骨格筋線維芽細胞からのエクソソームの単離と特性評価

このプロトコルは1)大人マウス腓腹筋からの第一次線維芽細胞の隔離そして文化、また2)西部のしみの分析に先行しているスクロース密度勾配と結合される差動ultrarifjugeation方法を使用してexosomesの浄化そして性格描写を示す。

エクソソームは、ほぼすべての細胞から放出され、すべての体液中に分泌される小さな細胞外小胞です。これらの小胞を単離するために、超遠心分離、限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィーなど、多くの方法が開発されています。しかし、すべてが大規模なエクソソームの精製や特性評価に適しているわけではありません。ここでは、成体マウスの骨格筋から単離された初代線維芽細胞の培養を確立し、その後、これらの細胞の培養培地からエキソソームを精製および特性評価するためのプロトコルを概説します。この方法は、連続した遠心分離ステップとそれに続くスクロース密度勾配の使用に基づいています。次に、エキソソーム調製の純度を、一連の標準マーカー(Alix、CD9、CD81など)を用いたウェスタンブロット解析によって検証します。プロトコルは機能調査のための電子顕微鏡検査、質量分析および通風管の実験のためのbioactiveexosomesを隔離し、集中する方法を記述する。スケールアップやスケールダウンが容易で、さまざまな細胞タイプ、組織、体液からのエクソソーム単離に適応させることができます。

エクソソームは、30〜150nmのサイズの不均一な細胞外小胞です。それらは、組織や器官に遍在的に分布していることから、生理学的および病理学的プロセスにおける確立された主要なプレーヤーです^1,2。エクソソームは、タンパク質、脂質、DNAタイプ、RNAタイプの複雑なカーゴを運び、それらはそれらが由来する細胞の種類によって異なります^1,2,3。エクソソームは、異なる機能を持つタンパク質(すなわち、CD9およびCD63を含むテトラスパニン)が豊富であり、融合イベントの原因となります。例えば、熱ショックタンパク質であるHSP70やHSP90は、抗原の結合や提示に関与しています。さらに、アリックス、Tsg101、およびフロチリンは、エクソソームの生合成と放出に関与し、これらのナノベシクルのマーカーとして広く使用されています^2,3,4。

また、エクソソームにはさまざまなRNA(マイクロRNA、長鎖ノンコーディングRNA、リボソームRNA)が含まれており、これらはレシピエント細胞に伝達され、下流のシグナル伝達に影響を与えます³。単一の単位膜で囲まれているため、エクソソームの生理活性は、タンパク質および核酸のカーゴだけでなく、制限膜¹の脂質成分にも依存する。エキソソーム膜には、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、コレステロール、スフィンゴミエリン、アラキドン酸、その他の脂肪酸が豊富に含まれており、これらはすべてエクソソームの安定性と膜トポロジーに影響を与える可能性があります^2,3。カーゴと脂質の配置の結果として、エクソソームは受容細胞のシグナル伝達経路を開始し、正常組織生理学の維持に関与します1,2,4,5。特定の病理学的条件(すなわち、神経変性、線維症、および癌)の下で、それらは病理学的刺激を誘発し、伝播することが示されています4,6,7,8,9,10,11。

エクソソームは、近隣または遠隔の部位にシグナルを伝播する能力があるため、疾患の診断や予後のための貴重なバイオマーカーとなっています。さらに、エクソソームは治療用化合物のビヒクルとして実験的に使用されている^2,12。これらのナノベシクルを臨床に応用する可能性は、最大の収量、純度、および再現性を達成するために、単離法をますます重要にしています。エクソソームを単離するためのさまざまな技術が開発され、実施されています。一般に、エキソソームは、示差遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、および免疫捕捉(市販のキットを使用)によって、馴化細胞培養培地または体液から単離することができる。各アプローチには^{、前に説明した}独自の長所と短所があります1、^2、13、14。

概説されたプロトコルは、1)成体マウス腓腹筋からの一次線維芽細胞の単離と培養、および2)これらの細胞によって培地に放出されたエクソソームの精製と特性評価に焦点を当てています。機能研究のための初代線維芽細胞からのエキソソームの単離のための十分に確立されたプロトコルは、現在不足しています。初代線維芽細胞は大量のエクソソームを分泌しないため、単離と精製のプロセスが困難になります。このプロトコルは形態学的な完全性および機能活動を維持している間大きい培養容積からのたくさんの純粋なexosomesの浄化を記述する。馴化培地から得られた精製エキソソームは、レシピエント細胞に特異的なシグナル伝達経路を誘導するために、in vitroでの取り込み実験で成功裏に使用されています。また、複数の^生体試料から採取したエキソソームカーゴの比較プロテオミクス解析にも使用されています4。

