糖尿病性創傷の加速治癒のためのドキシサイクリン装填されたコラーゲン-キトサン複合足場

調製されたDOX-CL足場は、機械的強度、多孔性、吸水性、分解速度、持続放出、抗菌、生体適合性、および抗炎症特性における理想的なDWドレッシングの前提条件を満たし、これは、DWの損傷した組織の回復に不可欠であると考えられる。

糖尿病の大きな合併症の1つは糖尿病性創傷(DW)です。糖尿病の炎症の長期段階は、遅延創傷治癒につながる傷害のさらなる段階を妨げる。我々は、その報告された抗炎症特性と共に、その抗菌特性のために、選択の潜在的な薬物として、ドキシサイクリン(DOX)を選択した。現在の研究は、DOXに装填されたコラーゲンキトサン非架橋(NCL)および架橋(CL)足場を処方し、糖尿病状態での治癒能力を評価することを目的としています。足場の特徴付け結果は、DOX-CL足場が理想的な空隙率、低い腫脹及び分解率、およびDOXの持続的な放出をDOX-NCL足場と比較して保持することを明らかにする。 in vitro 研究は、DOX-CL足場がCL足場処理および対照群と比較して生体適合性および増強細胞増殖であることを明らかにした。抗菌研究は、DOX-CL足場がDWで見つかった最も一般的な細菌に対するCL足場よりも効果的であったことを示している。ストレプトゾトシンおよび高脂肪食誘導DWモデルを用いて、DOX-CL足場処理群における創傷収縮率が有意に(p≤0.05)より速く、CL足場処理および対照群のものと比較して観察された。DOX-CL足場の使用は、DWの局所治療のための有望なアプローチであることが証明できる。

糖尿病(DM)は、体がインスリンを送達したり、単純な糖の異常な消化でその結果に反応しなかった場合に血糖値 ¹の上昇をもたらす状態である。DMの最も連続した破砕絡み合いは、糖尿病創傷(DW)である。DM患者のおよそ25%は、寿命 ¹でDWを構築する機会を持っています。DWの妨げ癒しはDMのトリオパシーに認定されている:免疫障害、血管障害、および神経障害。DWが治療を受けずに放置されると、壊疽の発症が生じ、その結果、関係する器官 ²の除去を促す。

患者に指示するなど、多くの治療(創傷を毎日検査し、傷を浄化し、創傷に圧力をかける活動、定期的なグルコースモニタリングなどを避ける)、血糖値、創傷脱除剤、圧力オフロード、医療処置、高圧酸素療法、および高度な治療法を制御^する。これらの薬の大半は、多因子性病態生理学的状態とこれらの薬に関連する予期せぬ費用に照らしてDWケアに不可欠なすべての前提条件に対処することができません⁵.DWの病因は多因子性であるが、不適当な組織管理を伴う持続的な炎症は^、DW5,6における治癒遅延の実際の理由であると述べ^{られている}。

DWにおける炎症性および炎症促進メディエーターの増強レベルは、遅延創傷治癒を担う成長因子の減少をもたらす^2,6.DWにおける不適切な細胞外マトリックス(ECM)形成は、形成されたECMの急速な分解に対して責任を負うマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)のレベルの増加に認定されています。MMPでは、MMP-9は、炎症の長期化および急速なECM劣化⁷を担う主要な仲介者として報告されている。MMP-9の上昇レベルを低下させる抗炎症薬による局所治療は、皮内恒常性を再確立し、フレームワークの配置および^DAW8、9のより良い治癒を促す。

ドキシサイクリン(DOX)は、MMP-9阻害剤であり、DW10、11、12における持続的な炎症を引き起こす主要な炎症性メディケーターであるMMP-9の上昇レベルを抑制するために選択された。さらに、DOXは、抗酸化剤(活性酸素種と結合し得る遊離ヒドロキシおよびフェノキシラジカルを産生する⁾¹³および抗アポトーシス(カスパーゼ発現およびミトコンドリア安定化を阻害する⁾¹⁴の活性を有する。DOX、コラーゲン(COL)、キトサン(CS)を含むフレームワークの配置を選択した。COLの選択は、機械的強度と組織再生¹⁵に必要なフレームワークを提供するのに役立つ方法に依存します。一方、CSは、構造的にグリコサミノグリカンに相同であり、いくつかの創傷治癒相と関連している。CSは重要な抗菌性を有する¹⁵を有することも報告されている。したがって、DOXのCOL/CS足場は、長時間の炎症を抑制するために処方され、続いてDM条件での創傷治癒に成功するためのマトリックス形成を支持する。

実行されたすべての動物の手順は、JSS薬科大学の制度的動物倫理委員会によって承認されました, ウーティ, インド.

