Preparazione del campione mediante fresatura a fascio ionico focalizzato correlativo 3D per la tomografia crioelettronica ad alta risoluzione

Qui, presentiamo una pipeline per la fresatura di fasci ionici focalizzati correlativi 3D sulla guida della preparazione di campioni cellulari per la tomografia crioelettronica. La posizione 3D delle proteine di interesse marcate con fluorescenza viene prima determinata mediante microscopia a criofluorescenza e quindi mirata per la fresatura. Il protocollo è adatto per cellule di mammiferi, lieviti e batteri.

La tomografia crioelettronica (cryo-ET) è diventata il metodo di scelta per studiare l'ultrastruttura cellulare e i complessi molecolari nel loro stato nativo e congelato-idratato. Tuttavia, la crio-ET richiede che i campioni siano abbastanza sottili da non disperdere o bloccare il fascio di elettroni incidente. Per i campioni cellulari spessi, ciò può essere ottenuto mediante fresatura a fascio ionico criofocalizzato (FIB). Questo protocollo descrive come mirare a siti cellulari specifici durante la fresatura FIB utilizzando un approccio correlativo 3D, che combina i dati tridimensionali della microscopia a fluorescenza con le informazioni provenienti dal microscopio elettronico a scansione FIB. Utilizzando questa tecnica, gli eventi e le strutture cellulari rari possono essere individuati con elevata precisione e visualizzati a risoluzione molecolare utilizzando la microscopia elettronica a criotrasmissione (cryo-TEM).

La fresatura a fascio ionico focalizzato consente la preparazione di campioni biologici sottili da campioni criofissati senza i problemi comunemente associati ai sezionamenti meccanici come segni di coltello e artefatti di compressione¹. Se abbinata alla tomografia crioelettronica, la fresatura FIB consente studi biologici ad alta risoluzione della morfologia cellulare e la determinazione della struttura di complessi macromolecolari direttamente dall'interno delle cellule con risoluzione sub-nanometrica ^2,3,4. Mentre specie abbondanti, come i ribosomi, si trovano facilmente nelle lamelle FIB tagliate in modo casuale, molti processi cellulari si basano sulla colocalizzazione di diversi complessi o sono localizzati in siti specifici all'interno della cellula. Di conseguenza, è necessario un targeting efficiente per non perdere la caratteristica biologica di interesse durante il processo di macinazione ed essere limitato a colpi casuali. È quindi necessario un approccio correlato che combini i dati del microscopio elettronico a scansione (SEM)-FIB e di un microscopio ottico a criofluorescenza (FLM). Mentre è possibile omettere la correlazione iniziale e combinare i dati FLM e cryo-ET solo dopo l'acquisizione TEM^5,6, la fresatura a fascio ionico focalizzato guidata dalla fluorescenza consente una selezione accurata dell'area di fresatura in anticipo^, con conseguente acquisizione dei dati più efficiente. Sin dalla sua concezione⁷, l'applicazione della macinazione FIB correlata 3D negli studi biologici è stata limitata fino a quando non abbiamo recentemente riferito di aver identificato un nuovo compartimento separato-fase liquido-liquido (LLPS) nel lievito utilizzando questa tecnica⁸.

Qui è descritto un protocollo di microscopia ottica ed elettronica 3D 3D correlato (CLEM), che può essere utilizzato per studiare un'ampia varietà di campioni che vanno dai batteri ai lieviti e alle cellule di mammifero. Sebbene gli esperimenti siano stati eseguiti utilizzando un certo set di strumenti, i singoli passaggi non sono vincolati a un hardware specifico e possono essere facilmente trasferiti ad altri sistemi come estensione dei protocolli esistenti ^3,5. Un elenco delle apparecchiature testate e delle impostazioni suggerite sono fornite nella Tabella dei materiali e nella Tabella 1. Le quattro fasi chiave della pipeline sono (1) la preparazione del campione, (2) la localizzazione delle caratteristiche di interesse mediante microscopia a criofluorescenza, (3) la fresatura di fasci ionici focalizzati correlati in 3D e (4) la localizzazione delle strutture mirate per l'acquisizione dei dati cryo-ET sulle lamelle nel microscopio elettronico a crio-trasmissione (Figura 1).

Figura 1: Riepilogo del flusso di lavoro con una selezione di passaggi critici. L'intero protocollo è suddiviso in quattro fasi a seconda dell'attrezzatura utilizzata: preparazione del campione, compreso il congelamento a immersione, microscopia a criofluorescenza, fresatura a fascio ionico criofocalizzato e microscopia crioelettronica. Per ogni passaggio vengono evidenziati diversi punti chiave. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Coltura cellulare e surgelazione a immersione delle griglie