マウスにおけるすべての処置は、St. Jude Children's Research Hospital Institutional Animal Care and Use CommitteeおよびNational Institutes of Healthのガイドラインによって承認された動物プロトコルに従って実施された。

1. 溶液と培地の調製

1. 15.4 mL の PBS と 2.5 mL の 20 mg/mL コラゲナーゼ P(最終濃度 5 mg/mL)、2 mL の 11 U/mL ディスパーゼ II (最終濃度 1.2 U/mL)、1.0 μL の 1.0 M CaCl₂ (最終濃度 5 mM)を混合して消化溶液を調製します。
2. 440 mLのDMEMと50 mLのFBS(10%)、5.0 mLのペン/連鎖球菌(それぞれ100 U/mLおよび100 μg/mL)および5.0 mLのグルタミンサプリメント(2 mM)を混合して、500 mLの一次線維芽細胞培地(DMEM完了)を調製します。孔径0.22μmの真空フィルターで培地をろ過滅菌します。
3. 38.5 mLのポリプロピレンチューブ中で、4°C、100,000 x g のFBSを一晩超遠心分離して、エキソソームフリー血清を調製し、上清を新しいチューブに移します。
4. 440 mL の DMEM と 50 mL のエキソソームフリー血清(10%)、5 mL のペン/ストレプ菌 (100 U/mL および 100 μg/mL)、5 mL のグルタミンサプリメント (2 mM) を混合して、500 mL のエキソソームフリー培地を調製します。孔径0.22μmの真空フィルターで培地をろ過滅菌します。
5. 6.057gのトリス塩基を90mLのdH₂Oに溶解し、pHをHClで7.4に調整することにより、0.5 M Tris-HCl(pH 7.4)を調製します。
6. 97.9 mLのdH 2 Oと₂mLの0.5 M Tris-HCl(pH = 7.4)および100 μLの1 M Mg(Ac)₂を混合して、10 mM Tris-HCl(pH 7.4)/1 mM Mg(Ac)₂溶液(スクロースワーキング溶液)を調製します。使用直前にプロテアーゼ阻害剤を溶液に添加し、溶液を氷上に保管してください。
7. 表1に従って氷上でスクロース密度勾配溶液を調製します。これらの溶液は、2本のスクロースグラジエントチューブを調製するのに十分です。
8. 100gのTCA粉末に40 mLのdH₂Oを加えて100%TCAを調製し、完全に溶解するまで混合します。dH₂Oで最終容量を100 mLに調整します。
9. 20mLのdH₂Oと80mLの100%エタノールを混合して80%エタノールを調製する。
10. 1.8 Lの精製水(dH₂O)と200 mLの10倍のランニングバッファーを混合して、ウェスタンブロットのランニングバッファーを調製します。
11. 1.4 LのdH₂Oと200 mLの10x転写バッファーおよび400 mLのメタノールを混合して、ウェスタンブロット転写バッファーを調製します。転写バッファーを4°Cに予冷します。
12. 122 gのトリス塩基と180 gの塩化ナトリウムを850 mLのdH₂O(pH 8.0)に溶解して、20xトリス緩衝生理食塩水(TBS)を調製します。容量をdH₁Oで2 Lに調整します。
13. 5 gの脱脂粉乳を1 mLの10% Tween-20、5 mLの20x TBS、および94 mLのdH₂Oに溶解してブロッキングバッファーを調製します。
14. 3 g の BSA を 1 mL の 10% Tween-20、5 mL の 20x TBS、および 94 mL の dH₂O に溶解して抗体バッファーを調製します。
15. 100 mL の 20x TBS と 20 mL の 10% Tween-20 (10 x) を 1.88 L の dH₂O と混合して、洗浄バッファーを調製します。
16. 1容量のルミノール/エンハンスと1容量の安定な過酸化物緩衝液を混合して現像液を調製します。