1. 凍結乾燥法によるDOX搭載多孔性足場の調製

1. 100mLの水(例えば、ミリポア)に1.2gのCOLを加え、腫れのために脇に置きます。
2. 腫れたCOL分散液を一晩2000rpmで撹拌し、COLの完全な溶解を確実にします。
3. 1%酢酸の100 mLに約0.8gのCSを溶解して、CS溶液を調製します。
4. CS溶液を2000rpmで一晩撹拌し、均一な分散を確保します。
5. DOX(1%w/v)を混合し、CS溶液をコル溶液に混ぜ、30分間攪拌します。
6. マスリン布を使用して得られた物理的な混合物をフィルタリングし、粒子状物質を除去します。
7. 得られた濾液を-85°C±4°Cで約24時間凍結する。
8. 深凍結混合物を-85°Cで4°C±72時間凍結乾燥させる。
9. 得られた足場をデシケータに保管して、さらに分析^{するために16、17。}

2. 足場の架橋

1. 50mLの水にMES(0.488g)を溶かします。
2. DOXの50mgを積んだ足場をMESバッファーの20 mLに30分間浸します。
3. EDCの0.1264 gとNHSの0.014 gを別のビーカーに混ぜます。
4. スキャフォールドをバッファ混合物に4時間浸漬し、架橋 ¹⁶を達成する。
5. さらに評価するために、DOX ロードされたクロスリンク (CL) と非クロスリンクスキャフォールド (NCL) を保管します。

3. 足場の特徴

1. 走査型電子顕微鏡(SEM)を用いた形態学的検査
   1. SEM(1 cm × 1 cm 0.5 cm)を使用して形態解析のための足場×特徴付けます。
   2. スキャフォールドの断面と外面を金の繊細な層で染色します(〜150Å)。
   3. 5kVと10kVの励起電圧で写真画像をキャプチャします。
   4. サンプルをアルミニウムスタブに入れ、約9 Vの金で囲みます。
   5. 10 kV で解像度を上げた SEM を使用してスキャフォールドを測定します。
2. 多孔性判定
   1. 液体変位法(エタノール ⁾¹⁸を用いて足場の空隙率を測定する。
   2. 以下の式を使用して、足場の空隙率を計算します。
      
      W_w = 足場のウェットウェイト
      W_d = 足場の乾燥重量
      W_v = 足場の体積
3. 吸水能力の決定
   1. 足場の乾燥重量を測定します。
   2. 37 °Cで秤量した足場をリン酸緩衝塩(PBS)pH 7.4で24時間インキュベートします。
   3. 濾紙を使用して、足場の上に余分なPBSを取り除きます。
   4. 以下の式 ¹⁷を用いて吸水能力を測定する。
      
      W_S = 吸水率
      W₁=足場のウェットウェイト
      W₀= 足場の乾燥重量
4. 足場の劣化
   1. リソザイムを含むpH 7.4のPBSで、37°Cでスキャフォールド(1cm x 1cm)を7日間インキュベートする。
   2. 足場を洗って、表面に付着したイオンを取り除きます。
   3. 洗浄された足場 ¹⁷を凍結乾燥する。
   4. 数式を使用して、劣化率を計算します。
      
      Ww = スキャフォールドの初期重量
      Wd = 凍結乾燥後の足場の重量
5. インビトロ リリース研究
   1. 透析袋法を用いて、足場からのDOXの放出挙動を決定する。
   2. スキャフォールドを数ミリリットルの模擬創液(pH 7.4)に分散させ、透析袋に移します。
   3. 膜袋の端をしっかりと閉じ、500 mLの模擬創液液溶液に浸します。
   4. 透析袋を含む創傷液溶液を200~250rpmで攪拌します。
   5. 上清溶液を収集し、一定の時間間隔で同量の新鮮なバッファー溶液に置き換えます。
   6. 240 nmのUV可視分光計を使用して、上清溶液中の足場からのDOX放出の割合を決定します。

