ集束イオンビーム(FIB)ミリングによって達成できます。このプロトコルは、3次元蛍光顕微鏡データとFIB走査型電子顕微鏡からの情報を組み合わせた3D相関アプローチを使用して、FIBミリング中に特定の細胞部位を標的にする方法を説明しています。この技術を使用すると、クライオ透過電子顕微鏡(クライオTEM)を使用して、まれな細胞イベントや構造を高精度で標的化し、分子分解能で視覚化できます。

集束イオンビームミリングにより、ナイフマークや圧縮アーチファクトなどの機械的切片に一般的に関連する問題なしに、凍結固定された標本から薄い生物学的サンプルを調製^{できます1。}クライオ電子線トモグラフィーと組み合わせると、FIBミリングは、細胞形態の高解像度生物学的研究と、サブナノメートルの分解能^2,3,4で細胞内から直接高分子複合体の構造の決定を可能にします。リボソームなどの豊富な種は、ランダムに切断されたFIBラメラに容易に見られますが、多くの細胞プロセスは、いくつかの複合体の共局在に依存しているか、細胞内の特定の部位に局在しています。したがって、粉砕プロセス中に目的の生物学的特徴を失わず、ランダムヒットに限定するために、効率的なターゲティングが必要です。したがって、走査型電子顕微鏡(SEM)-FIBとクライオ蛍光光顕微鏡(FLM)のデータを組み合わせた相関的アプローチが必要です。初期相関を省略し、TEM取得後にのみFLMとクライオETのデータを組み合わせることができますが^5,6、^蛍光誘導集束イオンビームミリングにより、事前にミリング領域を正確に選択できるため、より効率的な^{データ取得が可能になります}。その構想⁷以来、生物学的研究における3D相関FIB粉砕の適用は、^{この技術を使用して}酵母の新しい液液相分離(LLPS)コンパートメントを特定することを最近報告するまで制限されていました8。

ここでは、細菌から酵母や哺乳類細胞に至るまでのさまざまなサンプルの研究に使用できる、一般化された3Dクライオ相関光電子顕微鏡(CLEM)プロトコルについて説明します。実験は特定の機器セットを使用して実施されたが、個々のステップは特定のハードウェアにバインドされておらず、既存のプロトコル^3、5の拡張として他のシステムに容易に転送することができる。テストされた機器と推奨される設定のリストは、 材料 表と 表1に記載されています。パイプラインの4つの重要なステップは、(1)サンプル調製、(2)クライオ蛍光顕微鏡による目的の特徴の局在化、(3)3D相関集束イオンビームミリング、および(4)クライオ透過電子顕微鏡でのラメラ上のクライオETデータ取得のためのターゲット構造の局在化です(図1)。

図 1: ワークフローの概要と重要なステップの選択。 プロトコル全体は、使用する機器に応じて、プランジ凍結、クライオ蛍光顕微鏡、クライオフォーカスイオンビームミリング、クライオ電子顕微鏡などのサンプル調製の4つの段階に分かれています。各ステップで、いくつかの重要なポイントが強調表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1.細胞培養とグリッドのプランジ凍結

