JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وقد استوفت سقالة DOX-CL المعدة الشروط المسبقة لارتداء ملابس DW مثالية في القوة الميكانيكية والمسامية وامتصاص المياه ومعدل التدهور والإفراج المستمر والتوافق البيولوجي المضاد للبكتيريا والخصائص المضادة للالتهابات ، والتي تعتبر ضرورية لاستعادة الأنسجة التالفة في DWs.

Abstract

أحد المضاعفات الرئيسية لمرض السكري هو الجروح السكرية (DW). المرحلة المطولة من الالتهاب في مرض السكري يعوق مراحل أخرى من إصابة مما يؤدي إلى تأخر التئام الجروح. اخترنا دوكسيسيكلين (DOX) ، كدواء محتمل للاختيار ، بسبب خصائصه المضادة للبكتيريا إلى جانب خصائصه المضادة للالتهابات المبلغ عنها. تهدف الدراسة الحالية إلى صياغة سقالات دوكس المحملة بالكولاجين-الشيتوزان غير المترابطة (NCL) والمتشابكة (CL) وتقييم قدرتها على الشفاء في حالات السكري. تكشف نتيجة توصيف السقالات أن سقالة DOX-CL تحمل مسامية مثالية ، ومعدل تورم وتدهور منخفض ، وإطلاق مستمر من DOX مقارنة بسقالة DOX-NCL. تكشف الدراسات المختبرية أن سقالة DOX-CL كانت متوافقة بيولوجيا ونموا معززا للخلايا مقارنة بسقالات CL المعالجة ومجموعات التحكم. وقد أظهرت الدراسات المضادة للبكتيريا أن سقالة DOX-CL كانت أكثر فعالية من سقالة CL ضد البكتيريا الأكثر شيوعا الموجودة في DW. باستخدام نموذج العقديات والحمية عالية الدهون الناجمة عن DW ، لوحظ معدل أسرع بشكل ملحوظ (p≤0.05) من تقلص الجروح في المجموعة المعالجة بسقالة DOX-CL مقارنة بتلك الموجودة في سقالة CL المعالجة ومجموعات التحكم. يمكن أن يثبت استخدام سقالة DOX-CL أنه نهج واعد للعلاج المحلي ل DWs.

Introduction

مرض السكري (DM) هو حالة حيث فشل الجسم في تقديم الأنسولين أو التفاعل مع نتائجه في الهضم غير طبيعي من السكريات واضحة يجلب طفرة في جلوكوز الدم 1. التشابك الأكثر تتاليا وسحقا من DM هو الجرح السكري (DW). ما يقرب من 25٪ من المرضى الذين يعانون من DM لديهم الفرصة لبناء DW في حياتهم 1. الشفاء يعوق DW معتمد لاعتلال ثلاثي من DM: اعتلال المناعة, اعتلال الأوعية الدموية, واعتلال الأعصاب. كلما تركت DW دون علاج، فإنه قد يؤدي إلى تطوير الغرغرينا، مما دفع بالتالي إزالة الجهاز المعني 2.

الكثير من العلاجات، مثل إرشاد المرضى (فحص الجرح يوميا، تطهير الجرح، وتجنب الأنشطة التي تخلق الضغط على الجرح، ومراقبة الجلوكوز الدوري، الخ)، والسيطرة على جلوكوز الدم، و debridement الجرح، تفريغ الضغط، الإجراء الطبي، العلاج بالأوكسجين عالي الضغط، والعلاجات المتقدمة هي في الممارسة 3،4. غالبية هذه الأدوية تفشل في تلبية جميع الشروط الأساسية الحيوية لرعاية DW في ضوء الظروف المرضية المرضية متعددة العوامل والنفقات غير المتوقعة المتعلقة بهذه الأدوية 5. على الرغم من أن مرض DW متعدد العوامل ، إلا أن الالتهاب المستمر مع إدارة الأنسجة غير الملائمة ذكر أنه السبب الفعلي لتأخر الشفاء في DWs 5،6.

المستويات المعززة من الوسطاء الالتهابيين والمؤيدين للالتهابات في DW تؤدي إلى انخفاض عوامل النمو المسؤولة عن تأخر التئام الجروح 2،6. اعتماد تشكيل مصفوفة خارج الخلية غير صحيح (ECM) في DWs لزيادة مستويات metalloproteinases مصفوفة (MMPs) مسؤولة عن التدهور السريع لهذه الإدارة شكلت. في MMPs، يتم الإبلاغ عن MMP-9 كوسيط رئيسي مسؤول عن الالتهاب لفترات طويلة وتدهور ECM السريع 7. يذكر أن العلاج المحلي مع دواء مضاد للالتهابات يقلل من مستويات مرتفعة من MMP-9 يعيد تأسيس التوازن الجلدي، وترتيب الإطار ويطالب الشفاء أفضل من DWs 8،9.

تم اختيار Doxycycline (DOX) ، وهو مثبط MMP-9 ، لقمع المستويات المرتفعة من MMP-9 ، وهو وسيط التهاب رئيسي مسؤول عن الالتهاب المستمر في DWs 10و11و12. وبالإضافة إلى ذلك، DOX تمتلك مضادات الأكسدة (إنتاج الحرة هيدروكسي والجذور فينوكسي قادرة على ربط مع أنواع الأكسجين التفاعلي) 13 ومكافحة أبوبتوتيك (تمنع التعبير كاسباس واستقرار الميتوكوندريا) 14 الأنشطة التي تعتبر ضرورية لعلاج DW. تم اختيار ترتيب الأطر التي تحتوي على DOX والكولاجين (COL) والشيتوزان (CS). اختيار COL يعتمد على الطريقة التي يساعد في توفير الإطار اللازم المسؤول عن القوة الميكانيكية وتجديد الأنسجة 15. من ناحية أخرى، CS هو متجانسة هيكليا لغليكوسامينوغليكان، المرتبطة عدة مراحل التئام الجروح. وتفيد التقارير أيضا أن CS يحمل خاصية كبيرة مضادة للبكتيريا 15. وبالتالي ، يتم صياغة سقالة COL / CS من DOX لقمع الالتهاب المطول ، يليه دعم تشكيل المصفوفة لتضميد الجروح بنجاح في ظروف DM.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية التي أجريت من قبل اللجنة الأخلاقية الحيوانية المؤسسية لكلية JSS للصيدلة ، Ooty ، الهند.