4. インビトロ 抗菌研究

1. S.アウレウス、S.表皮、大腸菌、P.エルギノーサに対するCLおよびDOX-CL足場の最小阻害濃度(MIC)をマイクロブロス希釈法を用いて決定する。
2. ミューラー・ヒントンスープを1:1000の比率で使用して細菌培養物を調製し、0.5マクファーランド濁度を得る。
3. 高化のための細菌培養物にD-グルコース(800mg/dL)を加える^19,20.
4. DMSOでCLとDOX-CLを軽視し、可溶化する(陰性制御)。
5. 高化した細菌懸濁液(100 μL)と試験サンプル(スキャフォールド溶液100 μL)を96ウェルプレートで連続して希釈します。
6. プレートを37°Cで20〜24時間インキュベートします。
7. 600 nm ²¹の波長で吸光度を記録します。

5. インビトロ 生体適合性試験

1. MTT[(3-(4,5ジメチルチアゾール-2 yl)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化)アッセイを用いて、調製された足場の生体適合性を評価する。
2. 標準的な次元の足場を殺菌し、24の井戸の版に置く。
3. 24ウェルプレートに3T3-L1細胞を加え、72時間インキュベートする。

6. 生体内 動物研究

1. DMおよび切除創の誘導
   1. 動物に2週間の高脂肪食を与え、クエン酸緩衝液中のストレプトゾトシン(STZ)(50mg/kg体重)を、2型糖尿病の誘導のためにウィスター・アルビノラット(180-200g)に腹腔内に投与する。
   2. 研究のための250 mg/dLの一定の血糖を持つ動物を選択してください。
   3. 切除創傷の誘導のために選択した動物をランダム化します。
   4. ジエチルエーテル(5mLを前飽和麻酔室に加えた)を用いて糖尿病ラットを麻酔し、つま先ピンチ法と粘膜色を用いて確認した。
   5. 無菌トリマーとブレード(A40)を使用して、後部領域(胸部、腰部領域)を剃ります。
   6. アルコール綿棒で剃った部分を殺菌する。
   7. 剃った区域の無菌の外科A40の刃と皮膚(2 x 2 cm² および1mmの深さ)を切物にして開いた傷を作成する。
   8. 動物を3つの群(グループ1-疾病コントロール(対照)、グループ2-CL足場(プラセボ)、グループ3-DOX CL足場)に分け、各群は6匹のラットからなる。
   9. 外科テープを使用してCLとDOX CL足場を貼り付け、21日間無菌ガーゼでコントロールグループを覆います。
   10. 無菌のOHPシート上の創傷領域を追跡し、すべてのグループの0、7、14、および21日目のグリッド法を使用して創傷の減少率を測定します。
   11. 以下の公式を用いて創傷減少率を計算する。
       

7. 組織病理学的研究

1. 7日目、14日目、21日目に治癒した創傷領域を分離し、ホルマリン溶液(10%)に保存する。
2. ミクロトームを使用して組織を切り離し、6μmの厚さを得る。
3. ガラススライドにセクションを取り付け、ヘマトキシリンとエオシン ¹⁷を使用して汚れを汚す。
4. デジタル顕微鏡を使用して40倍の拡大率で画像をキャプチャします。

8. ヒドロキシプロリン推定

1. 評価のために0、7、14、および21日目に治癒した創傷領域を分離する。
2. Reddy G et al., 1996 ²²で説明した手順を用いてヒドロキシプロリン含有量を推定する。

9. エリサテスト

1. メーカーの指示に従って、Elisaキットを使用してMMP-9レベルを推定します。
2. 21日目に治癒した創傷領域から組織サンプルを分離し、組織ホモジナイザーを使用してミンチする。
3. 得られたホモジネートを遠心分離し、上清を集める。
4. アッセイバッファーを使用して上清を100倍に希釈します。
5. 複数のプレートリーダーを使用してプレートをスキャンします。

10. 統計分析

1. 取得した結果を平均± SD として表します。
2. グラフパッドプリズムv5.01を使用して統計解析を実行します。
3. 一方向分散分析 (ANOVA) と Dunnet のポストホック検定を使用して、統計的有意性を達成します。
4. p≤0.05 を持つ値は重要であると考えてください。