1. 選択した細胞を培養し、低温実験に移行する前に室温で標識および処理戦略を最適化します。目的のターゲットは、蛍光タンパク質融合またはライブ染色(Halo-Tag、LysoTracker、BODIPY、ライブ抗体染色など)を使用して標識されます。目的の生物学的プロセスを調査するために化学的または生物学的薬剤(低分子、特殊培地、siRNAなど)による処理が必要な場合は、生細胞FLMイメージングを使用して条件(時間、濃度など)を最適化します。
   1. 後のクライオ条件(NA、露光時間など)に可能な限り一致するイメージング設定を使用して、目的の部位が十分な数の細胞のバックグラウンド上に正常に局在化できることを確認します。
2. グリッドの選択と準備
   1. 使用するセルと指標マーカーに適した穴のサイズと間隔を持つグリッドを選択します(手順1.3.1を参照)。穴のない連続フィルムは、ブロッティング後の残留バッファーが多くなりすぎてガラス化効率が低下し、基準ビーズの検出を妨げる可能性があるため、使用しないでください。細胞とグリッドを長時間接触させるには、グリッドサポートとフィルム材料が生体適合性であることを確認してください。
   2. クライオ電子顕微鏡グリッドをプラズマ洗浄して、親水性を高めます。接着細胞培養に使用する場合は、層流フード内でUV照射で20分間プラズマ洗浄した後、グリッドを滅菌します。任意選択で、グリッドは、以下に記載されるように、ポリ−L−リジンまたはコンカナバリンAなどの細胞接着を助ける化合物で前処理されてもよい。
      注:一般に、次のグリッド/サンプルの組み合わせが、相関クライオFIBワークフローで正常に使用されています:酵母:CuまたはAu、200メッシュ、R1 / 4炭素またはSiO₂ フィルム、オプションでコンカナバリンAでコーティング。 大腸菌:CuまたはAu、200メッシュ、R1 / 4炭素またはSiO₂ 膜; クラミドモナスラインハルティ:CuまたはAu、200メッシュ、R1 / 2またはR1 / 4炭素またはSiO₂ フィルム。HeLa:Au、200メッシュ、R1 / 4 SiO₂ 膜、ポリ-L-リジンでコーティング。HEK293:Au、200メッシュ、R1/4_SiO2 膜、ポリ-L-リジンでコーティング。
   3. 酵母細胞の付着を改善するためのコンカナバリンAコーティング:
      • 100 μM CaCl₂、pH 8.5を含む10 mM HEPESバッファー中の1 mg/mLのコンカナバリンAのコーティング溶液を調製します。1滴(50μL)のコーティング溶液と2滴の蒸留水を別々にパラフィンフィルムの上に置きます。
      • プラズマ洗浄したグリッドを逆力ピンセットで持ち上げ、フィルムの損傷を防ぐためにグリッドに垂直な動きを避けながら、コーティング溶液の滴に慎重に挿入します。
      • ~5秒のインキュベーション後、同様の方法でグリッドを水滴に挿入して2回洗浄します。最後に、グリッドの背面にろ紙を塗布して余分な液体を吸い取り、グリッドを完全に乾かしてからピンセットから解放します。乾燥したグリッドをプランジ凍結に使用します。
   4. 浮遊培養および接着細胞のためのポリ-L-リジンコーティング:
      • ポリ-L-リジン 1 mg/mL のコーティング溶液を 0.1 M ホウ酸ナトリウム緩衝液、pH 8.5 で調製します。
      • プラズマ洗浄したグリッドを細胞培養に適したディッシュに入れ、UV照射により20分間滅菌します。
      • すべてのグリッドを覆うのに十分なコーティング溶液を静かに加え、37°Cで少なくとも2時間インキュベートします。液体を吸引し、グリッドをPBSで2回穏やかに洗浄してから、細胞を所望の濃度に播種します。
3. 細胞および基準ビーズの調製
   注:フィデューシャルビーズは、3D相関FIBミリングを可能にするために、FIB / SEM顕微鏡で撮影された画像との蛍光データの3D登録に必要です。
   1. すべてのイメージングモダリティ、すなわちFLM、SEM、IB(推奨直径0.5〜1 μm)で認識可能なビーズを選択しますが、ビーズと目的の生物学的特徴を区別しやすくするために、蛍光イメージング中に細胞標的構造を凌駕しないようにします。製造業者の指示に従って、基準ビーズ(NaN₃など)中の細胞傷害性防腐剤を除去します。
      注:対象となる生物学的特徴と基準を簡単に区別するには、蛍光発光スペクトルが部分的にのみ重なり合って、FLMチャネルの強度差に基づいて信号を区別できるようにすると便利です。
   2. 浮遊培養を使用する場合は、細胞を適切な密度(酵母OD₆₀₀ = 0.8、大腸菌OD 600 = 0.8-1.0、C.ラインハルティ1500細胞/μLなど)に増殖させ、培地の交換、化学薬品の添加、飢餓などの実験に必要な処理を行います。プランジ法(手動/自動)の必要に応じてプラズマ洗浄したグリッドをピンセットに取り付け、4 μLの細胞懸濁液を~1 x 10⁵ビーズ/μLの基準ビーズ懸濁液と混合した溶液をグリッドのフィルム側に塗布します。
      注:滴定実験における細胞および基準の最適な希釈を決定します(例えば、クライオFLMまたはFIB / SEMをチェックすることにより、以下を参照)。しかし、懸濁液中で増殖したほとんどの細胞では、1 μmの基準ビーズの最終濃度が~1 x 10⁵ ビーズ/μL(ストックから1:20希釈、詳細は 材料表 を参照)が良好な出発点であることが証明されています。
   3. 付着培養を使用する場合は、無菌培養のためにUV放射を使用してグリッドをプラズマ洗浄および滅菌します。必要に応じて、細胞接着を助ける化合物(例えば、ポリ-l-リジン、フィブロネクチン、ラミニン;ステップ1.2.2を参照)でグリッドをプレコートする。通常の培養皿またはグリッドの細分化された皿のグリッド上に細胞を播種して成長させます。
   4. 実験に必要なサンプルを処理し、急降下凍結するまで細胞を最適な状態に維持します(例:HEK/HeLaの場合は37°C/5%_CO2 )。培養皿からグリッドを慎重に取り外し、急落するピンセットに取り付けます。フィデューシャルを混合した培養液4 μL(1 μmフィデューシャルの場合は1 x 10⁵ ビーズ/μL)を細胞担持側に塗布します。
4. 手動または自動凍結手順を使用して細胞を急落凍結します。可能であれば、セルの反対側からグリッドのみを吸い取り、セルの機械的損傷を防ぎます(図2A)。両腕自動プランジシステムでは、セルに面したパッドに吸い取り紙の代わりにポリテトラフルオロエチレン(テフロンなど)シートを配置することでこれを実現します。グリッドを収納ボックスに移し、使用するまで液体窒素(lN₂)に保管します。
   注意: lN₂ およびその他の極低温物質は、目や皮膚に深刻な損傷を与える可能性があります。個人用保護具(PPE)を使用し、危険なN₂ 濃度の蓄積を避けるために、換気の良い場所でのみ作業してください。
   注:後続のすべてのステップは、下流の処理を複雑にする可能性があるため、セルおよびラメラ表面の汚染を避けるために、lN₂ の液相で実行するのが最適です。常にきれいな液体窒素(浮氷を除去するためのフィルターなど)を使用し、不要な移動ステップを排除し、可能であれば湿度が制御された環境で作業することにより、浮遊氷結晶との接触を減らします。
5. プランジ凍結グリッドをAutoGridsに取り付けてクリップし、カットアウトとセルを上に向けて(図2A)、その後のクライオ蛍光イメージングとFIBミリングを行います。TEM内のサンプルの適切な位置合わせを確保するには、フライス加工方向がクライオETチルト軸に直交している必要があります。したがって、この位置合わせを支援するために、クリッピングする前にオートグリッドにオリエンテーションマーク(レーザー彫刻や取り外し可能なマーカードットなど)を配置します(図2A)。
6. クライオFLMおよびFIB/SEMでグリッド品質(図2B)をスクリーニングします。 細胞密度、ブロッティング時間、および力を最適化して、細胞とビーズの均一な分布を取得します。クライオ蛍光顕微鏡で反射光イメージングを使用するか、クライオFIB-SEMを使用して、細胞と基準ビーズの両方がはっきりと見えることを確認します(図2B、白い矢印)。
7. 必要に応じて、細胞濃度やブロッティング時間を変化させるなど、より良い条件でプランジを繰り返します。適切なプランジパラメータが見つかったら、新しい実験ラウンドごとにグリッドスクリーニングを繰り返さないでください。