1. إعداد DOX تحميل السقالات المسامية عن طريق طريقة تجميد التجفيف

  1. أضف 1.2 غرام من كول إلى 100 مل من الماء (على سبيل المثال، ميليبور) والحفاظ على جانبا لتورم.
  2. حرك تشتت COL المتورم في 2000 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها لضمان الانحلال الكامل ل COL.
  3. إعداد محلول CS عن طريق حل ما يقرب من 0.8 غرام من CS في 100 مل من حمض الخليك 1٪.
  4. قم بتحريك حل CS بين عشية وضحاها عند 2000 دورة في الدقيقة لضمان التشتت الموحد.
  5. مزيج DOX (1٪ ث / v)، تليها حل CS، إلى حل COL، ويحرك لمدة 30 دقيقة.
  6. تصفية الخليط المادي الذي تم الحصول عليه باستخدام قطعة قماش الموسلين لإزالة الجسيمات.
  7. تجميد عميق في filtrate التي تم الحصول عليها في -85 درجة مئوية ± 4 درجة مئوية لحوالي 24 ساعة.
  8. Lyophilize خليط التجميد العميق في -85 درجة مئوية ± 4 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
  9. تخزين السقالات التي تم الحصول عليها في desiccator لمزيد من التحليل 16،17.

2. الربط المتبادل من سقالة

  1. حل MES (0.488 غرام) في 50 مل من الماء.
  2. نقع 50 ملغ من سقالة DOX محملة في 20 مل من العازلة MES لمدة 30 دقيقة.
  3. امزج 19.5 مل من المخزن المؤقت ل MES مع 0.1264 جرام من EDC و0.014 جرام من NHS في كوب منفصل.
  4. تزج السقالة في خليط العازلة لمدة 4 ساعة لتحقيق crosslinking 16.
  5. تخزين DOX تحميل السقالات (CL) وغير مترابطة (NCL) لمزيد من التقييم.

3. توصيف السقالات

  1. الفحص المورفولوجي باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM)
    1. تميز السقالات للتحليل المورفولوجي باستخدام SEM (1 سم × 1 سم × 0.5 سم).
    2. وصمة عار المقطع العرضي والسطح الخارجي للسقالة مع طبقة حساسة من الذهب (~ 150 Å).
    3. التقط الصورة الفوتوغرافية بجهد الإثارة الذي قدره 5 كيلو فولت و10 كيلو فولت.
    4. ضع العينات في كعب الألومنيوم وأرفقها بالذهب في حوالي 9 فولت.
    5. قياس سقالة باستخدام SEM مع زيادة القرار في 10 كيلو فولت.
  2. تحديد المسامية
    1. قياس المسامية من السقالات باستخدام طريقة التشريد السائل (الإيثانول) 18.
    2. حساب المسامية من السقالات باستخدام الصيغ أدناه.
      figure-protocol-2326
      Ww = الوزن الرطب للسقالة
      Wd = الوزن الجاف للسقالة
      Wv = حجم السقالة
  3. تحديد قدرة امتصاص المياه
    1. قياس الوزن الجاف للسقالة.
    2. احتضان السقالة وزنها في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في الفوسفات العازلة المالحة (PBS) درجة الحموضة 7.4.
    3. إزالة برنامج تلفزيوني الزائدة على السقالة باستخدام ورقة التصفية.
    4. قياس قدرة امتصاص المياه باستخدام الصيغ أدناه 17.
      figure-protocol-2861
      WS = النسبة المئوية لامتصاص الماء
      W1= وزن الرطب من السقالة
      W0= الوزن الجاف للسقالة
  4. تدهور السقالة
    1. احتضان السقالة (1cm × 1cm) في 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام في برنامج تلفزيوني من درجة الحموضة 7.4 التي تحتوي على lysozymes.
    2. غسل السقالة لإزالة أي أيونات ملتصقة على السطح.
    3. تجميد الجافة سقالة غسلها 17.
    4. حساب معدل التدهور باستخدام الصيغ.
      figure-protocol-3389
      Ww = الوزن الأولي للسقالة
      WD = وزن السقالة بعد تجميد التجفيف
  5. دراسات إطلاق المختبر
    1. تحديد سلوك الافراج عن DOX من سقالة باستخدام طريقة كيس غسيل الكلى.
    2. تفريق السقالة في بضع ملليلترات من السائل الجرح محاكاة (pH 7.4) ونقله إلى كيس غسيل الكلى.
    3. أغلق بإحكام نهايات كيس الغشاء وانغمس في 500 مل من محلول سائل الجرح المحاكي.
    4. حرك محلول سائل الجرح الذي يحتوي على كيس غسيل الكلى عند 200-250 دورة في الدقيقة.
    5. جمع الحل supernatant واستبداله بكمية متساوية من محلول المخزن المؤقت الطازجة في فترات زمنية محددة.
    6. تحديد النسبة المئوية لإطلاق DOX من السقالات في محلول فائق التناسخ باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية المرئية في 240 نانومتر.

4. في المختبر دراسات مضادة للبكتيريا

  1. تحديد الحد الأدنى من تركيز المثبطة (MIC) من CL و DOX-CL السقالات ضد S. أوريوس, S. البشرة, E. القولونية, P. aeruginosa باستخدام طريقة تخفيف مرق الصغيرة.
  2. إعداد الثقافات البكتيرية باستخدام مرق مولر هينتون بنسبة 1:1000 للحصول على 0.5 عكر ماكفارلاند.
  3. إضافة د الجلوكوز (800 ملغ / ديسيلت) إلى الثقافات البكتيرية لفرط السكر 19،20.
  4. Mince و solubilize وCL و DOX-CL في DMSO (التحكم السلبي).
  5. تخفيف التعليق البكتيري مفرط الغليكة (100 ميكرولتر) عينات الاختبار (100 ميكرولتر من محلول السقالات) في 96 لوحة بئر.
  6. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 20-24 ساعة.
  7. تسجيل امتصاص في الطول الموجي من 600 نانومتر 21.