2. マウス腓腹筋(GA)の解剖^15,16

1. 氷上で10 mLのPBSを含む50 mLチューブを調製します。
2. CO2チャンバーでマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼させます。
3. 両足から腓腹筋を取り除き、氷上でPBSを使用してチューブに移します。
   注:GA筋をPBSに移す前に、GA筋からヒラメ筋を取り除きます。

3. マウス初代線維芽細胞の単離と培養

1. 筋肉の重さを量り、バイオセーフティフードの下の10cmの皿に移します。筋肉をメスで細かいペーストになるまで細かく刻みます。
2. 細かく刻んだマッスルペーストを50 mLチューブに移し、3.5倍の体積/mg組織の消化液をチューブに加え、37°Cで45分間インキュベートします。 懸濁液を10分ごとに5 mLピペットで完全に混合します(これにより、完全な解離に役立ちます)。
   注:あるいは、このステップには組織解離剤を使用することができる。
3. 20 mLのDMEM completeを細胞懸濁液に加え、消化液を不活化します。50 mLチューブに置かれた70 μmのナイロンセルストレーナーに移します。フロースルーを回収し、さらに5 mLのDMEMでセルストレーナーを洗浄します。
4. 細胞懸濁液を室温(RT)で300 x g で10分間遠心分離し、上清を慎重に除去します。
5. ペレットを10 mLのDMEMコンプリートに再懸濁し、細胞を10 cmのディッシュに播種します。
6. 細胞を37°C、5%CO₂、3%O₂ (継代0またはP0)で培養する。
   注:1)これらの培養物は、生理学的に類似した状態(骨格筋の_O2 レベルは約2.5%)を確保するために、低酸素レベルに維持する必要があります¹⁷。2)細胞培養の継代数(例:P0)は、培養物が継代培養された回数の記録です。3)P0の初代線維芽細胞は、100%コンフルエントに1日を加えるまでルーチン培養されます(P0のみ)。これは、他の種類の細胞をパージし、培養物に存在する細胞が線維芽細胞のみであり、顕微鏡検査に基づいて筋原性細胞が枯渇していることを保証するためです。生後2ヶ月の成体動物の骨格筋には、約2%の筋原性前^{駆細胞が含まれています}4。さらに、筋原性前駆細胞は通常、コーティングされていない皿に付着しません。したがって、それらは継代培養中に失われます^18、19、20。筋原性細胞には、20%FBSと塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を添加した別の培地(F10)が必要です¹⁸。DMEMコンプリートでは、中程度の線維芽細胞は筋原性細胞よりも増殖率が高く、その結果、最初の継代の前にこれらの汚染細胞が排除されます。
7. 100%コンフルエントプラス1日でP0細胞をPBSですすぎます。1 mLのトリプシン化溶液を加え、37°C、5%CO₂、3% O₂ でインキュベートして細胞を剥離します。10 mLのDMEMコンプリートを使用して酵素活性を停止します。
8. 細胞を300 x g で10分間室温で遠心分離し、ペレットを20 mLのDMEMコンプリートに再懸濁し、15 cmのディッシュ(継代1またはP1)に播種します。細胞は80%〜90%のコンフルエントまで増殖し、継代3まで増殖させることができます。
   注:下流の実験に応じて、通路1、通路2(P2)、または通路3(P3)を使用できます。

4. 細胞の播種と馴化培地の採取

1. 線維芽細胞(P1、P2、またはP3)を10mLのPBSで洗浄し、2.5mLのトリプシン処理溶液を細胞に加え、37°C、5%CO₂、3%O₂でインキュベートします。10 mLのDMEMコンプリートを使用して酵素活性を停止します。
   注:継代4以降、初代細胞は廃棄され、特性が変化するため、それ以上の実験には使用しないでください。
2. 細胞を回収し、室温で300 x g で10分間遠心分離します。
3. 細胞ペレットを10 mLのエキソソームフリー培地に再懸濁し、細胞をカウントします。
4. 1皿あたり1.5–2.0 x 10⁶個の細胞(15 cm)で細胞を播種し、37°C、5%CO 2、3%O₂でインキュベートします。
5. コンディショニングした培地を氷上の50 mLチューブに16〜24時間集めます。
   注:細胞が80%コンフルエントでない場合は、新鮮なエキソソーム遊離培地を再度添加し、さらに16〜24時間後に回収することができます。この 2 つのコレクションは、さらに処理するために組み合わせることができます。