DOX ロードされた NCL および CL スキャフォールドの特性
目視検査では、NCLとCL足場は色のクリームであることが判明した。また、両方の足場は、物理的に調べるとスポンジのように見え、硬く、弾力性があります。図 1に、NCL および CL スキャフォールドの SEM イメージを示します。この図から、分子間結合を形成して架橋した後の孔径の減少があったことが明らかであった。また、NCLおよびCL足場の空隙率はそれぞれ92.3±4.21および71.35±2.65であることが判明した。NCLおよびCL足場の吸水率は750±11.4%、492±8.66%であった。

さらに、生分解研究は、リソザイムを含むpH7.4の模擬創液中で7日間行われた。NCL足場は最初の3日間でより速い分解速度を示し、4日間連続してゆっくりと減少した。他方では、CL足場は、劣化の長期化率を示した。足場の架橋は、機械的特性およびネットワーク強度を増強し、その結果、劣化率が低下し、劣化に対する耐性が向上したことを示す(図2)。

また、NCLおよびCL足場からのDOXの in vitro 放出を120時間行った(図3)。最初の1時間では、27.92±3.45%DOXがNCL足場から放出されたのに対し、CL足場から放出されたのは16.54±2.21%に過ぎなかった。6時間後、足場からのDOX放出は、NCL足場で63.15±3.78%、CL足場で44.43±3.57%増加した。24時間後、NCL足場から70%のDOXの放出があったのに対し、CL足場はDOXの70%を解放するのに72時間以上かかった。得られた結果に基づいて、DOXロードされたCL足場をさらに評価するために選択され、DOX-CL足場として表される。一方、DOX (プラセボ) なしの CL 足場は CL スキャフォールドとして指定されています。

インビトロ 抗菌試験
DW患者は通常、長引く創傷治癒をもたらす感染症を経験する。従って、調製された足場は、選択した細菌のパネルに対してMICを用いてそれらの抗菌活性について調べた(表1)。結果から、DOXは 、S.アウレウス および S.表皮 の両方に対して<4 μg/mLのMICで阻害活性を示したことが明らかである。 大腸菌 および P.緑素吸砂に対して<8μg/mLおよび<16μg/mLのMICが観測された。キトサンおよびCLスキャフォールド抽出物は単独で 、S.アウレウス (<64 μg/mL)、 表皮 (<64 μg/mL)、 大腸菌 (<128 μg/mL)、 およびP.エルギノーサ (<128 μg/mL)などの選択された生物に対して最小限の活性を示した。DOX-CL足場は 、S.アウレウス および S.表皮の両方に対して<2 μg/mLのMICと同様の阻害活性を示している。さらに、DOX-CL足場は、 大腸菌 および P.エルギノーサに対して<8 μg/mLのMICを用いて適度な活動を示した。

インビトロ 生体適合性試験
MTTアッセイは、CLおよびDOX-CL足場の存在下での3T3-L1細胞の細胞生存率を決定するために行われた。結果はCLおよびDOX-CL足場がいかなる細胞傷害性を刺激しなかったことを例示した。さらに、この細胞生存率は、スキャフォールド処理群において対照的に比べて比較的高く、足場の存在下での線維芽細胞の増殖の増強を表す(図4)。

インビボ 創傷治癒研究
全群で減少した平均創傷面積は、0日目、7日目、14日、21日目にグラフィカル手法で決定した(図5)。目視検査では、CLおよびDOX-CL足場処理群の創傷は7日目ににじみ出なかった。同時に、対照群の傷がにじみ出ていた。14日目、すべての群れで乾燥したかさぶたが観察された。しかし、DOX-CL足場では傷収縮の速い速度が観察された(89.663%)。21日目には、創傷の99.9%が治癒し、DOX-CL足場に瘢痕が形成されたのに対し、対照およびCL足場処理群では部分的治癒が観察された。

組織病理学研究
7日目の傷害後の創傷治癒の病理組織学的観察は、すべての群の創傷の縁部にあるすべての皮膚層の破壊を示した。表皮の可視性はなかった。しかし、対照群では、間欠単球およびリンパ球を有する優勢な好中球が観察された。CL足場処理群では、表皮の中程度の視認性が、好中球およびマクロファージの少ないとともに注目された。一方、DOX-CL足場処理群では、創傷を表皮のスリムな層で覆い、再エピソードの相を表す。軽度の好中球およびマクロファージは、造粒組織と共に、DOX-CL足場処理群でもより頻繁に見られた。