図2:SEMとIBを使用した適切なグリッドのスクリーニング(A)TEMへの正しいロードを簡素化するために、フライス加工方向に垂直なAutoGridにオリエンテーションマークを配置する必要があります。セルは、組み立てられたオートグリッドに上向きに取り付けられます。(B)プランジ凍結後、グリッドはSEMで検査され、プランジ条件を評価および最適化します:a)グリッドあたりのセルが多すぎてはいけません。たとえば、HeLa細胞の場合、1〜4セル/正方形を超えて使用しないでください。サッカロマイセス・セレビシエ(ここに示す)のようなより小さな細胞に対しては、4〜6個の細胞の塊が有用であることが見出されている。b)基準ビーズ(白い矢印)がはっきりと見えるようにし、細胞を取り囲むバッファーが多すぎないようにする必要があります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. クライオ蛍光光学顕微鏡

1. 各グリッドについて、(広視野)蛍光および微分干渉コントラスト(DIC)または反射モードで概要を取得し、蛍光信号を含む適切なグリッド正方形を選択します。対象のセルと十分な数の基準マーカー (6-12) の両方を含む視野を選択します。
   1. セルとビーズが均等に分布し、密度が高すぎず、各正方形の中心に向かっていることを確認します。FIB-SEMとTEM機器の両方にアクセス可能な正方形のみを選択し、200メッシュグリッドのグリッドエッジから少なくとも3つの正方形を選択します(図3A、赤い円の内側)。
2. 選択したグリッド正方形のそれぞれで、後のデコンボリューションに適したフォーカスステップ、つまり軸方向の分解能限界の<1/2を備えた蛍光スタックを取得します。可能であれば、高開口数(NA)対物レンズを使用して、フォトン数と位置特定の精度を高めます。
   1. NA 0.9対物レンズの共焦点顕微鏡で、ナイキスト値をオーバーサンプリングして300 nmステップサイズのスタックを取得します。必要に応じて、複数のカラースタックを記録します(図2B)。グリッドは、さらに使用するまでlN₂ の下に保管してください。
      注意: 最適なステップサイズを決定するには、顕微鏡制御ソフトウェアによって計算された値を選択するか、オンラインツール⁹を使用します。過度のブリードスルーは共局在実験に有害であるため、チャンネル間の信号のブリードスルーを確認してください。しかしながら、いくつかは、多色スタックにおける色収差を補正するのに有利な場合がある。
3. 適切なソフトウェア¹⁰、¹¹を使用してスタックをデコンボリューションし^、等方性ピクセルサイズが必要な場合は⁷つを再スライスします。デコンボリューションは、室温の場合と同様に、FLM信号をクリーンアップし、ローカリゼーションの精度を向上させる可能性があります(図3C)。

図3:FLMスタック取得のための正方形の選択とデコンボリューションによるデータの改善 。 (A)eGFP-Ede1(緑色)およびmCherry-Atg8(マゼンタ)を発現する酵母細胞をプランジしたグリッドの概要。ビーズとセルの分布が良好な位置を選択しますが、グリッドのエッジ(赤の網掛け)は避けてください。ボックスは、蛍光スタックが採取された細胞分布が良好な位置を示しています。(B)デコンボリューション後の黄色の四角形(Aから)で撮影されたマルチカラースタックの最大強度投影(MIP)。FLMスタックのデコンボリューションは、不要なバックグラウンド信号を大幅にクリーンアップし、デコンボリューション前(C)とデコンボリューション後(D)のガウスフィットから明らかなように、z内のビーズをより正確に局在化するのに役立ちます(フィットは3DCTで実行され、1でマークされたビードに対して示されています)。画像は、赤チャンネル(励起:552 nm、発光:585-650 nm)の拡大されたMIPビューを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. 集束イオンビームミリング