5. 差動および超遠心分離によるエクソソームの精製

注意: すべてのステップは、4°Cまたは氷上で実行されます。必要に応じて、水で満たされたチューブとチューブのバランスを取ります。

1. 馴化培地を300 x g で10分間遠心分離して生細胞を除去し、上清を新しい50 mLチューブに移します。
2. 2,000 x g で10分間遠心分離して死細胞を除去し、上清を38.5 mLのポリプロピレンチューブに移します。
3. 上清を10,000 x g で30分間遠心分離し、細胞小器官、アポトーシス小体、および膜断片を除去します。上清を38.5 mLの超透明チューブに移します。
4. 上清を100,000 x g で1.5時間超遠心分離し、エクソソームをペレット化します。
5. 上清を慎重に廃棄し、約1 mLの馴化培地を残し、エキソソームペレットを総量30 mLの氷冷PBSで洗浄します。
6. 100,000 x g で1.5時間遠心分離し、エキソソームペレットを乱さないように注意しながら、ピペッティングにより上清を慎重に廃棄します。
7. ペレットを氷冷PBS(15 cmディッシュあたり~25 μL)に再懸濁し、BCAタンパク質アッセイキットとマイクロプレートリーダーを使用して562 nmでタンパク質濃度を測定します。
   注:タンパク質濃度は、0.1% Triton-X100 in dH 2 Oで1:₂希釈して測定します。80%のコンフルエントさでの一次線維芽細胞の15cmディッシュ(20mLのコンディショニング培地)からのエキソソームの収量は、3~4μgです。

6. ショ糖密度勾配によるエクソソームのキャラクタリゼーション

1. 1.5 mL の 2.0 M、2.5 mL の 1.3 M、2.5 mL の 1.16 M、2.0 mL の 0.8 M、2.0 mL の 0.5 M スクロース溶液をピペッティングして、13 mL の超透明チューブにスクロースグラジエントをロードします。
2. 30〜100 μgのエキソソームを0.25 Mショ糖溶液と混合し、容量を1 mLに調整します。
3. グラジエントの上にエキソソームを慎重にロードし、サンプルを 100,000 x g および 4 °C で 2.5 時間超遠心分離します。
4. 超遠心分離機からチューブを取り出し、氷上に置き、グラジエントの上部から 1.0 mL のフラクションを回収します。氷上で1.7 mLのチューブに移します。
5. 110 μL の 100% TCA を各チューブに添加し、よく混合し、室温で 10 分間インキュベートします。
6. 10,000 x g およびRTで10分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄します。
7. ペレットを予冷した80%エタノール500μLに再懸濁し、サンプルを-20°Cで10分間洗浄します。
8. 10,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離し、上清を廃棄します。
9. ペレットを室温で10〜15分間乾燥させ、in vitro実験のためにペレットをPBSに再懸濁します。BCAタンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定するか、ウェスタンブロット分析のために14.5 μLのdH₂O、5 μLの4x Laemmliバッファー、および0.5 μLの1 M DTTにペレットを直接再懸濁します。

7. ウェスタンブロット解析によるエクソソーム検出

1. ステップ5.7のエキソソーム5〜10 μgを5 μLの4x Laemmliバッファー、および0.5 μLの1 M DTTと混合し、最終容量をdH₂Oで20 μLに調整します。 ステップ6.9のサンプルを含むすべてのサンプルを98°Cで5分間加熱します。
2. サンプルを10%TGX染色フリーゲルにロードし、メーカーの推奨に従ってタンパク質ラダーをロードします。
   注:目的のタンパク質の分子量に応じてゲルの割合を選択してください。
3. ローディング色素がゲルの底部に達するまで、ゲルを100 Vで流速バッファー中で~1時間泳動させます。
   注:実行時間は、使用する機器、またはゲルの種類と割合によって異なる場合があります。
4. ゲルを画像化します。染色されていないゲルの画像は、イムノブロットのローディングコントロールとして使用されます。
5. PVDFメンブレンを使用して、80 Vで1.5時間、または30 V、4°Cで一晩ゲルを転写します。
6. メンブレンをブロッキングバッファーで室温で1時間ブロッキングします。
7. 特異的抗体のメンブレン(表2)を抗体バッファー中で、4°Cで一晩撹拌しながらインキュベートします。
8. メンブレンを洗浄バッファーで洗浄し、メンブレンを適切な二次抗体(表2)とともに室温で1時間、攪拌しながらインキュベートします。
9. メンブレンを洗浄バッファーで洗浄し、現像液とカメラベースのイメージャーを使用してメンブレンをイメージングします。または、X線フィルムを使用してメンブレンを現像します。