14日目の負傷により、すべての群の傷が表皮で覆われていることが判明した。対照群において、形成された表皮層は、優勢な好中球と共に非常にスリムな層であることが観察された。CL足場処理群では、形成された表皮層は、軽度の多核化された巨大細胞と共に対照群のそれよりも厚かった。DOX-CL足場処理群では、開発された表皮は他の群に比べて厚く、多数の組織組織および巨大な多核細胞が存在していた。また、DOX-CL足場処理群においても、線維芽細胞の緻密なゾーンが認められた。

21日目の負傷後、対照群では、減少した炎症を表すマクロファージおよび組織サイトの再発と共に好中球の数が支配的に減少した。一方、CL足場処理群では、適度な数のヒストサイトおよびリンパ球が観察された。形成された表皮は、対照群の群よりもDOX-CL足場処理群において、多数のヒスチオサイト、リンパ球、および巨大な多核細胞と共に、実質的に厚く見られた。DOX-CL足場処理群では、7日目に好中球数が減少した。また、マクロファージの集まりと、多核化された巨大細胞および組織サイトのような形態学的変異体の集まりは、14日目と21日目に注目された(図6)。

ヒドロキシプロリン推定
ヒドロキシプロリン推定は、治癒創傷に存在するコラーゲンの量を間接的に測定する。より高いヒドロキシプロリン濃度は、創傷治癒の急速な割合を指定します。生化学的検査では、DOX-CL足場処理群において、対照群の場合よりも高い量のヒドロキシプロリンが続き、CL足場処理群が続いていることを明らかにした(図7)。

エリサキットを用いたMMP-9推定
DOX-CL足場処理群中のMMP−9含有量は、対照的なものと比較して有意に減少し、かつCL足場処理群であった。CL足場処理群のMMP-9含有量は、 図8に示すように、DOX-CL足場処理群のそれと比べてわずかに少なかった。

図1: 50 μmのスケール範囲でのSEMによるCL判定後、CL前及びb)前にDOX搭載COL-CS足場a)の形態を示します。

図2:PBSpH 7.4で1日目から7日目にNCLおよびCL足場にロードされたDOXのマトリックス分解は、NCLが7日間徐々に劣化していることを示す。これに反して、CL足場分解速度が著しく低下すると、酵素分解に対する耐性が高まることを示している。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:37°CのPBS pH 7.4におけるNCLおよびCL足場からのDOXのin vitro薬物放出プロファイルは、全製剤中の薬物の遅い放出を示し、続いて持続放出を示した。SD±平均として表されるデータ(n=3)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:3T3-L1細胞は、DOX-CL足場処理群における細胞増殖率を示すCLおよびDOX-CL足場の存在下で培養し、続いてCL足場処理および制御を行った。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:(a)コントロール内の平均創傷面積の減少を表す画像、CL足場およびDOX-CL足場は、0日目、7日目、14日および21日目の創傷後に処置された群である。(b) コントロール内の平均創傷領域の減少のグラフィカルな表現, CL足場と DOX-CL足場は、0日目に処置されたグループ, 7, 14, 21 ポスト創傷.データはSD±平均値として表現されます(n=6創傷/グループ)。統計的有意性は、分散の一方向分析(ANOVA)によって得られ、続いてダンネットのポストホック検定が得られた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:STZにおける創傷治癒過程における組織学的変化と、ウィスター・アルビノラット皮膚における高脂肪食誘発糖尿病(コントロールなし)及び全厚切除創モデルにおける治療(CLおよびDOX-CL足場)による。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図7:間接コラーゲンレベル推定の指標として0日目、7日目、14日目、21日目の創傷におけるヒドロキシプロリン含有量を表す結果結果は、乾燥創傷組織のμgヒドロキシプロリン/mgで表される。データは平均sD±(n = 6創傷/グループ)を表します。統計的有意性は、分散の一方向分析(ANOVA)によって得られ、続いてダンネットのポストホック検定が得られた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図8:21日目にSTZおよび高脂肪食誘発糖尿病ラットモデルで治癒した創傷から得られた均質性のMMP-9レベルを表すグラフ。MMP-9のレベルは、ELISA分析を用いて創液の100倍のアリコートで決定した。データは平均±SD (n=3)を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表1:選択した細菌パネルに対するCS、DOX、CL、およびDOX-CL足場の最小阻害濃度。