1. グリッドをクライオFIB-SEM装置にロードし、カットアウトおよび/またはオリエンテーションマークのいずれかを使用して、後でTEMに配置するための適切なオリエンテーションを確保します(図2A)。フライス加工方向がTEMの傾斜軸に垂直であることを確認してください。
2. ガス噴射システム(GIS;CpMePtMe₃)は、FIB-SEMセットアップによって事前に定義されたステージ位置で、グリッドを保護有機金属層でコーティングします。塗布しすぎると、後でTEMでの基準ビーズの局在化が妨げられる可能性があるため、適用しすぎないでください。プラズマコーターを使用して金属白金を塗布し、サンプルの帯電を減らします。
   注:GISコーティングの設定が利用できない場合は、短いコーティング(~2秒)を連続して実行し、その後にFIBフライス加工を行うことで簡単に見つけることができます。中電流(~100 pA)でも、ラメラエッジ周辺の保護有機金属層に明らかなフリンジがなく、サンプルが正常に切断できることを確認してください。GIS針の時間と距離(サンプルに対する)の両方が考慮すべき重要なパラメータです。GISニードルを室温設定(45°C)で操作するのではなく、できるだけ低温で操作して、均一なコーティング(25〜27°C)を提供します。
3. SEMグリッドオーバービューを記録し、FLMオーバービューとの2D相関を実行して、蛍光スタックが記録されているグリッド正方形を見つけます。両方のビューを手動で検査するか^、さまざまなソフトウェアパッケージ⁷、^10、12を使用してグリッドの正方形を見つけます。ここでは、ビュー間の等方性スケーリングを伴う3D剛体変換を使用する3D相関ツールボックス(3DCT)⁷に焦点を当てています。3DCT機能の優れたウォークスルーはオンラインで入手できます¹³。
   1. FLMとSEMの両方のグリッド概要(右クリック)で、少なくとも4つの対応する位置、たとえばグリッドバーやサポートフィルムの穴などのランドマークを選択してマークし、マークされたポイント間の変換を計算します(相関)。
   2. 次に、FLMスタックが取得された対応するグリッド正方形の中央にマーカーを配置し、SEMビューでの位置を予測します(相関; 図4A)。
4. 相関グリッドの正方形ごとに、選択したFIBミリング角度(10°プレチルトシャトルの場合は25°〜45°)で低電流(≤10 pA)イオンビーム(IB)画像を撮影します。蛍光データに一致する視野(位置と倍率)を選択します。200メッシュグリッドの場合、蛍光およびFIB/SEMデータを取得して、グリッドバーを含む単一のグリッド正方形を含めます(図3Aおよび図4Aを参照)。
   注:フライス加工は、クライオET中に大きな角度範囲を失うことを避け、十分な数の基準ビーズを識別できるように、できるだけ浅い角度で実行する必要があります。例:ステージチルトが17°、シャトルプリチルトが45°、FIBビームチルトが52°の場合、ラメラプレチルトは10°であり、多くのTEMクライオホルダーの最大である-50°から+70°まで傾けることにより、TEMの好ましい角度範囲±60°をほぼ満たします。
5. 同じ正方形のSEM画像を撮影して、蛍光およびイオンビームビューで対応するビーズの識別に役立てます。
6. デコンボリューションされた3D FLMスタックと各位置の2Dイオンビームビューの登録を、次の(図4B)手順で説明します。
   1. 対応するスライスされた3D FLMスタックとイオンビーム(IB)ビューを3DCTでロードします。
      注:マルチカラー蛍光データは、最大3つの個別のシングルチャンネルスタックファイルとしてロードできます。
   2. 蛍光データで4つの基準ビーズを選択し、位置リストを右クリックして、x、y、zの信号のガウスフィッティング を介して 3D位置を決定します。IB画像内の対応するビーズを選択し、初期3D相関(相関)を実行する。
   3. 蛍光画像にビーズを繰り返し追加し、3D位置を調整し、IBビューでの位置を予測して、見当合わせにビーズをすばやく追加し、相関の精度を確認します。3DCTでは、^{相関の一貫性}を評価するために二乗平均平方根誤差(RMSE)値が提供されます7。
      1. RMSE値が小さく、局在化精度(~300 nm)のオーダーであることを確認してください。相関の精度を判断するには、蛍光ビームとイオンビームの両方で明確に識別できる基準ビーズを意図的に除外します。これを行うには、イオンビーム画像内の予測位置と実際の位置を確認します。予測位置が実際の位置と大きく異なる場合は、新しい指標セットを使用して初期相関を繰り返します。
         注:6〜8個のビーズを相関させることで、FLMスタックとIBビューを正確に登録するのに十分であることが証明されています。ただし、広範囲のz値に対して指標(最大12〜15)を追加すると(たとえば、グリッドバーまたは隣接する正方形でビーズを選択するなど)、相関の精度が向上する可能性があります。
   4. ターゲットセルラー信号を選択し、FLMスタックに3D位置を適合させ、変換を適用してIBビューでターゲット位置を予測します(図4B)。
      注:FLMポジションリストのエントリで、IBリストに対応するものがないエントリは、予測されるシグナルとして扱われます。
7. 相関する各正方形について、関心のある特徴の予測位置をFIB-SEM装置に転送し、ラメラミリングパターンを配置します(図4C)。手動で位置を転送するか(たとえば、セルや基準ビーズなどの目に見えるランドマークまでの距離を測定することによって)、またはSerialFIB¹⁴などに実装されている自動化とスクリプトを使用します。セルごとに複数の信号がある場合は、スループットを向上させるために、同じラメラにできるだけ多くの関心ポイント(POI)が含まれるようにパターンを配置します。
8. 最初に粗く、次にラメラを最終厚さ150〜250nmに微細に粉砕します。ラメラのたるみを引き起こし、以前に取得したFLMスタックに対して関心のある実際の特徴が移動するステップ(応力緩和カット¹⁵など)は避けてください。手動³または自動^14,16,17,18 FIBフライス盤手順のいずれかを使用します。どちらの方法でも、ラメラを上下から対称的に薄くすることにより、目的のフィーチャがラメラの中心に残るようにします。
9. 各ラメラのフライス加工の精度を評価するには、手順3.4と同じレジストレーションを実行します。ただし、今回は、FIBミリング後の最終的なIB画像を使用して、関心のある特徴の予測位置が最終ラメラ内に含まれているかどうかを確認します。あるいは、3DCTの出力とカスタムスクリプト¹⁹から得られたFLMスタックの回転投影を、最終的なIB画像(図4C、小さなインサート)と重ね合わせる。