5. في المختبر دراسات التوافق البيولوجي

  1. تقييم التوافق البيولوجي للسقالات المعدة باستخدام MTT [(3-(4، 5 ثنائي ميثيل ثيازول-2 yl) -2، 5-ديفينيل رباعي البروميد)] المقايسة.
  2. تعقيم السقالات من البعد القياسي ووضعها في 24 لوحات البئر.
  3. إضافة خلايا 3T3-L1 إلى لوحة البئر 24 واحتضانها لمدة 72 ساعة.

6. في الدراسات الحيوانية في الجسم الحي

  1. تحريض DM والجرح استئصال
    1. إطعام الحيوان مع اتباع نظام غذائي عالي الدهون لمدة أسبوعين وإعطاء جرعة واحدة من streptozotocin (STZ) (50 ملغ / كجم وزن الجسم) في محلول عازل سيترات intraperitoneally للفئران المهق ويستار (180-200 غرام) لتحريض مرض السكري من النوع 2.
    2. اختيار الحيوانات مع جلوكوز الدم المستمر من 250 ملغ / ديسيلت للدراسة.
    3. عشوائية الحيوانات المختارة لتحريض جروح ختان الأعصاب.
    4. تخدير الفئران السكري باستخدام الأثير diethyl (تمت إضافة 5 مل إلى غرفة التخدير المشبعة مسبقا) وتأكيد استخدام طريقة قرصة إصبع القدم ولون الغشاء المخاطي.
    5. حلق المنطقة الظهرية (الصدر الظهري، المنطقة القطنية) باستخدام أداة تشذيب وشفرات مطهرة (A40).
    6. تعقيم منطقة حلق مع مسحة الكحولية.
    7. استئصال الجلد (2 × 2 سم2 وعمق 1 ملم) مع شفرة A40 الجراحية العقيم على منطقة حلق لخلق جرح مفتوح.
    8. تقسيم الحيوانات إلى ثلاث مجموعات (المجموعة 1- السيطرة على الأمراض (السيطرة)، المجموعة 2- سقالة CL (وهمي)، المجموعة 3- سقالة DOX CL)، كل مجموعة تتكون من 6 فئران.
    9. لصق سقالات CL و DOX CL باستخدام الشريط الجراحي وتغطية مجموعة التحكم بالشاش العقيم لمدة 21 يوما.
    10. تتبع منطقة الجرح على ورقة OHP معقمة وقياس النسبة المئوية للحد من الجرح باستخدام طريقة الشبكة في الأيام 0 و 7 و 14 و 21 لجميع المجموعات.
    11. حساب نسبة الحد من الجرح باستخدام الصيغ أدناه.
      figure-protocol-6818

7. الدراسات الهستوباثولوجية

  1. عزل منطقة الجرح تلتئم في أيام 7, 14, و 21, تخزين في حل الفورماتين (10٪).
  2. قسم الأنسجة باستخدام microtome للحصول على سمك 6 ميكرومتر.
  3. جبل المقاطع على شريحة زجاجية وصمة عار باستخدام Hematoxylin وeosin 17.
  4. التقط الصور تحت تكبير 40x باستخدام مجهر رقمي.

8. تقدير هيدروكسي برولين

  1. عزل منطقة الجرح الملتئم في الأيام 0 و 7 و 14 و 21 للتقييم.
  2. تقدير محتوى الهيدروكسي برولين باستخدام الإجراء الذي وصفه ريدي G وآخرون، 1996 22.

9. اختبار إليسا

  1. تقدير مستويات MMP-9 باستخدام مجموعة إليسا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. عزل عينات الأنسجة من منطقة الجرح تلتئم في اليوم 21 ومفروم باستخدام متجانس الأنسجة.
  3. الطرد المركزي المتجانسة التي تم الحصول عليها وجمع supernatant.
  4. تمييع supernatant في 100 أضعاف باستخدام المخزن المؤقت المقايسة.
  5. مسح اللوحة ضوئيا باستخدام قارئ لوحة متعددة.

10. التحليل الإحصائي

  1. تمثيل النتائج التي تم الحصول عليها على أنها متوسط ± SD.
  2. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام المنشور لوحة الرسم البياني v5.01.
  3. تحقيق الأهمية الإحصائية باستخدام تحليل اتجاه واحد للتباين (ANOVA) واختبار Dunnet اللاحق.
  4. النظر في القيم مع p≤0.05 كما كبيرة.

النتائج

توصيف DOX تحميل NCL وسقالة CL
على الفحص البصري، تم العثور على سقالة NCL وCL أن يكون كريم في اللون. الى جانب ذلك ، يبدو أن كلا السقالات مثل الإسفنج ، قاسية وغير متانة عند فحصها جسديا. تظهر صور SEM لسقالات NCL وCL في الشكل 1. ومن هذا الرقم، كان من الواضح أن هناك انخفاضا في حجم المسام بعد الربط المتبادل عن طريق تكوين روابط بين الجزيئات. كما تبين أن مسامية سقالات NCL وCL تبلغ 92.3±4.21 و71.35±2.65 على التوالي. وكانت النسبة المئوية لامتصاص المياه من السقالات NCL وCL 750±11.4٪ و 492±8.66٪ في فترات زمنية 24 ساعة.

وبالإضافة إلى ذلك، أجريت دراسات التحلل البيولوجي لمدة سبعة أيام في سائل الجروح المحاكاة من درجة الحموضة 7.4، التي تتألف من lysozymes. وأظهرت سقالة NCL معدل أسرع من التدهور في البداية في الأيام الثلاثة الأولى وانخفضت ببطء لمدة أربعة أيام متتالية. على الجانب الآخر ، أظهرت سقالة CL معدل تدهور طويل. الربط المتبادل للسقالة تعزيز الخصائص الميكانيكية وقوة الشبكة التي، بدورها، أدى إلى انخفاض معدل التدهور، مما يدل على تحسين المقاومة للتدهور(الشكل 2).