本研究の主な目的は、ラットのDW治癒に対するDOX装填されたCOL-CS足場の効果を決定することであった。CLおよびNCLは、形態、腫脹指数、生体外放出動態、および生体適合性の観点から調製および評価した。

DOX ロードされた NCL および CL スキャフォールドの特性
準備された足場は、相互接続された細孔を有する多孔質であることが判明した。これらの相互接続された細孔は、増殖と移動のために細胞への酸素と栄養素の適切な拡散に役立つ多孔質、海綿状の性質を保証し、治癒を加速させる。ここで、細孔サイズは主に架橋に依存していた。足場を架橋すると、CSおよびCOLとのEDC/NHSによる強い分子内相互作用を形成し、足場の機械的強度を増加させることによって、孔サイズが減少した。

気孔率は、スポンジ支柱と体積の質量の関数である相対密度に依存しています。一般的に、架橋剤が支柱の位置を互いに近づけて変化させると足場体積の収縮が起こり、足場の緻密化を招く。しかし、カルボジイミド化学の場合、その独特のメカニズム、すなわち、足場に入ることなくカルボキシカル(> coOH)および隣接ペプチド鎖のアミン(-NH)群を用いたアミドリンケージ(O=C-NH)の導入により、足場の質量の増加は予想されない。同時に、架橋時には、未結合ポリマー鎖の溶解および移動による軽微な質量損失が生じることがある。それにもかかわらず、EDC/NHSによる足場治療の場合には、足場形態に顕著な影響を及ぼさなかった。

スキャフォールドが生物学的流体を吸収する能力は、薬物キャリアとしての適合性を評価する上で極めて重要である。吸水性は足場の形状に影響を与えるだけでなく、細胞の成長にも影響を与えます。CL足場は、足場の架橋に起因する可能性のあるNCL足場よりも低い吸水率を示していたことが観察された。さらに、スキャフォールド材料の親水性は、(i)アミド結合形成の過程での親水性基(>COOH及−NH)の喪失による架橋後に有意に低下した。(ii)新結合の形成による腫脹の抑制(O=C-NH)。これらの結果は、以前に公開されたレポート^23,24とよく一致しています。

リソザイムを含むpH 7.4の模擬創液中の7日間のインキュベーション後の残留質量の割合をモニタリングすることによって酵素的な生分解研究を行った。NCL足場は、最初の3日間で最初はより速い分解速度を示し、4日間連続してゆっくりと減少した。他方では、CL足場は劣化の長期化率を示した。足場の架橋は、機械的特性およびネットワーク強度を増強し、その結果、劣化率が低下し、劣化に対する耐性の向上を示した。

薬物放出試験は、CLおよびNCL足場に対して120時間行われた。一般に、足場の薬物放出係数は、毛穴間の相互接続の強化とポリペプチド鎖間の空間の減少により架橋密度が増加するにつれて減少する。薬物放出係数はまた、多孔性指数、水分量、膨潤指数、および架橋の程度によって影響を受ける。我々の研究では、NCL足場からのDOXの27.92±3.45%および63.15±3.78%、CL足場からのDOXの16.54±2.21%および44.43±3.57%がそれぞれ1時間と6時間で放出された。24時間後、NCL足場からのDOXの70%の放出があったのに対し、一方で、CL足場はDOXの70%を解放するのに72時間以上かかった。結果は、足場が架橋が膨潤率および含水率を減少させることによってDOX放出に反比例して影響を及ぼしたことを示した。

インビトロ 抗菌試験
DOX-CL足場抽出物は、グラム陽性生物に対して高い阻害活性(MIC)を示した。DOX-CL足場抽出物の活性が高いのは、サンプルの疎水性の増加が原因である可能性があります。しかしながら、DOX-CL足場抽出物は、細胞壁の浸透障害に起因する可能性があるグラム陰性生物に対して最小限の活性を示した。また、DOX-CLのMICは、CS、CL足場、およびDOXサンプルよりも比較的高く、これはDOX-CL抽出物におけるDOXおよびCSの相乗活性に起因する可能性がある。