図4:3D相関FIBフライス加工手順 。 (A)グリッドのFLM(左)とSEM(右)の概要の2D-2D相関を使用して、蛍光スタックが以前に取得されたグリッドの正方形を特定します。(B)選択した各正方形について、3DCT(色付きのボックス)内の対応する基準位置を3D-2D登録した後、FLMデータで目的の生物学的特徴の位置を選択します。イオンビーム画像(赤い円)における対応する位置の予測に基づいて、ラメラ調製のための部位が選択される。(C)走査型電子顕微鏡(SEM)およびイオンビーム(IB)画像を使用して、フライス加工中にターゲットを中央に保ちます。150〜250nmの最終厚さは、さらなる下流処理に適していることがわかっています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. 相関TEM

1. グリッドをTEMにロードし、ラメラの向き(切り欠きまたは向きのマークから明らかなように)が傾斜軸に垂直であることを確認します。
   注:異なるメーカーの顕微鏡は、Tomo5、TOM、SerialEM²⁰などのさまざまなソフトウェアを使用して制御できます。ここでは、後者に焦点が当てられています。
2. ラメラを含む各グリッド正方形のグリッドモンタージュと概要を取得します。倍率と露光時間が、総電子線量を大幅に増加させることなく、TEM画像内の基準ビーズを視覚化するのに適していることを確認してください。各ラメラの高解像度TEMマップ(モンタージュ)を取得します。
3. レジスタと3D-2Dは、FLMスタックをTEMグリッドの正方形および3DCTのラメラオーバービューと相関させます。ステップ3.6で説明したのと同じ手順で、蛍光画像(x、y、z-ガウスフィット)および透過型電子顕微鏡画像内の対応するビード位置を選択します。次に、FLMチャンネルで関心のある位置を選択し、TEM概要に転送します。必要に応じて、FLMと低倍率TEMの間の第1の相関と、低倍率TEMから高倍率TEMへの第2の相関を含む2段階の手順を使用します(図5)。
4. 手動で(ランドマークまでの距離を測定する)、SerialEM²⁰内で利用可能な登録およびマップツール、またはCorRelator²¹などの外部ソフトウェアのいずれかで位置を転送します。
5. 相関位置でチルトシリーズをセットアップして実行します。適切な倍率、焦点ぼけ、および総線量を使用してください(詳細については、 材料の 表と 表1 を参照してください)。ラメラによって決定されたプレチルトで取得を開始し(ステップ3.4の注記も参照)、用量対称チルトスキーム²²を使用する。手動取得またはバッチ取得のいずれかを使用します。

図5:TEMにおける相関位置の局在化。 3D相関FIBミリングと透過型電子顕微鏡への転写が成功した後、FLMスタック内の基準ビーズ(色付きのボックス)とTEMの概要の間の各ミルされた正方形に対して3D-2Dレジストレーションが実行され、クライオET(赤い円)の潜在的なサイトが特定されます。その後、より高い倍率のラメラオーバービュー(ズームイン)を取得して、断層撮影をより正確に設定できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

このプロトコルは、EHドメインを含むエンドサイトーシスタンパク質1(Ede1)依存性エンドサイトーシスタンパク質沈着(END)と、オートファジー小体^におけるその分解およびトラップを発見するために使用されるパイプラインのウォークスルーを提供します8。ENDは 、S. cerevisiaeの液液相分離コンパートメントであり、エンドサイトーシスイベントが失敗した後のクラスリン媒介エンドサイトーシス(CME)に関与するさまざまなタンパク質をバッファーします。その主要成分の1つはEde1であり、CME成分として、またこの新しいLLPSコンパートメントの分解のための選択的オートファジー受容体としても機能します。そこで、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)プロモーターの制御下にあるEde1(EGFP-Ede1)のEGFP融合体を用いて、Ede1の過剰発現はエンドサイトーシスの初期段階を妨害し、したがって構成的にLLPSを誘導するため、ENDを可視化した。