1. Coltiva le cellule di scelta e ottimizza le strategie di etichettatura e trattamento a temperatura ambiente prima di passare ai crio-esperimenti. I bersagli di interesse sono marcati utilizzando fusioni proteiche fluorescenti o colorazioni vive (ad esempio, Halo-Tag, LysoTracker, BODIPY, colorazione di anticorpi vivi, ecc.). Se è necessario un trattamento con agenti chimici o biologici (piccole molecole, terreni speciali, siRNA, ecc.) per studiare il processo biologico di interesse, ottimizzare le condizioni (ad esempio, tempo, concentrazione) utilizzando l'imaging FLM su cellule vive.
   1. Assicurarsi che i siti di interesse possano essere localizzati con successo sopra lo sfondo in un numero sufficiente di cellule utilizzando impostazioni di imaging che corrispondano il più possibile alle condizioni criogeniche successive (ad esempio, NA, tempo di esposizione, ecc.).
2. Selezione e preparazione delle griglie
   1. Selezionare le griglie con la dimensione e la spaziatura dei fori appropriate per le celle e i marcatori fiduciali utilizzati (vedere il passaggio 1.3.1). Non utilizzare una pellicola continua senza fori, in quanto ciò potrebbe causare una quantità eccessiva di tampone residuo dopo l'asciugatura e quindi ridurre l'efficienza della vetrificazione e ostacolare il rilevamento delle microsfere fiduciali. Per un contatto prolungato delle cellule con le griglie, assicurarsi che il supporto della griglia e il materiale del film siano biocompatibili.
   2. Pulisci al plasma le griglie crio-EM per renderle più idrofile. Per l'uso in colture cellulari aderenti, sterilizzare le griglie dopo la pulizia al plasma con radiazioni UV per 20 minuti in una cappa a flusso laminare. Facoltativamente, le griglie possono essere pretrattate con composti che aiutano l'adesione cellulare, come la poli-L-lisina o la concanavalina A, come descritto di seguito.
      NOTA: In generale, le seguenti combinazioni griglia/campione sono state utilizzate con successo nel flusso di lavoro crio-FIB correlativo: Lievito: Cu o Au, 200 mesh, film di carbonio R1/4 o SiO₂ , opzionalmente rivestito con concanavalina A; Escherichia coli: Cu o Au, 200 mesh, carbonio R1/4 o film SiO₂ ; Chlamydomonas reinhardtii: Cu o Au, 200 mesh, carbonio R1/2 o R1/4 o film SiO₂ ; HeLa: Au, 200 mesh, film R1/4 SiO₂ , rivestito con poli-L-lisina; HEK293: Au, 200 mesh, film R1/4 SiO₂ , rivestito con poli-L-lisina.
   3. Rivestimento di Concanavalina A per migliorare l'attaccamento delle cellule di lievito:
      • Preparare una soluzione di rivestimento di 1 mg/mL di concanavalina A in tampone HEPES da 10 mM con CaCl₁₀₀ μM 2, pH 8,5. Posizionare separatamente una goccia (50 μL) della soluzione di rivestimento e due gocce di acqua distillata su un pezzo di pellicola di paraffina.
      • Prelevare la griglia pulita al plasma con una pinzetta a forza inversa e inserirla con cautela nella goccia della soluzione di rivestimento, evitando movimenti perpendicolari alla griglia per evitare danni alla pellicola.
      • Dopo ~5 s di incubazione, lavare la griglia due volte inserendola nelle gocce d'acqua in modo simile. Infine, asciuga il liquido in eccesso applicando una carta da filtro sul retro della griglia e lascia asciugare completamente la griglia prima di rilasciarla dalle pinzette. Utilizzare le griglie essiccate per la surgelazione.
   4. Rivestimento in poli-L-lisina per colture in sospensione e cellule aderenti:
      • Preparare una soluzione di rivestimento di 1 mg/mL di poli-L-lisina in tampone borato di sodio 0,1 M, pH 8,5.
      • Posizionare le griglie pulite al plasma in un piatto adatto per la coltura cellulare e sterilizzare per 20 minuti con radiazioni UV.
      • Aggiungere delicatamente una soluzione di rivestimento sufficiente a coprire tutte le griglie e incubare a 37 °C per almeno 2 ore. Aspirare il liquido e lavare delicatamente le griglie due volte con PBS prima di seminare le cellule alla concentrazione desiderata.
3. Preparazione di cellule e perline fiduciali
   NOTA: Le perle fiduciali sono necessarie per la registrazione 3D dei dati di fluorescenza con immagini scattate al microscopio FIB/SEM per consentire la fresatura FIB correlativa 3D.
   1. Scegliere microsfere riconoscibili in tutte le modalità di imaging, ad esempio FLM, SEM e IB (diametro consigliato 0,5-1 μm), ma assicurarsi che non eclissino la struttura del bersaglio cellulare durante l'imaging a fluorescenza per facilitare la differenziazione delle perle e della caratteristica biologica di interesse. Rimuovere i conservanti citotossici nelle perle fiduciali (ad es. NaN₃) come indicato dal produttore.
      NOTA: Per una più facile distinzione tra le caratteristiche biologiche di interesse e i fiduciali, è utile se gli spettri di emissione della fluorescenza si sovrappongono solo parzialmente in modo che i segnali possano essere distinti in base alle differenze di intensità nei canali FLM.
   2. Se si utilizza la coltura in sospensione, far crescere le cellule a una densità adeguata (ad esempio, lievito OD 600 = 0,8, E. coli OD 600 = 0,8-1,0, C. reinhardtii ₁₅₀₀ cellule/μL) ed eseguire i trattamenti richiesti per l'esperimento, come il cambio di terreno, l'aggiunta di sostanze chimiche, la fame, ecc. Fissare le griglie pulite al plasma alle pinzette come richiesto per il metodo di immersione (manuale/automatico) e applicare 4 μL di sospensione cellulare miscelata con ~1 x 10⁵ perline/μL di sospensione di microsfere fiduciali sul lato del film delle griglie.
      NOTA: Determinare la diluizione ottimale delle cellule e dei fiduciali negli esperimenti di titolazione (ad esempio, controllando il cryo-FLM o il FIB/SEM, vedere di seguito). Tuttavia, per la maggior parte delle cellule coltivate in sospensione, una concentrazione finale di ~1 x 10⁵ perline/μL delle perle fiduciali da 1 μm (diluizione 1:20 dallo stock; vedere la tabella dei materiali per i dettagli) si è dimostrata un buon punto di partenza.
   3. Se si utilizza una coltura aderente, pulire al plasma e sterilizzare le griglie utilizzando i raggi UV per la coltura asettica. Se necessario, pre-rivestire le griglie con composti che aiutano l'adesione cellulare (ad esempio, poli-l-lisina, fibronectina, laminina; vedere il passaggio 1.2.2). Semina e coltiva le cellule sulle griglie in piastre di coltura normali o in piastre con suddivisioni per griglie.
   4. Trattare i campioni secondo necessità per l'esperimento e mantenere le cellule in condizioni ottimali fino al congelamento a immersione (ad esempio, 37 °C/5% di CO₂ per HEK/HeLa). Rimuovere con cautela le griglie dalla piastra di coltura e attaccarle alle pinzette a immersione. Applicare 4 μL del terreno di coltura miscelato con fiduciali (1 x 10⁵ beads/μL per fiduciali da 1 μm) sul lato portante della cellula.
4. Congelare a tuffo le cellule utilizzando una procedura di congelamento manuale o automatizzata. Se possibile, tamponare la griglia solo dal lato opposto alle celle per evitare di danneggiarle meccanicamente (Figura 2A). Sui sistemi di immersione automatizzati a due bracci, ottenere questo risultato posizionando un foglio di politetrafluoroetilene (ad es. Teflon) invece di carta assorbente sul tampone rivolto verso le celle. Trasferire le griglie in contenitori di stoccaggio e conservarle in azoto liquido (lN₂ ) fino all'utilizzo.
   ATTENZIONE: lN₂ e altri criogeni possono causare gravi danni agli occhi e alla pelle. Utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) e lavorare solo in uno spazio ben ventilato per evitare l'accumulo di pericolose concentrazioni di N₂ .
   NOTA: Tutte le fasi successive devono essere eseguite al meglio nella fase liquida di lN₂ per evitare la contaminazione delle superfici della cella e delle lamelle, in quanto ciò potrebbe complicare la lavorazione a valle. Ridurre il contatto con i cristalli di ghiaccio galleggianti utilizzando sempre azoto liquido pulito (ad es. filtro per rimuovere il ghiaccio galleggiante), eliminando passaggi di trasferimento non necessari e, se possibile, lavorando in un ambiente a umidità controllata.
5. Montare e agganciare le griglie surgelate in AutoGrids con il ritaglio e le celle rivolte verso l'alto (Figura 2A) per la successiva imaging a criofluorescenza e la fresatura FIB. Per garantire il corretto allineamento dei campioni nel TEM, la direzione di fresatura deve essere ortogonale all'asse di inclinazione del crio-ET. Di conseguenza, posizionare i segni di orientamento (ad esempio, incisione LASER o punti di marcatura rimovibili) sulle griglie automatiche prima di ritagliare per facilitare l'allineamento (Figura 2A).
6. Eseguire lo screening della qualità della griglia (Figura 2B) sul crio-FLM e sul FIB/SEM. Ottimizza la densità cellulare, il tempo di blotting e la forza per ottenere una distribuzione uniforme di cellule e perline. Utilizzare l'imaging a luce riflessa su un microscopio a criofluorescenza o utilizzare il crio-FIB-SEM per assicurarsi che sia le cellule che le perle fiduciali siano chiaramente visibili (Figura 2B, frecce bianche).
7. Se necessario, ripetere l'immersione in condizioni migliori, ad esempio variando la concentrazione cellulare e/o il tempo di tamponamento. Una volta individuati i parametri di immersione adatti, non ripetere lo screening della griglia per ogni nuovo ciclo di esperimenti.