インビトロ 生体適合性試験
イン ビトロ 生体適合性試験を線維芽細胞(3T3-L1)に対して行った。線維芽細胞は、ECMおよびタンパク質の生産を担当しています。さらに、創傷治癒に必要なフレームワークの形成を強化することにより、構造的完全性を維持する上で重要な役割を果たす。結果は、DOX-CL足場およびCL足場が細胞毒性を生じなかったことを示す。しかし、両足場群は、足場の毛穴における線維芽細胞の細胞増殖および分化を用いて観察され、調製された足場が生体適合性であることを示す。両群における細胞増殖および分化の増加は、主に足場構造における細胞外マトリックスとしてのCSおよびCOLの存在によるものである。

また、DOXによるPI3K-AKTシグナルの活性化に起因するCL足場のそれよりもDOX-CL足場群と比較して高い細胞増殖が観察され、細胞増殖および生存 ²⁵を担う。

インビボ 創傷治癒研究
DMの様々な合併症は、DWの長期治癒の原因です。ラットの糖尿病状態を模倣するために、高脂肪食を与え、続いてSTZの腹腔内注射を行った。2-3日間の糖尿病確認の後、胸部胸部の皮膚の切除によって開いた創傷が生じた。治療は、それぞれの足場で21日間行った。創傷領域の減少は、0日目、7日目、14日、21日目にすべての群について決定した。DOX-CL足場で治療した糖尿病ラットは、CL足場群および未治療群と比較してかなりの程度の創傷収縮を示した。

創傷治癒の炎症期は、機能的バリア形成を担う。次の段階では、創傷治癒の増殖期が創傷ケアにおいて注目を集め、その中で、創傷領域の43%がDOX-CL足場群で観察された。これに対し、7日目にCL足場と未治療群でそれぞれ23%と7%しか観察されなかった。画像(図5)から、創傷の収縮は炎症および増殖期が完了した後に開始された。DOX-CL足場群は、抗炎症および抗感染作用を担うDOXの存在により著しい創傷収縮を示した。さらに、足場のCOLおよびCSは、細胞増殖、分化、および移動を助け、21日間でDW治癒の99%をもたらした。

未治療の切除傷は、7日目の傷害後に好中球、リンパ球、および単球を示した。先に述べたように、好中球は創傷治癒の初期段階で創傷デブリドメントを助ける。また、好中球の過剰量は、正常な組織を損傷することによって治癒プロセスに悪影響を及ぼす可能性があります。Doviらが報告したように、好中球の数が最も少ない数は、再上皮化プロセス ²⁶を加速する。

また、ドックス-CL足場処理群におけるマクロファージ、ヒステオサイト、および大規模な多核細胞の増加は、損傷した細胞を修復し、COL合成を促進することによって、創傷治癒を加速させる環境を支持した。また、組織とのCOL融合は、全ての群においてヒドロキシプロリンレベルを用いて決定した。しかし、ドキシ-CL足場処理群とは、未処理およびCL足場処理群よりも比較的高いヒドロキシプロリンレベルが観察された。文献に記載されているように、糖尿病状態における長期炎症期は、治癒の他の段階を妨げる。DOX-CL足場における創傷収縮の速い速度は、DOXの抗炎症特性に起因し、その結果、創傷のさらなる段階が適切な時間相で起こり、創傷治癒を加速させる。

ELISA試験を用いたMMP-9レベルの生化学的推定は、DOX-CL足場処理群が、処理されたCL足場および未治療群のものと比較してMMP-9の減少したレベルを示したことを明らかにした。文献によると、MMP-9の増加レベルは、マトリックス分解を担当し、ひいては創傷治癒プロセスを延長する。DOXは、抗炎症剤であり、COL破壊を予防する理由と考えられるMMP-9レベルを阻害し、DW治癒を加速させる。これらの結果は、リンデマンら、2009年、張ら、2014 ^27、28によって以前に発表された研究と一致している。

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

著者らはアシシュ・D・ワドワニ博士に感謝する。(インド・ウーティ薬学部薬学院薬学院薬学科薬学科助教授・部長)

著者らは、ニューデリーの大学および高等教育機関(DST-FIST)の科学技術インフラ改善基金である科学技術省が私たちの部門を支援してくれたことに感謝したいと考えています。

著者はまた、三十氏に感謝したいと思っています。Sとスリラムさん。ビデオ撮影で彼らのサポートのためのナルクラM.ファームの学生。

この研究は、JSS高等教育研究アカデミー(JSSAHER)によって支援されました。