وعلاوة على ذلك، تم تنفيذ الافراج في المختبر من DOX من سقالة NCL وCL لمدة 120 ساعة (الشكل 3). في 1 ساعة الأولية، 27.92±3.45٪ تم الافراج عن DOX من سقالة NCL، في حين تم الافراج عن 16.54±2.21٪ DOX فقط من سقالة CL. بعد 6 ساعة، زاد إطلاق DOX من السقالات بنسبة 63.15±3.78٪ في سقالة NCL و 44.43±3.57٪ في سقالة CL. بعد 24 ساعة، كان هناك إطلاق سراح 70٪ DOX من سقالة NCL، في حين استغرق سقالة CL أكثر من 72 ساعة لإطلاق سراح 70٪ من DOX. وبناء على النتائج التي تم الحصول عليها، تم اختيار سقالة CL المحملة من DOX لمزيد من التقييم وتمثيلها كسليلة DOX-CL. في حين تم تعيين سقالة CL دون DOX (وهمي) كما سقالة CL.

في المختبر دراسات مضادة للبكتيريا
المرضى الذين يعانون من DW عادة تجربة العدوى التي تؤدي إلى التئام الجروح لفترات طويلة. وهكذا، تم فحص السقالات المعدة لنشاطها المضاد للبكتيريا باستخدام هيئة التصنيع العسكري ضد لوحة مختارة من البكتيريا(الجدول 1). من النتائج، فمن الواضح أن DOX أظهرت نشاط مثبط مع هيئة التصنيع العسكري من <4 ميكروغرام / مل ضد كل من S. أوريوس وS. البشرة. ولوحظ وجود هيئة التصنيع العسكري من <8 ميكروغرام / مل و 16 < ميكروغرام / مل ضد كولاي وP. aeruginosa. وحدها الشيتوزان وCL سقالة استخراج أظهرت الحد الأدنى من النشاط ضد الكائنات الحية المختارة مثل S. أوريوس (<64 ميكروغرام / مل)، S. البشرة (<64 ميكروغرام / مل)، E. القولونية (<128 ميكروغرام / مل)، وب. aeruginosa (<128 ميكروغرام / مل). وقد أظهرت سقالة DOX-CL نشاط مثبط مماثل مع هيئة التصنيع العسكري من <2 ميكروغرام / مل ضد كل من S. أوريوس وS. البشرة. علاوة على ذلك ، عرضت سقالة DOX-CL أنشطة معتدلة مع هيئة التصنيع العسكري من <8 ميكروغرام / مل ضد الإشريكية القولونية وP. aeruginosa.

دراسة التوافق البيولوجي في المختبر
تم إجراء فحص MTT لتحديد الجدوى الخلوية لخلايا 3T3-L1 في وجود سقالات CL و DOX-CL. وتجسد النتائج أن سقالات CL و DOX-CL لم تحفز أي سمية خلوية. وعلاوة على ذلك، كانت الجدوى الخلوية أعلى نسبيا في المجموعات المعالجة سقالة مما كانت عليه في السيطرة، مما يمثل النمو المعزز للخلايا الليفية في وجود السقالات(الشكل 4).

في دراسات التئام الجروح في الجسم الحي
تم تحديد متوسط مساحة الجرح انخفض في جميع المجموعات باستخدام الأسلوب الرسومي في الأيام 0 و 7 و 14 و 21(الشكل 5). في الفحص البصري ، كانت الجروح في سقالة CL و DOX-CL المجموعات المعالجة خالية من النضح في اليوم السابع. وفي الوقت نفسه، كانت الجروح في مجموعة المراقبة تنضح. وفي اليوم الرابع عشر، لوحظ وجود جرب جاف في جميع المجموعات؛ ومع ذلك ، لوحظ معدل أسرع من تقلص الجرح في سقالة DOX-CL (89.663٪). في اليوم 21 ، تلتئم 99.9 ٪ من الجرح ، وشكلت ندبة في سقالة DOX-CL ، في حين لوحظ الشفاء الجزئي في السيطرة ومجموعات CL سقالة المعالجة.

دراسة علم الأمراض الهسثولوجية
أظهرت الملاحظة الهستوباثولوجية لاالتئام الجروح في اليوم السابع بعد الإصابة اضطراب جميع طبقات الجلد على حواف الجرح في جميع المجموعات. لم يكن هناك رؤية للبشرة. ومع ذلك ، لوحظ العدلات السائدة مع الخلايا الأحادية المتقطعة والخلايا الليمفاوية في مجموعة التحكم. في مجموعة CL السقالة المعالجة ، لوحظت رؤية معتدلة للبشرة جنبا إلى جنب مع عدد قليل من العدلات وال الضامة. في حين أنه في مجموعة معالجة سقالة DOX-CL ، تم تغطية الجرح بطبقة ضئيلة من البشرة ، مما يمثل مرحلة إعادة الإبط. كما شوهدت العدلات الخفيفة وال الضامة ، جنبا إلى جنب مع أنسجة التحبيب ، في كثير من الأحيان في مجموعة سقالة DOX-CL المعالجة.

وفي اليوم الرابع عشر بعد الإصابة، تبين أن الجروح في جميع المجموعات مغطاة بأدمة. في مجموعة التحكم ، لوحظ أن طبقة البشرة التي تشكلت هي طبقة ضئيلة جدا إلى جانب العدلات السائدة. في المجموعة المعالجة سقالة CL، كانت طبقة البشرة التي تشكلت أكثر سمكا من تلك الموجودة في مجموعة التحكم، جنبا إلى جنب مع خلايا ضخمة خفيفة متعددة النوى. في المجموعة المعالجة سقالة DOX-CL، كان البشرة المتقدمة أكثر سمكا بالمقارنة مع مجموعات أخرى، جنبا إلى جنب مع عدد وفير من الخلايا الهيتية والخلايا متعددة النوى العملاقة. ولوحظ أيضا المنطقة الكثيفة من الخلايا الليفية في المجموعة المعالجة سقالة DOX-CL.