EGFP-Ede1過剰発現酵母細胞および1μm基準マーカーを有するプランジ凍結グリッド上で、GFPチャネルにおけるFLMスタック取得のために5つの位置を選択しました(図6A;TFSコアサイト;共焦点モード、300 nmフォーカスステップサイズ、10 μm範囲)。グリッドをFIB装置(Quanta 3D FEG)に移し、蛍光とSEMグリッドの概要の2D-2D相関を実行することによって、FLMスタックが取得されたグリッド正方形を特定しました(ステップ3.2を比較します)。

選択した各正方形について、イオンビーム画像を低電流(10pA、1200倍の倍率)で撮影し、対応する基準位置を3DCTに登録しました。目的の生物学的特徴を持つ位置を選択し、FLMスタック内の3D位置に適合させた後、見つかった形質転換を推定END位置に適用し、ラメラ調製部位を選択しました(図6B)。グリッド表面に対して11°傾斜したFIBビームは、ここに示す例(45°FIBシャトルプレチルト、18°ステージチルト)で使用されました。関心のある位置を転送し、FIB画像内の目立つランドマーク(穴、氷の汚染、基準ビーズなど)に対する予測位置の距離を測定することにより、FIBパターンを手動で描画しました(図6D)。位置合わせの精度は、FLMおよびIB画像で明確に識別できるビーズを意図的に除外し、イオンビームビューで実際の位置と予測された位置を比較することによって評価されました(たとえば、 図6B、Cのダイヤモンド)。 図6C に示す正方形の相関は正確であることがわかった(すなわち、FLMビーズ位置の予測位置は、対応するIB位置と完全に一致し、3DCTは登録のためにサブピクセルRMSE値を報告した)。したがって、ラメラは予測された位置(サイトB)で切断され、~200nmの厚さ(最終パターンオフセット)に微細に粉砕されました。

図6:酵母におけるエンドサイトーシスタンパク質沈着物(END)の3D相関ターゲティングの代表的な結果。 (A)フライス加工前のグリッドのSEM概要。色付きのボックスは、蛍光スタックが事前に取得されたグリッドの正方形を示します。(B-C)グリッド正方形の3D相関。FLMデータ(B、ここでは最大強度投影として示されている)とイオンビーム画像(C)にいくつかの対応する基準ビーズ(色付きのボックス)を登録した後、ダイヤモンドで示されたビーズの位置を予測することによって3Dレジストレーションの精度を検証しました。次に、ターゲット信号の位置(赤い円)を、2つの潜在的なミリングサイトのイオンビームビューで予測しました。(D)3つのターゲット点状突起(赤い円)と初期ミリングパターン(黄色のボックス)の予測位置を示すサイトBの拡大。4番目の蛍光点状点は、他の点状突起よりもはるかに低いため、粉砕中に標的とされないと予測されました(灰色の円)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

FIBミリングとグリッドのクライオ透過電子顕微鏡への転送に成功した後(Titan Kriosは300 kVで動作し、Gatan K2直接電子検出器と生体量子エネルギーフィルターを装備)、グリッドの概要がSerialEMに記録され、ラメラのある正方形を見つけるために使用されました。各ラメラについて概観画像を取得し、対応する基準ビーズを用いてFLMデータを3DCT(3D-2D)に登録した。次に、関心のある生物学的特徴の位置(図7A)を、基準ビーズから計算された変換を使用して予測しました。より高い倍率で記録されたラメラの概観はステッチされ、関心のあるサイトははっきりと見えるランドマーク(例えば、基準ビーズ)を使用して相関しました。あるいは、古典的なCLEM概要を様々なソフトウェア^10、12で作成することができる。

相関関係に基づいて、 図7Aに示すラメラについて、断層撮影のための4つの潜在的な部位が見出された。ただし、これには、3D相関FIBミリング中にターゲットとされなかった位置(図 6D、灰色の円を比較)と、氷の汚染によってブロックされた位置(図7、灰色のボックス)も含まれます。したがって、断層撮影は2つの位置についてしか記録できませんでした(図7B)。全体として、~75%の相関の成功、すなわち、TEMおよびEND構造への移行を生き延びたラメラが予測部位で見出され、達成された(12の相関部位)。断層撮影の再構築、セグメンテーション、テンプレートマッチングの後、個々のEND構造をネイティブコンテキスト内で視覚化できます(図7C、D)。これには、ENDを取り囲む開窓した小胞体(ER)、時折接触する脂肪滴、およびLLPSコンパートメントから除外されるリボソームが含まれます。まとめると、これは、3D相関FIBミリングが無傷の細胞からのまれな生物学的プロセスの分子レベルの情報をどのように提供できるかを示しています。