このプロトコルは、費用対効果の高い方法で大量の調整培地からエキソソームを精製するのに適しています。この手順は再現性が高く、一貫性があります。 図1 は、マウス初代線維芽細胞の培養液から精製したエクソソームの透過型電子顕微鏡(TEM)画像です。 図2 は、標準的なエキソソームマーカーのタンパク質発現パターンと、細胞質(LDH)およびER(カルネキシン)タンパク質汚染物質の不在を示しています。 図 3 は、スクロース密度勾配後の標準エキソソームマーカー(Alix、CD9、および CD81)の分布を示しています。

図1:マウス初代線維芽細胞の培地から単離したエクソソームの代表的なTEM画像。 これらのナノベシクルの比較的均一なサイズが示されています。黒い線は個々の小胞の直径を示します。スケールバー = 100 nm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:エクソソーム、細胞質、およびERマーカーに対する抗体でプローブされたエクソソームライセートのイムノブロット。 アリックス、CD81、CD9、フロチリン1、シンデカン1、シンテニン1(エクソソーム)、細胞質(LDH)、およびER(カルネキシン)マーカー。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:スクロース密度勾配で分離されたエクソソーム。 個々の画分は、Alix、CD9、およびCD81に対する抗体を用いてウェスタンブロットでプローブしました。マーカーの分画パターンに基づいて、エクソソームは一貫して1.096〜1.140 g/mLの密度に対応するフラクション3〜6で沈降します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

表1:ショ糖密度勾配溶液。

表2:一次抗体と二次抗体。

このプロトコルで概説されているように、培地からのエキソソームの単離を成功させるための重要なステップは、成体骨格筋からの初代マウス線維芽細胞培養の適切な確立と維持です。これらの培養物は、生理学的に類似した状態(骨格筋のO2レベルは~_2.5 %)を確保するために、低酸素レベルに維持する必要があります¹⁵。初代線維芽細胞は、培養に何度も通すと特性が変化します。したがって、理想的なエキソソーム収量を得るためには、継代数を低くすることが不可欠です。精製したエキソソームは、直ちに実験目的で使用するか、必要になるまで-80°Cでアリコートで凍結保存してください。プロトコルのもう一つの重要なステップは、毎回新鮮に調製されたスクロース溶液を使用することです。この方法の限界は、初代線維芽細胞は一般に、他の分泌細胞のように大量のエクソソームを分泌しないため、時間がかかることである。そのため、大規模な培養を行う必要があり、その結果、大量の馴化培地を処理することになります。

ここで使用される示差遠心分離の利点は、スケーラブルなアプローチ(最大リットル)であり、初代線維芽細胞からエキソソームを単離するための最適な方法であることです。大容量(カラムあたり最大 100 mL)の代替法は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)です。この方法は迅速で、エキソソームからタンパク質を分離することができます。このカラムはエキソソームをペレット化しないため、さらなる濃縮または遠心分離のステップが必要です。SEC 法の欠点の 1 つは、カラムが時間の経過とともに目詰まりし、過負荷になる可能性があることです。他の現在の方法は、少量の体液(すなわち、尿、CSF、血清、血漿)および市販のキットの使用に基づいている。これらのキットは再現性を保証しますが、高価であり、常に高収率の純粋なエキソソームを生成するとは限りません。エクソソーム精製のプロトコールは単純明快で、実験の必要性に応じて、さまざまな種類の細胞、組織全体や臓器、その他の体液に適用することができます。

著者の誰一人として、宣言すべき利益相反はありません。

Alessandra d'Azzo(アレッサンドラ・ダッツォ)は、Jewelers for Children(JFC)の遺伝学および遺伝子治療の寄附講座を保持しています。この活動は、NIHの助成金R01GM104981、RO1DK095169、CA021764、メンフィスのアッシジ財団、およびアメリカのレバノンのシリア関連慈善団体によって部分的に支援されました。