Figura 2: Screening delle griglie adatte utilizzando SEM e IB. (A) I segni di orientamento devono essere posizionati sulle griglie automatiche perpendicolarmente alla direzione di fresatura per semplificare il corretto caricamento nel TEM. Le celle sono montate rivolte verso l'alto nell'AutoGrid assemblato. (B) Dopo il surgelazione, le griglie vengono ispezionate nel SEM per valutare e ottimizzare le condizioni di immersione: a) Non dovrebbero esserci troppe celle per griglia. Per le celle HeLa, ad esempio, non utilizzare più di 1-4 celle/quadrato. Per le cellule più piccole come Saccharomyces cerevisiae (mostrato qui), sono stati trovati utili gruppi di 4-6 cellule. b) Le perline fiduciali (frecce bianche) devono essere chiaramente visibili e non deve esserci troppo tampone intorno alle cellule. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Microscopia ottica a criofluorescenza

1. Per ogni griglia, acquisire una panoramica in fluorescenza (a campo largo) e contrasto di interferenza differenziale (DIC) o modalità riflessa e selezionare i quadrati della griglia adatti con segnale di fluorescenza. Scegliere campi visivi che contengano sia le celle di interesse che un numero sufficiente di marcatori fiduciali (6-12).
   1. Assicurati che le celle e le perline siano distribuite uniformemente, non troppo dense e verso il centro di ogni quadrato. Scegliere solo i quadrati accessibili sia allo strumento FIB-SEM che a quello TEM, quindi quelli ad almeno tre quadrati di distanza dal bordo della griglia su griglie a 200 mesh (Figura 3A, all'interno del cerchio rosso).
2. Su ciascuno dei quadrati della griglia selezionati, acquisire una pila fluorescente con un passo di messa a fuoco appropriato per la successiva deconvoluzione, cioè <1/2 del limite di risoluzione assiale. Se possibile, utilizzare obiettivi ad alta apertura numerica (NA) per aumentare il numero di fotoni e l'accuratezza della localizzazione.
   1. In un microscopio confocale con obiettivo NA 0,9, acquisire pile con passo di 300 nm, sovracampionando il valore di Nyquist. Se necessario, registrare più pile di colori (Figura 2B). Conservare le griglie sotto lN₂ fino a nuovo utilizzo.
      NOTA: Per determinare la dimensione ottimale del passo, scegliere i valori calcolati dal software di controllo del microscopio o utilizzare gli strumenti online⁹. Verificare la presenza di bleed-through del segnale tra i canali, poiché un eccessivo bleed-through è dannoso per gli esperimenti di colocalizzazione. Tuttavia, alcuni possono essere vantaggiosi per correggere le aberrazioni cromatiche nelle pile multicolore.
3. Deconvolvi gli stack utilizzando il software^{appropriato 10,11} e ri-tagliali⁷ se è richiesta una dimensione isotropa dei pixel. La deconvoluzione, proprio come a temperatura ambiente, pulisce il segnale FLM e può migliorare l'accuratezza della localizzazione (Figura 3C).

Figura 3: Selezione dei quadrati per l'acquisizione dello stack FLM e miglioramento dei dati mediante deconvoluzione. (A) Panoramica di una griglia immersa con cellule di lievito che esprimono eGFP-Ede1 (verde) e mCherry-Atg8 (magenta). Scegli posizioni con una buona distribuzione di perline e celle, ma evita i bordi della griglia (ombreggiati in rosso). Le caselle indicano le posizioni con una buona distribuzione delle celle in cui sono state prelevate le pile di fluorescenza. (B) Proiezione di massima intensità (MIP) della pila multicolore presa sul quadrato con riquadro giallo (da A) dopo la deconvoluzione. La deconvoluzione delle pile FLM ripulisce in modo significativo i segnali di fondo indesiderati e aiuta a localizzare le perline in z in modo più accurato, come risulta evidente dagli accoppiamenti gaussiani prima (C) e dopo la deconvoluzione (D) (gli accoppiamenti sono stati eseguiti in 3DCT e sono mostrati per il cordone contrassegnato con 1). Le immagini mostrano viste MIP ingrandite del canale rosso (eccitazione: 552 nm, emissione: 585-650 nm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Fresatura a fascio ionico focalizzato