図7:クライオETでENDを可視化した代表的な結果。 (A)図6に示す粉砕部位の低倍率TEM概要は、FLM最大強度投影(図6B)と容易に相関して、目的の生物学的特徴を局在化させることができます(赤い十字)。(B)第2ステップでは、より高い倍率(ステッチ)ビューを相関させることができ、断層撮影のための位置(黄色のボックス)が設定されます。面外信号に起因する位置(灰色のボックス、図6Dと比較)は無視されました。(C-D)この3D相関FIBアプローチを使用すると、エンドサイトーシスタンパク質沈着(END)を天然環境で視覚化できます。小胞体(ER)、リボソーム、膜、脂肪滴などの構造を同定し、可視化することができる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:テスト済み機器と推奨設定のリスト。

1.プロトコルの重要なステップ

細胞培養とグリッドプランジパラメータの最適化は、このワークフローの基本です。プロジェクトの開始時には、タグ付け戦略、細胞と基準ビーズの分布を最適化し、さまざまなグリッド調製とブロッティングパラメーターをテストするために時間を費やす価値があります。最適にプランジ凍結したサンプルを使用すると、下流の処理が大幅に容易になります。

TEM実験に関しては、硝子体サンプルが必要です。HeLaのような大型哺乳類細胞の場合、1グリッド四方あたり1〜2細胞が好ましいが、細胞は依然として高密度で硝子体であり得る。任意選択で、哺乳類細胞(例えば、HEK293、HeLa)において、2.5〜10%(v/v)グリセロールを培地に添加してインキュベートすることにより、²³を急落させる10分間前にガラス化を改善することができる。利用可能な場合、グリッドパターニングを使用して、細胞の完全な配置および分布を確保し、それによってガラス化および後の相関を改善することができる²⁴。

ワークフロー中に特定の細胞を選択することもできますが、目的の生物学的特徴を示す細胞が少なすぎると、全体的なスループットが大幅に低下します。POI陽性細胞の相関を改善するには、十分に明るい蛍光色素を使用する必要があります。これは、内因性発現レベルで特に重要です。クライオ条件下では、mVenusは輝度の増加²⁵ とヒプソクロミックシフトによりEGFPよりも優れたパフォーマンスを発揮し、クライオ条件下での標準的なGFPフィルターのセットアップに適していることがわかりました²⁶。非点状ターゲット構造の場合、波長と局在精度(アッベ回折限界)の間のトレードオフも考慮する必要があります。

効率的な3D相関には、グリッドが機械的に安定しており、細心の注意を払って取り扱われることも必要です。カーボンサポートを備えた標準的な金または銅グリッドを使用できますが、プロジェクトによっては、より剛性の高いSiO₂ フィルムを使用することで成功率が大幅に向上する可能性があります。しかし、(a)機械的安定性、または(b)クライオシワ²⁷を低減するための熱膨張係数のマッチングが、3D相関を成功させるための最も重要な要因であるかどうかはまだ決定的ではありません。また、壊れやすいAu格子をピックアップするために、ポリジメチルシロキサン被覆ディ^{ッシュを用いてもよい}5。

サンプルの安定性を確保することに加えて、FIBミリング中の最適なターゲティングに適した高品質の蛍光スタックを取得するには、FLMイメージングパラメータを慎重に選択する必要があります。この点に関して、FLMデータに対して異なるノイズ除去²⁸ またはデコンボリューション技術をテストすることも、基準およびセルラー信号の局在化を大幅に改善する可能性があるため、推奨されます。蛍光シグナルをFIB-SEM画像と相関させる場合、基準ビーズの良好なサンプリングが重要です。それらはセルの周りによく分布し、おそらく異なるz高さにあるはずです。また、意図的に基準モデルから除外されたが、目で明確に相関できるビーズの予測位置と実際の位置を確認して、相関の一貫性を検証することもお勧めします。登録の一貫性をチェックするために、3DCTのRMSE値も常に考慮する必要があります。

FIB-SEMチャンバーからの粉砕材料と残留水の堆積(すなわち、再汚染)は、その両側に非晶質材料を添加することによって有効ラメラの厚さを増加させるので、微細に粉砕されたラメラを顕微鏡に長時間保持すると、一般に、追加の電子散乱イベントのためにTEMデータの品質が低下します。したがって、フライス加工はほとんどの場合、2段階方式で行われます:最初に、すべての位置が大まかに(すなわち、約800nmまで)、次に細かく(~150-250nmまで)フライス加工され、最後のラメラが完了した後、グリッドがすぐにアンロードされます。ただし、対象位置をサイトごとに処理することで、曲げや変形の時間がなくなるため、同じラメラで荒削りと微細フライス加工を次々に直接実行することで、より良い相関の成功を達成できます。ただし、これにより、システムの再汚染率に応じて、グリッドごとに生成できるラメラの最大数が減少します。20 nm / hの速度の場合、1〜1.5時間以内に4〜6個のラメラが生成されます。