في اليوم 21 بعد الإصابة ، في مجموعة التحكم ، انخفض عدد مهيمن من العدلات جنبا إلى جنب مع تكرار الضامة والخلايا الهيتية التي تمثل الالتهاب المتناقص. في حين أنه في المجموعة المعالجة سقالة CL ، لوحظ عدد معتدل من الخلايا الهستية والخلايا الليمفاوية. لوحظ أن البشرة التي تشكلت أكثر سمكا بشكل كبير في مجموعة سقالة DOX-CL المعالجة من تلك الموجودة في مجموعة التحكم ، إلى جانب عدد غني من الخلايا الهيتية والخلايا الليمفاوية والخلايا المتعددة النوى الضخمة. في المجموعة المعالجة سقالة DOX-CL، انخفض عدد العدلات في اليوم 7. أيضا ، لوحظ تجمع الضامة ومتغيراتها المورفولوجية مثل الخلايا الضخمة متعددة النوى والخلايا النسيجية في اليومين 14 و 21(الشكل 6).

تقدير هيدروكسي برولين
تقدير هيدروكسي برولين هو مقياس غير مباشر لكمية الكولاجين الموجودة في التئام الجروح. ارتفاع تركيز الهيدروكسي برولين يعين نسبة سريعة من التئام الجروح. وكشف الفحص الكيميائي الحيوي عن كمية أكبر من الهيدروكسي برولين في المجموعة المعالجة سقالة DOX-CL تليها مجموعة CL سقالة المعالجة من تلك الموجودة في مجموعة التحكم(الشكل 7).

تقدير MMP-9 باستخدام مجموعة إليسا
تم تقليل محتوى MMP-9 في مجموعة سقالة DOX-CL المعالجة بشكل كبير مقارنة بأولئك الذين يتحكمون ، ومجموعة CL السقالة المعالجة. في حين أن محتوى MMP-9 في مجموعة CL السقالة المعالجة كان أقل هامشيا مقارنة بمجموعة سقالة DOX-CL المعالجة ، كما هو موضح في الشكل 8.

figure-results-6821
الشكل 1: Morphology DOX تحميل COL - CS سقالة أ)قبل CL وب)بعد تحديد CL من قبل SEM في نطاق مقياس 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7278
الشكل 2:تدهور مصفوفة DOX محملة في سقالات NCL وCL من اليوم 1 إلى 7 في الرقم القياسي PH PBS 7.4 في 37 درجة مئوية تظهر NCL تدهورت تدريجيا لمدة 7 أيام. وعلى عكس ذلك، يشير انخفاض معدل تدهور سقالة CL إلى حد كبير إلى تعزيز المقاومة للتدهور الأنزيمي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7835
الشكل 3: في المختبر الافراج عن المخدرات ملف DOX من NCL وC CL السقالات في برنامج تلفزيوني الرقم القياسي 7.4 في 37° C تظهر الإفراج بطيئة من المخدرات في جميع صياغة تليها الإفراج المستمر. البيانات المعبر عنها على أنها متوسط ± SD (n=3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8381
الشكل 4: 3T3-L1 الخلايا المستزرعة في وجود CL و DOX-CL السقالات تظهر نمو الخلية النسبة المئوية أكثر في مجموعة DOX-CL سقالة المعالجة تليها سقالة CL المعالجة والسيطرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8860
الشكل 5: (أ) صور تمثل انخفاضا في متوسط منطقة الجرح في السيطرة، سقالة CL ودوكس-CL سقالة تعامل المجموعات في اليوم 0، 7، 14 و 21 وظيفة الجرح. (ب) تمثيل رسومي للحد من متوسط منطقة الجرح في السيطرة، سقالة CL ودوكس-CL سقالة مجموعات المعالجة في اليوم 0، 7، 14 و 21 وظيفة الجرح. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SD (n = 6 جروح / مجموعة). تم الحصول على الأهمية الإحصائية من خلال تحليل الفرق بطريقة واحدة (ANOVA) يليه اختبار Dunnet اللاحق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9645
الشكل 6: التغيرات النسيجية خلال عملية التئام الجروح في STZ ومرض السكري الناجم عن النظام الغذائي الغني بالدهون في جلد الفئران المهق في الأيام 7 و 14 و 21 دون (السيطرة) ومع العلاج (CL و DOX-CL السقالات) في نموذج الجرح استئصال سمك كامل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-10193
الشكل 7:النتيجة التي تمثل محتوى الهيدروكسي برولين في الجروح في الأيام 0 و 7 و 14 و 21 كمؤشر لتقدير مستوى الكولاجين غير المباشر. يتم التعبير عن النتائج في هيدروكسي برولين ميكروغرام / ملغ من أنسجة الجرح الجاف. تمثل البيانات متوسط±SD (n = 6 الجروح / المجموعة). تم الحصول على الأهمية الإحصائية من خلال تحليل الفرق بطريقة واحدة (ANOVA) يليه اختبار Dunnet اللاحق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-10865
الشكل 8:رسم بياني يمثل مستويات MMP-9 في التجانسات التي تم الحصول عليها من الجروح الملتئمة في STZ ونموذج الفئران السكري الناجم عن النظام الغذائي الغني بالدهون في اليوم 21. تم تحديد مستويات MMP-9 في 100 أضعاف aliquots من سوائل الجرح باستخدام تحليل ELISA. تمثل البيانات متوسط±SD (n = 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هيئة التصنيع العسكري (ميكروغرام/ مل)
عينة اختبارس. أوريوسس. البشرةالإشريكية القولونيةب. أيروجينوسا
DOX<4<4<8<16
CS<64<64<128<128
CL سقالة استخراج<64<64<128<128
مستخلص سقالة DOX-CL<2<2<4<4

الجدول 1: الحد الأدنى من التركيز المثبط للسقالات CS، DOX، CL، و DOX-CL ضد لوحة مختارة من البكتيريا.