1. Caricare le griglie nello strumento crio-FIB-SEM e utilizzare il ritaglio e/o i segni di orientamento per garantire il corretto orientamento per il successivo posizionamento nel TEM (Figura 2A). Assicurarsi che la direzione di fresatura sia perpendicolare all'asse di inclinazione del TEM.
2. Utilizzare un sistema di iniezione di gas (GIS; CpMePtMe₃) nelle posizioni dello stadio predefinite dal setup FIB-SEM per rivestire le griglie con uno strato organometallico protettivo. Non applicare troppo, in quanto ciò potrebbe interferire con la localizzazione del cordone fiduciale nel TEM in un secondo momento. Utilizzare un rivestimento al plasma per applicare il platino metallico per ridurre il caricamento del campione.
   NOTA: Se non sono disponibili impostazioni per il rivestimento GIS, è possibile trovarle facilmente eseguendo cicli successivi di rivestimento breve (~2 s), seguiti dalla fresatura FIB. Assicurarsi che il campione possa ancora essere tagliato con successo a correnti medie (~100 pA) senza frange apparenti dello strato organometallico protettivo attorno ai bordi della lamella. Sia il tempo che la distanza dell'ago GIS (rispetto al campione) sono parametri importanti da considerare. Non utilizzare l'ago GIS a temperatura ambiente (ad es. 45 °C), ma il più freddo possibile per fornire comunque un rivestimento uniforme (25-27 °C).
3. Registrare una panoramica della griglia SEM ed eseguire una correlazione 2D con le panoramiche FLM per trovare i quadrati della griglia per i quali sono state registrate le pile fluorescenti. Ispeziona manualmente entrambe le viste o utilizza vari pacchetti software 7,10,12 per trovare i quadrati della griglia. In questo caso, l'attenzione si concentra sul toolbox di correlazione 3D (3DCT)⁷, che utilizza la trasformazione 3D del corpo rigido con la scala isotropica tra le viste. Un'eccellente panoramica sulle funzioni dei 3DCT è disponibile online¹³.
   1. Selezionare e contrassegnare almeno quattro posizioni corrispondenti, ad esempio punti di riferimento come barre della griglia o fori nella pellicola di supporto, sia nella panoramica della griglia FLM che in quella SEM (clic con il pulsante destro del mouse) e calcolare la trasformazione tra i punti contrassegnati (correlazione).
   2. Successivamente, posizionare i marcatori al centro dei quadrati della griglia corrispondenti per i quali sono state acquisite le pile FLM e prevederne la posizione nella vista SEM (correlata; Figura 4A).
4. Per ogni quadrato della griglia correlato, acquisire un'immagine a fascio ionico (IB) a bassa corrente (≤10 pA) all'angolo di fresatura FIB scelto (10°-25° per l'inversore di pre-inclinazione a 45°). Selezionare un campo visivo (ad esempio, posizione e ingrandimento) che corrisponda ai dati di fluorescenza. Per le griglie a 200 mesh, acquisire i dati di fluorescenza e FIB/SEM per contenere singoli quadrati della griglia, comprese le barre della griglia (vedere la Figura 3A e la Figura 4A).
   NOTA: La fresatura deve essere eseguita con un angolo il più basso possibile per evitare di perdere un intervallo angolare significativo durante la crio-ET e per consentire l'identificazione di un numero sufficiente di cordoni fiduciali. Ad esempio: con un'inclinazione del tavolino di 17°, una pre-inclinazione della navetta di 45° e un'inclinazione del fascio FIB di 52° rispetto al piombino, la pre-inclinazione della lamella è di 10°, che soddisfa quasi l'intervallo angolare preferito di ±60° nel TEM inclinando da -50° a +70°, il massimo di molti crio-holder TEM.
5. Prendi un'immagine SEM dello stesso quadrato per aiutare con l'identificazione delle perline corrispondenti nella vista della fluorescenza e del fascio ionico.
6. Eseguire la registrazione dello stack FLM 3D deconvoluto e della vista del fascio ionico 2D per ciascuna posizione con il 3DCT come descritto nei passaggi seguenti (Figura 4B).
   1. Caricare la corrispondente vista della pila FLM 3D e del fascio ionico (IB) in 3DCT.
      NOTA: I dati di fluorescenza multicolore possono essere caricati come un massimo di tre file stack separati a canale singolo.
   2. Selezionare 4 perline fiduciali nei dati di fluorescenza e fare clic con il pulsante destro del mouse sull'elenco delle posizioni per determinare la loro posizione 3D tramite l'adattamento gaussiano del segnale in x, y e z. Selezionare le perline corrispondenti nell'immagine IB ed eseguire una correlazione 3D iniziale (correlazione).
   3. Aggiungi iterativamente più perline nell'immagine di fluorescenza, perfeziona la loro posizione 3D e prevedi la loro posizione nella vista IB per aggiungere rapidamente più perline alla registrazione e per verificare l'accuratezza della correlazione. In 3DCT, vengono forniti valori di errore quadratico medio (RMSE) per valutare la coerenza della correlazione⁷.
      1. Assicurarsi che i valori RMSE siano piccoli e nell'ordine della precisione di localizzazione (~300 nm). Per determinare l'accuratezza della correlazione, tralasciare deliberatamente alcune perle fiduciali chiaramente identificabili sia nella fluorescenza che nel fascio ionico durante la fase di registrazione. A tale scopo, controlla la loro posizione prevista rispetto a quella effettiva nell'immagine del fascio ionico. Se la posizione prevista differisce in modo significativo da quella reale, ripetere la correlazione iniziale con un nuovo set di fiduciali.
         NOTA: La correlazione di 6-8 perline si è dimostrata sufficiente per una registrazione accurata delle pile FLM e delle viste IB. Tuttavia, l'aggiunta di più fiduciali (fino a 12-15) su un ampio intervallo di valori z (ad esempio, selezionando le perline sulla barra della griglia o nei quadrati vicini) può migliorare l'accuratezza della correlazione.
   4. Selezionare i segnali cellulari di destinazione, adattare la loro posizione 3D nello stack FLM e applicare la trasformazione per prevedere le posizioni di destinazione nella vista IB (Figura 4B).
      NOTA: Qualsiasi voce nell'elenco delle posizioni FLM, che non ha una controparte nell'elenco IB, sarà trattata come un segnale da prevedere.
7. Per ogni quadrato correlato, trasferire le posizioni previste delle caratteristiche di interesse allo strumento FIB-SEM e posizionare i modelli di fresatura a lamelle (Figura 4C). Trasferisci le posizioni manualmente (ad esempio, misurando la distanza dai punti di riferimento visibili, come celle o perline fiduciali) o utilizza l'automazione e lo scripting come implementato, ad esempio, in SerialFIB¹⁴. Se sono presenti più segnali per cella, posizionare i modelli in modo da includere il maggior numero possibile di punti di interesse (POI) nella stessa lamella per aumentare la velocità effettiva.
8. Prima sgrossare e poi fresare finemente le lamelle fino ad uno spessore finale di 150-250 nm. Evitare gradini (ad es. tagli di scarico della tensione¹⁵) che causano cedimenti della lamella e quindi provocano il movimento dell'effettiva caratteristica di interesse rispetto alle pile FLM acquisite in precedenza. Utilizzare procedure di fresatura FIB^{manuali 3} o automatizzate^14,16,17,18. Con entrambi i metodi, assicurarsi che l'elemento di interesse rimanga al centro della lamella assottigliandola simmetricamente dall'alto e dal basso.
9. Per valutare la precisione della fresatura per ciascuna lamella, eseguire la stessa registrazione del punto 3.4. Tuttavia, questa volta, utilizzare l'immagine IB finale dopo la fresatura FIB e verificare se le posizioni previste delle feature di interesse sono contenute all'interno della lamella finale. In alternativa, sovrapponete le proiezioni ruotate degli stack FLM, ottenute dall'output di 3DCT e dagli script personalizzati¹⁹, con l'immagine IB finale (Figura 4C, piccolo inserto).