グリッド全体または粗粉砕ラメラ>300 nm)を移動すると、相関が不十分または失敗します(以下で説明する制限も参照)。したがって、FIBミリングの前、最中、および後にIB画像を比較するなどして、定期的にチェックする必要があります。大きな動き(>300 nm)を示す部位は廃棄する必要があります。サンプル調製(グリッドタイプ、セル密度、プランジパラメータの選択、プロトコルセクション1を参照)とミリング戦略を最適化して、これらの動きを回避します。ラメラの曲げは、ステップ3.6で説明したようにサイトワイズミリングを行い、ラメラ幅を小さくすることで大幅に減らすことができます。前述したように、応力緩和カット¹⁵ はラメラ曲げを低減するように設計されているが、それらはしばしば脱結合ラメラの協調運動をもたらし、それによって相関を効果的に防止する。この問題を解決するために、統合されたFLMシステムを使用できます。

2.メソッドの変更とトラブル

クライオ条件に移行する前に、生細胞イメージングでサンプルの徹底的な特性評価を行うことを強くお勧めします。細胞サンプル、処理スキームを最適化し、クライオワークフローに入る前にどのようなシグナルが予想されるかを知ることで、成功率を大幅に向上させることができます。

ここに示すワークフローでは、クライオステージを備えたスタンドアロンの蛍光顕微鏡を使用してサンプルを画像化し、続いてグリッドを集束イオンビーム顕微鏡に移します。ただし、蛍光顕微鏡がFIB-SEMチャンバーに組み込まれているシステムでテストされているため、蛍光画像を取得するためにサンプルの移動は必要ありません²⁹、^30、31。このような統合システムを使用して、FIBミリング中およびFIBミリング後に関心のある位置を画像化して、最終的なラメラを汚染するリスクを高めることなく、ターゲット蛍光シグナルの存在を確認することができます。ただし、NAの低い対物レンズは、基準ビーズとターゲット信号を局在化できる精度を制限するため、使用する顕微鏡の光学パラメータに留意することが重要です。それにもかかわらず、統合されたFLMセットアップは、FLMスタックを継続的に更新し、最新のSEMおよびIBビューと比較できるため、グリッドとラメラのわずかな変形にもより適切に対処するのに役立ちます。

FIBミリングとTEMデータ取得との間のラメラの蛍光イメージングの代替として、TEM後の相関を使用して、ラメラ^5,6の正しい配置およびミリングを検証することができる。

相関ワークフローのすべてのステップ、特にTEM中は、FIB-SEM/TEM画像上に投影された蛍光データのオーバーレイを作成することをお勧めします。このような古典的なCLEMビューは、細胞のどの部分がラメラ内に含まれているかをより直感的に理解するのに役立ちます。これは、相関関係の精度を検証するための有用な健全性チェックとしても機能します。

3.メソッドの制限

3D相関FIBアプローチでは、基準ビーズを供給できるサンプルが必要です。したがって、この方法は現在、プランジ凍結グリッドに限定されています。高圧(HPF)凍結(組織)サンプルの場合、現在、2D-2D相関のみを実行できます。潜在的に、内部基準マーカー(例えば、細胞小器官、染色された脂肪滴)は、この問題に対する解決策となり得る^32、33。最終的な相関の成功率は、サンプルの品質、蛍光顕微鏡のセットアップ、ラメラの厚さ、ターゲット構造のサイズなど、多くの要因によって異なります。記載された3Dレジストレーションアプローチを用いた相関精度は、最終的なIB画像上で200〜300nmの範囲にあると推定され、FIBミルドラメラ⁷の典型的な厚さにほぼ対応する。したがって、これよりもはるかに小さい細胞構造は、現時点では標的にすることは困難である。さらに、フライス加工部位(>300 nm)での過度の動きは相関の精度も低下させますが、この問題はFIB/SEM装置に統合されたFLMセットアップで対処できる可能性があります。フライス加工中に強い変形または曲げを示すラメラは、いずれの場合も、下流のワークフローから除外する必要があります。

全体として、クライオ蛍光イメージングは現在、アッベ回折基準によって制限されています。超分解クライオFLM法のより日常的な応用(および商品化)により、特にオンザフライ操作のためにFIB / SEMに統合された場合、細胞構造のより正確なターゲティングが可能になる可能性があります。

4.方法の意義

特に、非ターゲットおよび事後相関技術と比較して、3D相関FIBミリングアプローチにより、時間とリソースを消費するTEMステップの前に適切な位置を選択できます。これにより、より効率的なデータ収集とプロジェクト計画が可能になります。さらに、相関蛍光データは、トモグラムの解釈や、特に非構造化タンパク質アセンブリやテンプレートマッチングやサブトモグラム平均化には小さすぎるタンパク質アセンブリを扱う場合に、マルチスケールプロジェクトでクライオETの結果を統合するために重要な情報の層を追加します。

5. 重要性と将来の応用の可能性

HPFサンプル^34,35からのクライオリフト、クライオFIB-SEMボリューム36、超解像蛍光イメージング^26,37,38,39などの高度なワークフローと組み合わせることで、^3Dターゲットラメラ調製は、単離された細胞内の生物学的プロセスを解剖するだけでなく、組織および患者のサンプルをFIBミリングおよびクライオ電子線トモグラフィーに利用できるようにする見通しを提供します。そのため、高解像度での病理学的プロセスの解剖を可能にし、ナノスケールでの生検に向けた不可欠な構成要素となります。

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