Discussion

وكان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة لتحديد تأثير DOX تحميل COL-CS سقالة على DW الشفاء في الفئران. تم إعداد CL و NCL وتقييمها من حيث مورفولوجيا، مؤشر تورم، في الحركية الافراج في المختبر، والتوافق البيولوجي.

توصيف DOX تحميل NCL وسقالة CL
تم العثور على السقالات المعدة لتكون مسامية مع المسام المترابطة. هذه المسام المترابطة تضمن طبيعة مسامية وإسفنجية تساعد في الانتشار السليم للأوكسجين والمواد المغذية إلى الخلايا من أجل الانتشار والهجرة، مما يؤدي إلى تسريع الشفاء. هنا، كان حجم المسام يعتمد بشكل رئيسي على الربط المتبادل. أدى الربط المتبادل للسقالة إلى انخفاض حجم المسام من خلال تشكيل تفاعلات قوية داخل الجزيئات من قبل EDC / NHS مع CS و COL ، مما زاد من القوة الميكانيكية للسقالة.

يعتمد مؤشر المسامية على الكثافة النسبية ، وهي وظيفة من كتلة الدعامات الإسفنجية والحجم. عموما، انكماش حجم السقالة يحدث إذا عامل الربط المتبادل يغير موقف الدعامات عن طريق سحبها أقرب إلى بعضها البعض، مما يؤدي إلى تكثيف سقالة. ومع ذلك ، في حالة كيمياء كاربوديميد ، لا يتوقع زيادة في كتلة السقالة بسبب آليتها الفريدة ، أي إدخال الربط بين أميدي (O = C-NH) باستخدام carboxylic (>COOH) ومجموعة أمين (-NH) من سلسلة الببتيد المجاورة دون الدخول في السقالة. وفي الوقت نفسه، قد يحدث فقدان جماعي طفيف أثناء الوصلات المتقاطعة بسبب انحلال سلاسل البوليمر غير المرفقة وهجرتها. ومع ذلك ، في حالة علاج السقالات مع EDC / NHS لم تنتج أي تأثير ملحوظ على مورفولوجيا السقالات.

قدرة السقالة على امتصاص السائل البيولوجي أمر بالغ الأهمية في تقييم مدى ملاءمتها كناقل للمخدرات. خاصية امتصاص المياه لا يؤثر فقط على شكل السقالة ولكن أيضا يؤثر على نمو الخلية. ولوحظ أن سقالة CL أظهرت معدل امتصاص المياه أقل من سقالة NCL ، والتي يمكن أن تعزى إلى الربط المتبادل للسقالة. وعلاوة على ذلك، انخفض إلى حد كبير من هيدروفيلي من المواد سقالة بعد الربط المتبادل بسبب '1' فقدان المجموعات المائية (>COOH و-NH) في عملية تكوين الروابط وسط؛ '2' تثبيط التورم عن طريق تكوين روابط جديدة (O= C-NH). هذه النتائج هي في اتفاق جيد مع التقارير المنشورة سابقا 23،24.

أجريت دراسة التحلل الحيوي الأنزيمي من خلال رصد النسبة المئوية للكتلة المتبقية بعد سبعة أيام من الحضانة في سائل الجرح المحاكاة من درجة الحموضة 7.4، التي تتألف من lysozymes. وأظهرت سقالة NCL معدل تدهور أسرع في البداية في الأيام الثلاثة الأولى وانخفضت ببطء لمدة أربعة أيام متتالية. على الجانب الآخر ، أظهرت سقالة CL معدلا مطولا من التدهور. وأدى الربط المتبادل للسقالة إلى تعزيز الخصائص الميكانيكية وقوة الشبكة التي أدت بدورها إلى انخفاض معدل التدهور، مما يدل على تحسن المقاومة للتدهور.

أجريت دراسات إطلاق المخدرات لسقالات CL و NCL لمدة 120 ساعة. بشكل عام ، ينخفض معامل إطلاق المخدرات في السقالة مع زيادة كثافة الربط المتبادل بسبب تعزيز الترابط بين المسام وانخفاض المساحة بين سلاسل البوليبتيد. يتأثر معامل إطلاق الدواء أيضا بمؤشر المسامية ومحتوى الماء ومؤشر التورم ودرجة الارتباط المتبادل. في دراستنا، 27.92±3.45٪ و 63.15±3.78٪ من DOX من سقالة NCL، في حين تم إصدار 16.54±2.21٪ و 44.43±3.57٪ من DOX من سقالة CL في 1 ساعة و 6 ساعة، على التوالي. بعد 24 ساعة، كان هناك إطلاق سراح 70٪ من DOX من سقالة NCL، في حين؛ استغرق سقالة CL أكثر من 72 ساعة للافراج عن 70٪ من DOX. وأظهرت النتائج أن السقالة المتقاطعة أثرت عكسيا على إطلاق DOX عن طريق تقليل نسبة التورم ومحتوى الماء.

في المختبر دراسات مضادة للبكتيريا
أظهر مستخلص سقالة DOX-CL نشاطا مثبطا أعلى (MIC) ضد الكائنات الإيجابية للجرام. قد يكون النشاط الأعلى لاستخراج سقالة DOX-CL بسبب زيادة رهاب الماء للعينة. ومع ذلك، أظهر استخراج سقالة DOX-CL الحد الأدنى من النشاط ضد الكائنات الحية السلبية الغرام، وربما يرجع ذلك إلى فشل اختراق جدار الخلية. علاوة على ذلك ، كان هيئة التصنيع العسكري من DOX-CL أعلى نسبيا من عينات CS و CL و DOX ، والتي يمكن أن تعزى إلى النشاط التآزري ل DOX و CS في مستخلص DOX-CL.

دراسة التوافق البيولوجي في المختبر
أجريت دراسة التوافق البيولوجي في المختبر على خلايا الخلايا الليفية (3T3-L1). الخلايا الليفية هي المسؤولة عن إنتاج ECM والبروتينات. علاوة على ذلك ، فإنها تلعب دورا حاسما في الحفاظ على السلامة الهيكلية من خلال تعزيز تشكيل الإطار المطلوب لشفاء الجروح. تظهر النتائج أن سقالة DOX-CL وسقالة CL لم تنتج أي سمية خلوية. ومع ذلك ، لوحظت كل من مجموعات السقالات مع نمو الخلايا والتمايز من الخلايا الليفية في مسام السقالة ، مما يشير إلى أن السقالات المعدة كانت متوافقة بيولوجيا. زيادة نمو الخلايا والتمايز في كل من المجموعتين ويرجع ذلك أساسا إلى وجود CS و COL كمصفوفة خارج الخلية في هيكل السقالة.