Figura 4: Procedura di fresatura FIB correlativa 3D . (A) La correlazione 2D-2D delle panoramiche FLM (a sinistra) e SEM (a destra) della griglia viene utilizzata per individuare i quadrati della griglia su cui sono state scattate in precedenza le pile fluorescenti. (B) Per ogni quadrato selezionato, dopo la registrazione 3D-2D delle corrispondenti posizioni fiduciali in 3DCT (caselle colorate), le posizioni delle caratteristiche biologiche di interesse sono selezionate nei dati FLM. Sulla base della previsione delle posizioni corrispondenti nell'immagine del fascio ionico (cerchi rossi), vengono selezionati i siti per la preparazione delle lamelle. (C) Le immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM) e a fascio ionico (IB) vengono utilizzate per mantenere il bersaglio centrato durante la fresatura. Gli spessori finali di 150-250 nm sono stati ritenuti adeguati per ulteriori lavorazioni a valle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. TEM correlativo

1. Caricare le griglie nel TEM, assicurandosi che l'orientamento della lamella (come risulta dal ritaglio o dai segni di orientamento) sia perpendicolare all'asse di inclinazione.
   NOTA: I microscopi di diversi produttori possono essere controllati utilizzando vari software, ad esempio Tomo5, TOM o SerialEM²⁰. Qui, l'attenzione si concentra su quest'ultimo.
2. Acquisisci il montaggio della griglia e le panoramiche per ogni quadrato della griglia contenente lamelle. Assicurarsi che l'ingrandimento e il tempo di esposizione siano adatti per visualizzare le perle fiduciali nelle immagini TEM senza aumentare significativamente la dose totale di elettroni. Acquisisci mappe TEM ad alta risoluzione (montaggi) di ogni lamella.
3. Registro e 3D-2D correlano lo stack FLM con il quadrato della griglia TEM e le panoramiche delle lamelle in 3DCT. Utilizzare la stessa procedura descritta al punto 3.6 selezionando le posizioni corrispondenti delle perline nelle immagini del microscopio elettronico a fluorescenza (x, y, z - adattamento gaussiano) e a trasmissione. Quindi, selezionare le posizioni di interesse nei canali FLM e trasferirle nelle panoramiche TEM. Se necessario, utilizzare una procedura in due fasi che comprenda una prima correlazione tra FLM e TEM a basso ingrandimento e una seconda tra TEM a basso e alto ingrandimento (Figura 5).
4. Trasferisci le posizioni manualmente (misurando le distanze dai punti di riferimento), gli strumenti di registrazione e mappatura disponibili all'interno di SerialEM²⁰ o software esterno come CorRelator²¹.
5. Impostare ed eseguire le serie di inclinazioni in posizioni correlate. Utilizzare un ingrandimento, una sfocatura e una dose totale appropriati (vedere la Tabella dei materiali e la Tabella 1 per i dettagli). Avviare l'acquisizione in corrispondenza della pre-inclinazione determinata dalla lamella (vedere anche la nota al punto 3.4) e utilizzare uno schema di inclinazione dose-simmetrica²². Utilizzare l'acquisizione manuale o in batch.

Figura 5: Localizzazione delle posizioni correlate nel TEM. Dopo aver eseguito con successo la fresatura FIB 3D-correlativa e il trasferimento al microscopio elettronico a trasmissione, viene eseguita la registrazione 3D-2D per ogni quadrato fresato tra le perline fiduciali (caselle colorate) nelle pile FLM e le panoramiche TEM per localizzare i potenziali siti per la crio-ET (cerchi rossi). È quindi possibile acquisire panoramiche lamellari a più alto ingrandimento (zoom-in) per impostare i tomogrammi in modo più preciso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il protocollo fornisce una panoramica della pipeline utilizzata per scoprire il deposito di proteine endocitiche (END) contenente il dominio EH e dipendente dalla proteina endocitosi 1 (Ede1) e la sua degradazione e intrappolamento nei corpi autofagici⁸. L'END è un compartimento separato-fase liquido-liquido in S. cerevisiae, che tampona una varietà di proteine coinvolte nell'endocitosi mediata dalla clatrina (CME) dopo eventi endocitici falliti. Uno dei suoi componenti principali è Ede1, che funge anche da componente CME e da recettore selettivo dell'autofagia per la degradazione di questo nuovo compartimento LLPS. Di conseguenza, una fusione EGFP di Ede1 (EGFP-Ede1) sotto il controllo del promotore dell'alcol deidrogenasi (ADH) è stata utilizzata per visualizzare gli ENDs poiché la sovraespressione di Ede1 interferisce con le prime fasi dell'endocitosi e quindi induce costitutivamente LLPS.

Su una griglia surgelata con cellule di lievito sovraesprimenti EGFP-Ede1 e marcatori fiduciali da 1 μm, sono state selezionate cinque posizioni per l'acquisizione dello stack FLM nel canale GFP (Figura 6A; TFS Corrsight; modalità confocale, passo di messa a fuoco di 300 nm, intervallo di 10 μm). La griglia è stata trasferita allo strumento FIB (Quanta 3D FEG) e i quadrati della griglia per i quali erano stati acquisiti gli stack FLM sono stati identificati eseguendo una correlazione 2D-2D delle panoramiche della griglia di fluorescenza e SEM (confrontare il punto 3.2).

Per ciascuno dei quadrati scelti, sono state scattate immagini a fascio ionico a bassa corrente (10 pA, ingrandimento 1200x) e le corrispondenti posizioni fiduciali sono state registrate in 3DCT. Dopo aver selezionato le posizioni con la caratteristica biologica di interesse e aver adattato la loro posizione 3D all'interno della pila FLM, la trasformazione trovata è stata applicata alle posizioni END putative e sono stati selezionati i siti per la preparazione della lamella (Figura 6B). Negli esempi qui mostrati è stata utilizzata una trave FIB inclinata di 11° rispetto alla superficie della griglia (pre-tilt FIB shuttle di 45°; inclinazione del tavolino di 18°). Le posizioni di interesse sono state trasferite e i modelli FIB sono stati disegnati manualmente (Figura 6D) misurando la distanza delle posizioni previste rispetto ai punti di riferimento prominenti nell'immagine FIB (ad esempio, fori, contaminazioni da ghiaccio, perline fiduciali). L'accuratezza della registrazione è stata valutata tralasciando deliberatamente le perle che potevano essere chiaramente identificate nell'immagine FLM e IB, e quindi confrontando le loro posizioni effettive e previste nella vista del fascio ionico (ad esempio, il diamante nella Figura 6B,C). La correlazione per il quadrato mostrata nella Figura 6C è risultata accurata (cioè, la posizione prevista delle posizioni delle perline FLM coincideva perfettamente con la loro corrispondente posizione IB e 3DCT ha riportato valori RMSE sub-pixel per la registrazione). Pertanto, le lamelle sono state tagliate nelle posizioni previste (Sito B) e fresate con precisione fino a uno spessore di ~200 nm (offset del modello finale).

Figura 6: Risultati rappresentativi per il targeting correlativo 3D dei depositi proteici endocitici (END) nel lievito. (A) Panoramica SEM della griglia prima della fresatura. Le caselle colorate indicano i quadrati della griglia per i quali sono state prelevate in precedenza le pile di fluorescenza. (B-C) Correlazione 3D in un quadrato della griglia. Dopo aver registrato diverse perle fiduciali corrispondenti (caselle colorate) nei dati FLM (B, mostrati qui come proiezione di massima intensità) e nell'immagine del fascio ionico (C), l'accuratezza della registrazione 3D è stata verificata prevedendo la posizione della perlina indicata con il diamante. Successivamente, le posizioni del segnale target (cerchi rossi) sono state previste nella vista del fascio ionico per due potenziali siti di fresatura. (D) Ingrandimento del sito B che mostra le posizioni previste di tre punti target (cerchi rossi) e i modelli di fresatura iniziali (caselle gialle). Si prevedeva che un quarto punctum di fluorescenza fosse molto più basso degli altri puncta e quindi non mirato durante la fresatura (cerchio grigio). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dopo aver completato con successo la fresatura FIB e trasferito la griglia al microscopio elettronico crio-trasmissione (Titan Krios operava a 300 kV ed era dotato di un rivelatore di elettroni diretti Gatan K2 e di un filtro di energia bioquantica), una panoramica della griglia è stata registrata in SerialEM e utilizzata per localizzare i quadrati con lamelle. Per ogni lamella, sono state acquisite immagini panoramiche e i dati FLM sono stati registrati in 3DCT (3D-2D) utilizzando le corrispondenti perle fiduciali. Le posizioni delle caratteristiche biologiche di interesse (Figura 7A) sono state quindi previste utilizzando la trasformazione calcolata dalle perle fiduciali. Le panoramiche delle lamelle registrate a un ingrandimento più elevato sono state cucite e i siti di interesse sono stati correlati utilizzando punti di riferimento chiaramente visibili (ad esempio, perline fiduciali). In alternativa, le classiche panoramiche CLEM possono essere prodotte in vari software^10,12.

Sulla base della correlazione, sono stati trovati quattro potenziali siti per l'acquisizione del tomogramma per la lamella mostrata nella Figura 7A. Tuttavia, questo include anche una posizione che non è stata presa di mira durante la fresatura FIB correlata 3D (confrontare la Figura 6D; cerchio grigio) e una posizione bloccata dalla contaminazione da ghiaccio (Figura 7; caselle grigie). Di conseguenza, è stato possibile registrare i tomogrammi solo per due posizioni (Figura 7B). Nel complesso, è stato raggiunto un successo di correlazione di ~75%, cioè le lamelle che sono sopravvissute al trasferimento alle strutture TEM e END sono state trovate nei siti previsti (12 siti correlati). Dopo la ricostruzione del tomogramma, la segmentazione e la corrispondenza dei modelli, le singole strutture END possono essere visualizzate nel loro contesto nativo (Figura 7C,D). Ciò include il reticolo endoplasmatico fenestrato (ER) che circonda l'END, le goccioline lipidiche che occasionalmente entrano in contatto e i ribosomi, che sono esclusi dal compartimento LLPS. Nel complesso, questo dimostra come la fresatura FIB correlativa 3D possa fornire informazioni a livello molecolare di rari processi biologici da cellule intatte.