وعلاوة على ذلك، لوحظ نمو الخلايا أعلى نسبيا مع مجموعة سقالة DOX-CL من أن سقالة CL بسبب تفعيل إشارة PI3K-AKT من قبل DOX، المسؤولة عن نمو الخلايا والبقاء على قيد الحياة 25.

في دراسات التئام الجروح في الجسم الحي
المضاعفات المختلفة ل DM هي المسؤولة عن الشفاء لفترات طويلة من DW. لمحاكاة حالة السكري في الفئران ، تم إعطاء نظام غذائي عالي الدهون ، يليه حقن داخل الصفاق من STZ. بعد 2-3 أيام من تأكيد مرض السكري ، تم إنشاء جروح مفتوحة عن طريق استئصال الجلد في منطقة الصدر الظهري. تم إجراء العلاج لمدة 21 يوما باستخدام السقالات المعنية. تم تحديد انخفاض في منطقة الجرح لجميع المجموعات في الأيام 0 و 7 و 14 و 21. أظهرت الفئران السكرية المعالجة سقالة DOX-CL درجة كبيرة من تقلص الجروح مقارنة بمجموعات سقالة CL والمجموعات غير المعالجة.

المرحلة الالتهابية من التئام الجروح هي المسؤولة عن تشكيل الحاجز الوظيفي. في المرحلة التالية ، تجذب المرحلة التكاثرية من التئام الجروح الانتباه في العناية بالجروح ، حيث لوحظ 43٪ من انخفاض مساحة الجرح مع مجموعة سقالة DOX-CL. وبالمقارنة، لوحظ 23٪ و7٪ فقط باستخدام سقالة CL والمجموعات غير المعالجة في اليوم السابع على التوالي. من الصور (الشكل 5) ، بدأ تقلص الجرح بعد اكتمال المرحلة الالتهابية والتكاثرية. أظهرت مجموعة سقالة DOX-CL تقلصا كبيرا في الجروح بسبب وجود DOX ، المسؤول عن الآثار المضادة للالتهابات والمضادة للعدوى. وعلاوة على ذلك، ساعد COL و CS في السقالة انتشار الخلايا، والتمايز، والهجرة مما أدى إلى 99٪ من DW الشفاء في 21 يوما.

أظهرت الجروح الإستئصالية غير المعالجة العدلات والخلايا الليمفاوية والخلايا الأحادية في اليوم السابع بعد الإصابة. كما ذكر سابقا، العدلات المساعدة في التنفير الجرح في المرحلة المبكرة من التئام الجروح. الى جانب ذلك ، قد يؤثر فرط العدلات سلبا على عملية الشفاء عن طريق إتلاف الأنسجة الطبيعية. كما ذكرت Dovi وآخرون، فإن الحد الأدنى من العدلات يسرع عملية إعادة الظهارة 26.

علاوة على ذلك ، فإن زيادة الضامة والخلايا الهستية والخلايا المتعددة النوى الضخمة في مجموعة معالجة سقالة DOX-CL فضلت البيئة لتسريع التئام الجروح عن طريق إصلاح الخلايا التالفة وتعزيز تخليق COL. وعلاوة على ذلك، تم تحديد دمج COL مع الأنسجة باستخدام مستويات الهيدروكسي برولين في جميع المجموعات. ومع ذلك ، لوحظت مستويات هيدروكسي برولين أعلى نسبيا مع مجموعة سقالة DOX-CL المعالجة من المجموعة المعالجة غير المعالجة وسقالة CL. كما هو مذكور في الأدب ، فإن المرحلة الالتهابية المطولة في حالة السكري تعيق المراحل الأخرى من الشفاء. يمكن أن يعزى المعدل الأسرع لتقلص الجروح في سقالة DOX-CL إلى خاصية DOX المضادة للالتهابات ، مما يؤدي إلى مراحل أخرى من الجرح تحدث في مرحلة الوقت المناسب مما يؤدي إلى التئام الجروح المتسارع.

التقدير الكيميائي الحيوي لمستويات MMP-9 باستخدام اختبار ELISA يكشف عن أن مجموعة سقالة DOX-CL المعالجة أظهرت مستويات انخفاض MMP-9 بالمقارنة مع تلك الموجودة في سقالة CL المجموعات المعالجة وغير المعالجة. وفقا للأدبيات، وزيادة مستويات MMP-9 المسؤولة عن تدهور مصفوفة، والتي بدورها، يطيل عملية التئام الجروح. DOX، وهو عامل مضاد للالتهابات، منعت مستويات MMP-9، والذي يعتبر السبب في منع انهيار COL، مما أدى إلى تسريع الشفاء DW. هذه النتائج تتفق مع الدراسات المنشورة في وقت سابق من قبل Lindeman وآخرون.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون الدكتور أشيش د وضواني. (أستاذ مساعد ورئيس قسم التكنولوجيا الحيوية الصيدلانية، كلية JSS للصيدلة، أوتي، الهند) للمساعدة في دراسات جدوى الخلايا المختبرية.

ويود المؤلفون أن يشكروا قسم العلوم والتكنولوجيا - صندوق تحسين البنية التحتية للعلوم والتكنولوجيا في الجامعات ومؤسسات التعليم العالي (DST-FIST)، نيودلهي، لدعم قسمنا.

كما يود أصحاب البلاغ أن يشكروا السيد سانجو. (س) والسيد (سريرام) Narukulla M. فارم الطلاب لدعمهم في تبادل لاطلاق النار الفيديو.