Figura 7: Risultati rappresentativi per la visualizzazione dell'END con cryo-ET. (A) La panoramica TEM a basso ingrandimento del sito di macinazione mostrata in Figura 6 può essere facilmente correlata con la proiezione di intensità massima FLM (Figura 6B) per localizzare le caratteristiche biologiche di interesse (croci rosse). (B) In una seconda fase, è possibile correlare una vista a ingrandimento maggiore (cucita) e impostare le posizioni per l'acquisizione del tomogramma (caselle gialle). Le posizioni risultanti dal segnale fuori piano (riquadro grigio, confronta Figura 6D) sono state ignorate. (C-D) Utilizzando questo approccio FIB correlativo 3D, il deposito proteico endocitico (END) può essere visualizzato nel suo ambiente nativo. Strutture come il reticolo endoplasmatico (ER), i ribosomi, le membrane e le goccioline lipidiche possono essere identificate e visualizzate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Elenco delle apparecchiature testate e delle impostazioni suggerite.

1. Passaggi critici del protocollo

L'ottimizzazione dei parametri di coltura cellulare e di immersione della griglia è fondamentale per questo flusso di lavoro. All'inizio di un progetto, vale la pena investire tempo per ottimizzare le strategie di etichettatura, la distribuzione delle cellule e delle perle fiduciali e testare diversi parametri di preparazione della griglia e blotting. Lavorare con un campione surgelato in modo ottimale faciliterà notevolmente l'elaborazione a valle.

Come per qualsiasi esperimento TEM, sono necessari campioni vitrei. Per le cellule di mammifero di grandi dimensioni come HeLa, sono preferibili 1-2 cellule per quadrato della griglia, ma le cellule possono ancora essere vitreali a densità più elevata. Facoltativamente, la vitrificazione può essere migliorata nelle cellule di mammifero (ad esempio, HEK293, HeLa) incubandole con glicerolo al 2,5-10% (v/v) aggiunto al terreno di coltura 10 minuti prima dell'immersione²³. Se disponibile, il modello a griglia può essere utilizzato per garantire un perfetto posizionamento e distribuzione delle cellule, migliorando così la vetrificazione e la successiva correlazione²⁴.

Sebbene sia possibile selezionare cellule specifiche durante il flusso di lavoro, un numero insufficiente di cellule che mostrano la caratteristica biologica di interesse ridurrà significativamente la produttività complessiva. Per migliorare la correlazione nelle cellule POI-positive, devono essere utilizzati fluorofori sufficientemente luminosi. Ciò è particolarmente importante a livello di espressione endogena. Abbiamo scoperto che in condizioni criogeniche, mVenus spesso si comportava meglio di EGFP grazie alla sua maggiore luminosità²⁵ e allo spostamento ipsocromico, che lo mantiene adatto per le configurazioni standard del filtro GFP in condizioni criogeniche²⁶. Per le strutture target non puntiformi, dovrebbe essere considerato anche il compromesso tra lunghezza d'onda e precisione di localizzazione (limite di diffrazione di Abbe).

Un'efficiente correlazione 3D richiede anche che le griglie siano meccanicamente stabili e maneggiate con grande cura. Sebbene sia possibile utilizzare griglie standard in oro o rame con supporto in carbonio, il tasso di successo può essere significativamente aumentato utilizzando film SiO₂ più rigidi a seconda del progetto. Tuttavia, non è stato ancora determinato in modo definitivo se (a) la stabilità meccanica o (b) l'abbinamento dei coefficienti di dilatazione termica (substrato vs. film) per ridurre le^rughe criogeniche, sia il fattore più cruciale per una correlazione 3D di successo. Inoltre, per la raccolta di griglie fragili di Au, possono essere utilizzate piastre rivestite in polidimetilsilossano⁵.

Oltre a garantire la stabilità del campione, è necessaria un'attenta scelta dei parametri di imaging FLM per ottenere stack di fluorescenza di alta qualità adatti per un targeting ottimale durante la fresatura FIB. A questo proposito, si consiglia anche di testare diverse tecniche di denoising²⁸ o deconvoluzione sui dati FLM, in quanto possono migliorare notevolmente la localizzazione dei fiduciali e dei segnali cellulari. Quando si correla il segnale di fluorescenza alle immagini FIB-SEM, è importante un buon campionamento delle perle fiduciali. Dovrebbero essere ben distribuiti intorno alle celle e possibilmente a diverse altezze z. È inoltre buona norma convalidare la coerenza della correlazione controllando le posizioni previste rispetto a quelle effettive delle perle che sono state deliberatamente lasciate fuori dal modello fiduciale, ma che possono essere chiaramente correlate a occhio. Anche i valori RMSE di 3DCT devono essere sempre considerati per verificare la coerenza della registrazione.

Poiché la deposizione di materiale fresato e acqua residua dalla camera FIB-SEM (cioè la ricontaminazione) aumenta lo spessore effettivo della lamella aggiungendo materiale amorfo su entrambi i lati di essa, mantenere le lamelle finemente fresate nel microscopio per un tempo prolungato generalmente riduce la qualità dei dati TEM a causa di ulteriori eventi di scattering di elettroni. Di conseguenza, la fresatura viene spesso eseguita in due fasi: in primo luogo, tutte le posizioni vengono fresate grossolanamente (cioè a circa 800 nm) e poi finemente (a ~150-250 nm) e la griglia viene immediatamente scaricata dopo che l'ultima lamella è stata completata. Tuttavia, è possibile ottenere un migliore successo di correlazione elaborando le posizioni di interesse in modo da poter essere eseguite in base al sito, eseguendo quindi la fresatura di sgrossatura e di precisione sulla stessa lamella direttamente una dopo l'altra, poiché ciò non lascia tempo per la flessione o la deformazione. Questo, tuttavia, riduce il numero massimo di lamelle che possono essere prodotte per griglia a seconda del tasso di ricontaminazione del sistema. Per una velocità di 20 nm/h, vengono prodotte 4-6 lamelle entro 1-1,5 ore.

Il movimento dell'intera griglia o delle lamelle fresate a >300 nm risulterà in una correlazione scarsa o infruttuosa (vedere anche le limitazioni discusse di seguito). Dovrebbe quindi essere controllato regolarmente, ad esempio confrontando le immagini IB prima, durante e dopo la fresatura FIB. I siti che mostrano un movimento significativo (>300 nm) devono essere scartati. Ottimizzare la preparazione del campione (ad esempio, la scelta del tipo di griglia, della densità delle celle e dei parametri di immersione; vedere la sezione 1 del protocollo) e la strategia di macinazione per evitare questi movimenti. La piegatura delle lamelle può essere ridotta in modo significativo mediante fresatura in loco come descritto nel passaggio 3.6 e riducendo la larghezza della lamella. Come accennato in precedenza, mentre i tagli di distensione¹⁵ sono stati progettati per ridurre la flessione delle lamelle, spesso si traducono in un movimento concertato della lamella disaccoppiata, prevenendo così efficacemente la correlazione. Per risolvere questo problema possono essere utilizzati sistemi FLM integrati.

2. Modifiche e problemi del metodo

Si consiglia vivamente di eseguire una caratterizzazione approfondita del campione nell'imaging di cellule vive prima di passare alle condizioni criogeniche. L'ottimizzazione dei campioni cellulari, degli schemi di trattamento e la conoscenza del tipo di segnale da aspettarsi prima di entrare nel flusso di lavoro criogenico possono migliorare sostanzialmente il suo tasso di successo.

Nel flusso di lavoro qui presentato, viene utilizzato un microscopio a fluorescenza autonomo con un crio-stage per l'imaging dei campioni, seguito da un trasferimento delle griglie nel microscopio a fascio ionico focalizzato. Tuttavia, è stato testato su sistemi in cui un microscopio a fluorescenza è integrato nella camera FIB-SEM e quindi non è necessario alcun trasferimento di campione per acquisire immagini di fluorescenza 29,30,31. Utilizzando tali sistemi integrati, è possibile visualizzare le posizioni di interesse durante e dopo la fresatura FIB per verificare la presenza del segnale di fluorescenza target senza aumentare il rischio di contaminazione delle lamelle finali. Tuttavia, è importante tenere a mente i parametri ottici dei microscopi utilizzati, poiché, ad esempio, un obiettivo a bassa NA limiterà la precisione con cui è possibile localizzare le sfere fiduciali e i segnali target. Ciononostante, le configurazioni FLM integrate aiuteranno anche a gestire meglio le lievi deformazioni di griglie e lamelle, poiché gli stack FLM possono essere continuamente aggiornati e confrontati con le viste SEM e IB aggiornate.

In alternativa all'imaging a fluorescenza della lamella tra la fresatura FIB e l'acquisizione dei dati TEM, la correlazione post-TEM può essere utilizzata per verificare il corretto posizionamento e la fresatura delle lamelle ^5,6.

Durante tutte le fasi del flusso di lavoro correlato, ma soprattutto durante il TEM, si consiglia di creare una sovrapposizione dei dati di fluorescenza proiettati sulle immagini FIB-SEM/TEM. Tali viste CLEM classiche aiutano a capire in modo più intuitivo quale parte delle cellule è contenuta all'interno delle lamelle. Questo serve anche come utile controllo di integrità per verificare l'accuratezza della correlazione.

3. Limiti del metodo

L'approccio FIB correlativo 3D richiede campioni che possono essere forniti con perline fiduciali. Di conseguenza, questo metodo è attualmente limitato alle griglie surgelate. Per i campioni congelati (di tessuto) ad alta pressione (HPF), attualmente, è possibile eseguire solo correlazioni 2D-2D. Potenzialmente, i marcatori fiduciali interni (ad esempio, organelli, goccioline lipidiche colorate) potrebbero essere una soluzione a questo problema^32,33. Il tasso di successo finale della correlazione dipende da molti fattori, tra cui la qualità del campione, la configurazione della microscopia a fluorescenza, lo spessore della lamella e le dimensioni della struttura bersaglio. L'accuratezza della correlazione utilizzando l'approccio di registrazione 3D descritto è stimata nell'intervallo di 200-300 nm sull'immagine IB finale, approssimativamente corrispondente allo spessore tipico delle lamelle fresate FIB⁷. Di conseguenza, strutture cellulari molto più piccole di questa saranno difficili da colpire al momento. Inoltre, un movimento eccessivo nel sito di fresatura (>300 nm) riduce anche l'accuratezza della correlazione, un problema che può potenzialmente essere affrontato con le configurazioni FLM integrate negli strumenti FIB/SEM. Le lamelle che mostrano una forte deformazione o flessione durante la fresatura dovrebbero, in ogni caso, essere escluse dal flusso di lavoro a valle.

Nel complesso, l'imaging a criofluorescenza è attualmente limitato dal criterio di diffrazione di Abbe. Con l'applicazione (e la commercializzazione) di routine di metodi crio-FLM super-risolti, potrebbe diventare possibile un targeting più accurato delle strutture cellulari, specialmente se integrato nel FIB/SEM per il funzionamento al volo.

4. Significato del metodo

Soprattutto rispetto alle tecniche non mirate e post-correlazione, l'approccio di fresatura FIB correlato al 3D consente la selezione delle posizioni adatte prima della fase TEM, che richiede tempo e risorse. In questo modo, consente una raccolta dei dati e una pianificazione del progetto più efficienti. Inoltre, i dati di fluorescenza correlati aggiungono uno strato di informazioni che possono essere cruciali per l'interpretazione dei tomogrammi e per l'integrazione dei risultati crio-ET in progetti multiscala, specialmente quando si ha a che fare con assemblaggi proteici non strutturati o troppo piccoli per la corrispondenza dei modelli e la media del subtomogramma.

5. Importanza e potenziali applicazioni future

In combinazione con flussi di lavoro avanzati come il crio-lift da campioni HPF^34,35, il volume crio-FIB-SEM 36 e l'imaging a fluorescenza a super-risoluzione^26,37,38,39, la preparazione di lamelle mirate in ^3D offre la prospettiva non solo di sezionare i processi biologici in cellule isolate, ma anche di rendere i campioni di tessuto e dei pazienti accessibili alla fresatura FIB e alla tomografia^{crioelettronica}. In quanto tale, consentirà la dissezione dei processi patologici ad alta risoluzione e quindi sarà un elemento costitutivo integrale verso una biopsia su scala nanometrica.

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Si ringraziano Inga Wolf per il supporto all'infrastruttura IT, Florian Beck per il supporto computazionale e Oda H. Schiøtz per la lettura critica del manoscritto. Il finanziamento è stato fornito in parte attraverso una borsa di studio Alexander von Humboldt returners a Philipp S. Erdmann e una borsa di studio a lungo termine EMBO ALTF 764-2014 a Florian Wilfling. Anna Bieber è stata sostenuta da una borsa di studio del Boehringer Ingelheim Fonds Ph.D.