تم دعم هذا البحث من قبل أكاديمية JSS للتعليم العالي والبحوث (JSSAHER).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)Merck Millipore, Mumbai, IndiaE7750
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES)Merck Millipore, Mumbai, India137074
3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)Thermo Fisher, Mumbai, IndiaM6494
Deep freezer verticleLabline Instruments, Kochi, India
Dialysis sackMerck Millipore, Mumbai, IndiaD6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da
DoxycyclineSigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, IndiaD9891
Elisa kitR&D SystemsRMP900
Escherichia coli (E. coli)National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, IndiaNCIM 2567
EthanolMerck Millipore, Mumbai, India100983
Lyophilizer-SZ042Sub-Zero lab instruments, Chennai, India
Mechanical Stirrer-RQ-122/DRemi laboratory instruments, Mumbai, India
Medium molecular weight ChitosanSisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India18824
Microtome-RM2135Leica, U.K
Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1)National Centre for Cell Sciences, Pune, India
Multiple plate reader -Inifinte M200 ProTecan Instruments, Switzerland
N-hydroxy succinimide (NHS)Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India130672
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, IndiaNCIM 2036
Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800Hitachi, India
Sodium hydroxide (NaOH) pelletsQualigen fine chemicals, Mumbai, IndiaQ27815
Staphylococcus aureus (S. aureus)National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, IndiaNCIM 5022
Staphylococcus epidermis (S. epidermis)National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, IndiaNCIM 5270
Streptozotocin (STZ)Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India14653
Type-1 rat CollagenSigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, IndiaC7661
Ultraviolet–visible spectroscopy-1700Shimadzu

References

  1. . IDF Diabetes Atlas, 9th edn Available from: https://www.diabetesatlas.org (2019)
  2. Falanga, V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. The Lancet. 366 (9498), 1736-1743 (2005).
  3. Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the treatment of chronic wounds. Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).
  4. Alexiadou, K., Doupis, J. Management of diabetic foot ulcers. Diabetes Therapy. 3 (1), 1-15 (2012).
  5. Karri, V. V. S. R., et al. Current and emerging therapies in the management of diabetic foot ulcers. Current Medical Research and Opinion. 32 (3), 519-542 (2016).
  6. Sanapalli, B. K., et al. Human beta defensins may be a multifactorial modulator in the management of diabetic wound. Wound Repair and Regeneration. 28 (3), 416-421 (2020).
  7. Caley, M. P., Martins, V. L., O'Toole, E. A. Metalloproteinases and wound healing. Advances in Wound Care. 4 (4), 225-234 (2015).
  8. Reiss, M. J., et al. Matrix metalloproteinase-9 delays wound healing in a murine wound model. Surgery. 147 (2), 295-302 (2010).
  9. Gill, S. E., Parks, W. C. Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1334-1347 (2008).
  10. Stechmiller, J., Cowan, L., Schultz, G. The role of doxycycline as a matrix metalloproteinase inhibitor for the treatment of chronic wounds. Biological Research for Nursing. 11 (4), 336-344 (2010).
  11. Griffin, M. O., Fricovsky, E., Ceballos, G., Villarreal, F. Tetracyclines: a pleitropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (3), 539-548 (2010).
  12. Burns, F., Stack, M., Gray, R., Paterson, C. Inhibition of purified collagenase from alkali-burned rabbit corneas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (7), 1569-1575 (1989).
  13. Kraus, R. L., et al. Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct radical-scavenging activity. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 819-827 (2005).
  14. Yrjänheikki, J., Keinänen, R., Pellikka, M., Hökfelt, T., Koistinaho, J. Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (26), 15769-15774 (1998).
  15. Moura, L. I., Dias, A. M., Carvalho, E., de Sousa, H. C. Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment-a review. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7093-7114 (2013).
  16. Natarajan, J., et al. Nanostructured Lipid Carriers of Pioglitazone Loaded Collagen/Chitosan Composite Scaffold for Diabetic Wound Healing. Advances in Wound Care. 8 (10), 499-513 (2019).
  17. Karri, V. V. S. R., et al. Curcumin loaded chitosan nanoparticles impregnated into collagen-alginate scaffolds for diabetic wound healing. International Journal Of Biological Macromolecules. 93, 1519-1529 (2016).
  18. Hsieh, W. -. C., Chang, C. -. P., Lin, S. -. M. Morphology and characterization of 3D micro-porous structured chitosan scaffolds for tissue engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 57 (2), 250-255 (2007).
  19. Xie, Y., Chen, J., Xiao, A., Liu, L. Antibacterial activity of polyphenols: structure-activity relationship and influence of hyperglycemic condition. Molecules. 22 (1913), 1-11 (2017).
  20. Geerlings, S. E., Brouwer, E. C., Gaastra, W., Verhoef, J., Hoepelman, A. I. Effect of glucose and pH on uropathogenic and non-uropathogenic Escherichia coli: studies with urine from diabetic and non-diabetic individuals. Journal of Medical Microbiology. 48 (6), 535-539 (1999).
  21. Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64 (8), 711-713 (1998).
  22. Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clinical Biochemistry. 29 (3), 225-229 (1996).
  23. Charulatha, V., Rajaram, A. Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes. Biomaterials. 24 (5), 759-767 (2003).
  24. Rehakova, M., Bakoš, D., Vizarova, K., Soldán, M., Jurícková, M. Properties of collagen and hyaluronic acid composite materials and their modification by chemical crosslinking. Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. 30 (3), 369-372 (1996).
  25. Chang, M. -. Y., et al. Doxycycline enhances survival and self-renewal of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 353-364 (2014).
  26. Dovi, J. V., He, L. K., DiPietro, L. A. Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice. Journal of Leukocyte Biology. 73 (4), 448-455 (2003).
  27. Lindeman, J. H., Abdul-Hussien, H., van Bockel, J. H., Wolterbeek, R., Kleemann, R. Clinical Perspective. Circulation. 119 (16), 2209-2216 (2009).
  28. Zhang, C., Gong, W., Liu, H., Guo, Z., Ge, S. Inhibition of matrix metalloproteinase-9 with low-dose doxycycline reduces acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass. International Journal Of Clinical And Experimental Medicine. 7 (12), 4975-4982 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved