金属イオン認識の構造とメカニズムを決定するイオン移動質量分析技術と金属結合オリゴペプチドの酸化還元活性

イオンモビリティ質量分析および分子モデリング技術は、設計された金属結合ペプチドおよび銅結合ペプチドメタノバクチンの選択的金属キレート性能を特徴付けることができる。金属キレートペプチドの新しいクラスを開発することは、金属イオンの不均衡に関連する疾患の治療につながるのに役立ちます。

エレクトロスプレーイオン化(ESI)は、質量、全体的な電荷、金属結合相互作用、および立体形状を節約しながら、水相ペプチドまたはペプチド複合体をガス相に移すことができる。ESIとイオンモビリティ質量分析(IM-MS)の結合は、その状態測定、プロトネーション状態に関連するペプチドの質量対電荷(m/z)および衝突断面(CCS)の同時測定を可能にする器械的な技術を提供し、そして立体形状。ペプチド複合体の全体的な電荷は、1)ペプチドの酸性および塩基部位および2)金属イオンの酸化状態のプロトン化によって制御される。したがって、複合体の全体的な電荷状態は、ペプチド金属イオン結合親和性に影響を与える溶液のpHの関数である。ESI-IM-MS分析では、ペプチドおよび金属イオン溶液は水性のみの溶液から調製され、pHは希希水性酢酸または水酸化アンモニウムで調整されます。これにより、pH依存性および金属イオン選択性を特定のペプチドに対して決定することができる。さらに、ペプチド複合体のm/zおよびCCSは、B3LYP/LanL2DZ分子モデリングと共に、複合体の金属イオン協調および三次構造の結合部位を識別するために使用することができる。結果は、ESI-IM-MSが一連の代替メタノバクチンペプチドの選択的キレート性能を特徴付け、銅結合ペプチドメタノバクチンと比較する方法を示した。

銅イオンと亜鉛イオンは、生物に不可欠であり、酸化保護、組織成長、呼吸、コレステロール、グルコース代謝、ゲノム読み取^り1を含むプロセスに不可欠です。これらの機能を有効にするために、シスのチオレート、彼^の2、3のイミダゾール、(よりまれに)メチオニンのチオエーテル、およびGluとAspのカルボキシレートは、選択的に金属を活性化部位に組み込む。メタロエンザイム。これらのコーディネーショングループの類似性は、HisおよびCysリガンドが正しい機能を確保するためにCu(I/II)またはZn(II)のいずれかを選択的に組み込む方法に関する興味深い疑問を提起する。

選択的結合は、多くの場合、Zn(II)またはCu(I/II)イオン^濃度4を制御するペプチドの獲得および密売によって達成される。Cu(I/II)は反応性が高く、酵素に酸化的損傷や急激な結合を引き起こすため、その自由濃度は、細胞内の様々な場所に安全に輸送する銅シャペロンおよび銅調節タンパク質によって厳しく調節される。その恒常主義^{を制御する 5,6}.銅代謝または恒常性の破壊は、メンケスおよびウィルソン^病7ならびに^癌7およびプリ^オン8およびアルツハイマー^病9などの神経疾患に直接関与する。

ウィルソン病は、目、肝臓、脳のセクションの銅レベルの増加に関連しており、Cu(I/II)の酸化還元反応が活性酸素種を産生し、肝無胞および神経変性を引き起こす。既存のキレート療法は、小さなチオールアミノ酸ペニシラミンおよびトリエチレネテトラミンである。あるいは、メタノトロフィー系銅獲得ペプチドメタノバクチン(mb)10、11はCu(I)12に対する高い結合親和性のために治療可能性を示す。メチロシヌス・トリコスポリウムOB3bのメタノバクチン(mb-OB3b)がウィルソン病の動物モデルで研究された場合、銅は肝臓から効率的に除去され、胆^汁13を通して排泄された。インビトロ実験では、mb-OB3bが肝臓サイトゾ^ル13に含まれる銅メタロチオネインから銅をキレートできることを確認した。レーザーアブレーション誘導結合血漿質量分析イメージング技術は、ウィルソン病肝^{サンプル14、15、16}における銅の空間分布を調査^{し、mb-OB3b}であることを示した。わずか8^日17の短い処理期間で銅を除去します。

mb-OB3bはまた、Ag(I)、Au(III)、Pb(II)、Mn(II)、Co(II)、Fe(II)、Ni(II)、およびZn(II)18、19を含む他の金属イオンと結合する。生理的Cu(I)結合部位に対する競争は、mb-OB3b複合体からCu(I)を置き換えることができるためAg(I)によって示され、Ag(I)およびNi(II)の両方もCu(I)19によって置き換えることができないMbへの不可逆的な結合を示す。近年、2His-2Cys結合モチーフを有する一連の代替メタノバクチン(amb)オリゴペプチド^{が20、21、}及びそのZn(II)およびCu(I/II)結合特性を特徴とする。彼らの一次アミノ酸配列は類似しており、それらはすべて2His-2Cysモチーフ、Proおよびアセチル化N終産を含有する。2His-2Cysモチーフはmb-OB3bの2つのエネチオールオキサゾロン結合部位を置き換えるため、主にmb-OB3bとは異なります。

イオンモビリティ質量分析(ESI-IM-MS)と組み合わせたエレクトロスプレーイオン化は、質量電荷(m/z)と衝突を測定するため、ペプチドの金属結合特性を決定するための強力な計測器技術を提供します。断面(CCS)を使用しながら、溶液相から質量、電荷、立体形状を保存します。m/zおよびCCSは、ペプチオメトリー、プロトネーション状態、および立体構造形状に関連する。種に存在する各要素の同一性および数が明示的に同定されるため、ストイチオメトリーが決定される。ペプチド複合体の全体的な電荷は、酸性および塩基部位の原発状態および金属イオンの酸化状態に関する。CCSは、複合体の三次構造に関連する回転平均サイズを測定するので、ペプチド複合体の立体形状の情報を提供する。複合体の全体的な電荷状態はまた、pHの機能であり、カルボキシル、His、CysおよびTyrなどのデプロトン化された基本部位または酸性部位が金属イオンの潜在的な結合部位でもあるため、ペプチドの金属イオン結合親和性に影響を与える。分析のために、ペプチドおよび金属イオンは希希水性酢酸または水酸化アンモニウムによって調整されたpHと水溶液で調製される。これにより、pH依存性および金属イオン選択性がペプチドに対して決定され始める。さらに、ESI-IM-MSによって決定されたm/zおよびCCSをB3LYP/LanL2DZ分子モデリングと共に使用して、複合体の金属イオン協調および三次構造の種類を発見することができる。この記事に示す結果は、ESI-IM-MSが一連のアンブペプチドの選択的キレート性能を特徴付け、銅結合ペプチドmb-OB3bと比較する方法を明らかにする。

1. 試薬の調製

1. 培養メチロシヌストリコスポリウムOB3bは、Cu(I)フリーmb-OB3b 18、22、23^を分離^し、使用するまで-80°Cで試料を凍結乾燥し、保存する。
2. アンブペプチド(アン_ブ1、アン_ブ2、アン_ブ4、>70%純度)を合成し、サンプルを凍結乾燥させ、使用するまで-80°Cで保存します。
3. 購入>98%純化マンガン(II)塩化物、コバルト(II)塩化物、塩化物(II)塩化物、銅(II)塩化物、銅(II)硝酸塩、銀(I)硝酸塩、亜鉛(II)塩化物、鉄(III)塩化物および鉛(II)。
4. アンブ種およびHPLCグレード以上の水酸化アンモニウム、氷河酢酸、アセトニトリルの衝突断面を測定するためのキャリブラントとして使用されるポリDL-アラニンポリマーを購入します。

2. ストックソリューションの準備

1. ペプチドストックソリューション
   1. 正確に重量を量り、少なくとも3つの有意な数字を使用して、mb-OB3bまたは1.7 mLプラスチックバイアル中のmb-OB3bまたはambの質量の質量。
      注:計量質量は、ペプチドの溶解度に応じて、1.00 mLの脱イオン化(DI)水が加えられた場合に、12.5 mMまたは1.25 mMのいずれかを得るべきである。
   2. ピペを使用して、計量されたペプチドサンプルに1.00 mLの脱イオン水(>17.8 MΩ cm)を加え、12.5 mMまたは1.25 mM溶液を得ます。キャップをしっかりと置き、少なくとも20回の反転と十分に混ぜます。
   3. マイクロピペットを使用して、ペプチドサンプルから個別にラベル付けされた1.5 mLバイアルに50.0 μLアリコートを分配し、使用するまで-80°Cに保存します。
2. 金属イオンストックソリューション
   1. 正確に重量を量り、少なくとも3つの有意な数字を使用して、1.7 mLバイアル中の金属塩化物または硝酸銀の10.0〜30.0mgの質量を用いて。
      注:DI水の1.00 mLを添加すると、計量質量は125 mMを得るべきです。
   2. 1.7 mLバイアルの計量金属サンプルに1.00mLのDI水を加え、125mM溶液を得ます。キャップをしっかりと置き、少なくとも20回の反転と十分に混ぜます。
3. 水酸化アンモニウムストック溶液:DI水で99.5%酢酸溶液の57 μLを1.00mLの最終体積に希釈することにより、1.0M酢酸溶液を調剤します。DI水で21%水酸化アンモニウム溶液の90μLを1.00mLの最終体積に希釈することにより、水酸化アンモニウム溶液を1.0Mmmmmmmに調作します。1.0M溶液の100 μLを取り、0.10 Mおよび0.010 M酢酸および水酸化アンモニウム溶液を調作することにより、各溶液の2つの連続した希釈を行います。
4. ポリDL-アラニンストック溶液:1.0mgのPAを計量し、1.0mLのDI水に溶解して1,000ppmを与えることによってポリ-DL-アラニン(PA)を調製する。よく混ぜる。マイクロピペを使用して、50.0 μLアリコートを分配し、それぞれを1.7 mLバイアルに入れ、-80°Cに保存します。

3. エレクトロスプレーイオン移動質量分析

1. 0.1Mの氷河酢酸、0.1Mの水酸化アンモニウム、そして最後にDI水の約500 μLでESI入口チューブと針毛細血管を徹底的に洗浄します。
2. 1,000 ppm PAストック溶液の50.0 μLアリコートを解凍し、450 μLのDI水で希釈して100ppm PAを与えます。この溶液のピペット100.0 μLを1.00mLに希釈し、500μLのDI水と500μLのアセトニトリルを用いて10ppm PA溶液を与える。
3. 議論セクションで説明するように、ネイティブESI-IM-MS条件を使用して、それぞれ10分間10ppm PA溶液の負および正イオンIM-MSスペクトルを収集します。
4. 12.5 mMまたは1.25 mMアンブストック溶液の50.0 μLアリコートを解凍し、0.125 mMアンブの最終濃度を与えるためにDI水で連続的な希釈を行います。各希釈を十分に混ぜます。
5. 125mM金属イオンストック溶液のピペ100.0 μLを、1.7mLバイアルに入れ、DI水で1.00mLに希釈し、12.5mMの金属イオンを与える。さらに2つの連続した希釈を繰り返し、最終的な0.125 mMの金属イオン濃度を与えます。各希釈を十分に混ぜます。
6. 0.125 mMアンブのピペ200.0 μLを1.7mLバイアルに入れ、500μLのDI水で希釈し、溶液を十分に混合します。
7. 1.0M酢酸溶液の50 μLを加えてサンプルのpHを3.0に調整します。
8. pH調整サンプルに0.125 mM金属イオンの200.0 μLを追加します。DI水を加えて、サンプルの最終容積1.00mLを得て、十分に混合し、試料をRTで10分間平衡させます。
9. 鈍い鼻注射器を使用して、サンプルの500 μLを取り、それぞれ5分間の負および正イオンES-IM-MSスペクトルを収集します。サンプルの残りの500 μLを使用して、校正されたマイクロpH電極を使用して最終pHを記録します。
10. 手順 3.6 ~ 3.9 を繰り返し、手順 3.7 を変更して pH を 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、または 10.0 に調整しながら、0.010 M、0.10 M、または 1.0 M 酢酸または 1.0 M の酢酸またはアンモニウム水酸化物溶液の新しいボリュームを追加します。
11. 10ppm PA溶液の負イオンおよび正イオンESI-IM-MSスペクトルをそれぞれ10分間収集します。

4. アンブサンプルの金属イオン滴定の調製

1. 手順 3.1 ~ 3.5 に記載されている手順に従います。
2. 0.125 mMアンブのピペ200.0 μLを1.7mLバイアルに入れ、500.0μLのDI水で希釈し、溶液を十分に混合します。
3. 0.010 M水酸化アンモニウム溶液の80 μLを加えて、サンプルのpHをpH = 9.0に調整します。
4. 0.125 mM金属イオン溶液の28 μLを追加し、金属イオンの0.14モル相当量を与え、DI水を加えてサンプルの最終容積を1.00 mLにし、完全に混合し、試料をRTで10分間平衡化させます。
5. 鈍い鼻注射器を使用して、サンプルの500 μLを取り、それぞれ5分間の負および正イオンESI-IM-MSスペクトルを収集します。サンプルの残りの500 μLを使用して、校正されたマイクロpH電極を使用して最終pHを記録します。
6. 手順 4.2 ~ 4.5 を繰り返し、ステップ 4.3 を変更して 0.125 mM 金属イオン溶液の適切な体積を追加し、0.28、0.42、0.56、0.70、0.84、0.98、1.12、1.26、または 1.40 モルルの同等量を与えます。
7. 10ppm PA溶液の負イオンおよび正イオンIM-MSスペクトルをそれぞれ10分間収集する。

5. ESI-IM-MS pH滴定データの解析

1. IM-MSスペクトルから、どの荷電種のアンブが存在するかを特定し、それらが理論的なm/z同位体パターンに一致させることによって存在する。
   1. MassLynxを開き、クロマトグラムをクリックしてクロマトグラムウィンドウを開きます。
   2. [ファイル]メニューに移動し、IM-MSデータ ファイルを検索して開きます。
   3. 右クリックしてクロマトグラムを横切ってドラッグして解放することにより、IM-MSスペクトルを抽出します。スペクトル ウィンドウが開き、IM-MS スペクトルが表示されます。
   4. スペクトルウィンドウで、[ツール]と[同位板]モデルをクリックします。同位体モデリングウィンドウで、アンブ種の分子式を入力し、[充電イオンを表示]ボックスをオンにして充電状態を入力します。[OK]をクリックします。
   5. IM-MSスペクトル内のすべての種を識別し、そのm/z同位方位化範囲を記録するために繰り返します。
2. 各amb種について、偶然のm/z種を分離し、m/z同位元パターンを使用して到着時間分布(ATD)を抽出して識別します。
   1. MassLynxでドリフトスコープをクリックしてプログラムを開きます。DriftScope で[ファイル]をクリックし、[開く]をクリックして IM-MS データ ファイルを検索して開きます。
   2. マウスと左クリックを使用して、アンブ種の m/z 同位元パターンを拡大します。
   3. [選択] ツールとマウスの左ボタンを使用して、同位板パターンを選択します。[現在の選択を受け入れる]ボタンをクリックします。
   4. 偶然のm/z種を分離するには、選択ツールとマウスの左ボタンを使用して、amb種の同位元パターンに合わせたATD時間整列を選択します。[現在の選択を受け入れる]ボタンをクリックします。
   5. ATD をエクスポートするには、ファイルに移動します |MassLynx にエクスポートし、[ドリフト時間を保持]を選択し、適切なフォルダにファイルを保存します。
3. ATDの高等部を決定し、種の集団の尺度としてATD曲線の下の領域を統合します。
   1. MassLynxのクロマトグラムウィンドウで、保存されたエクスポートされたファイルを開きます。[プロセス] をクリックします|メニューから統合します。[ApexTrack ピーク統合] ボックスをオンにして[OK]をクリックします。
   2. クロマトグラムウィンドウに示すように、高等 ATD (t_A)と統合領域を記録します。保存されたすべての amb および PA IM-MS データ ファイルに対して、この手順を繰り返します。
4. 各滴定点の正イオンまたはマイナスイオンのすべての抽出されたアンブ種に対して統合ATDを使用して、相対パーセンテージスケールに正規化します。
   1. 各pHでアンブ種とその統合ATDのアイデンティティをスプレッドシートに入力します。
   2. 各 pH について、統合 ATD の合計を使用して、個々の amb の ATD をパーセンテージ スケールに正規化します。
   3. 各アンブ種の強度対pHのパーセント強度をグラフにプロットし、各種の人口がpHの関数としてどのように変化するかを示します。

6. 衝突断面

1. スプレッドシートを使用して、HEバッファ^ガス28で測定されたPA^{負25、26および正27}イオンのCCS(Ω)を、以下の式1を使用して修正されたCCS(Ω_c)に変換します。e_c = 電子電荷 (1.602×10^-19 C);m_N2 = N₂ガスの質量 (Da);とm_イオン= イオン質量。^29歳

2. PAキャリブラントおよびアンバ種の平均到着時間(t_A)を、以下の式2を使用してドリフト時間(t_D)に変換し、ここで:c =増強されたデューティサイクル遅延係数(1.41)、およびm/zはペプチドイオンの質量対電荷である。

3. PA キャリブラントの t_Dと Ω_cをプロットします。次に、次に示す式 3の最小二乗回帰適合値を使用して、A' と B の値を決定します。B は IM デバイスの非線形効果を補正します。

4. これらのA値とB値と、AMBsのATDからの高調_度tD値を使用して、方程式3を使用してΩ_cを決定し、方程式 1を使用して Ω を決定します。この方法は、^{約2%25、26、27}の推定絶対誤差を持つペプチド種にCCSを提供する。

7. 計算方法

1. ベッケ3パラメータハイブリッド^機能30とダニングベーシス^セット31と電子コア電位32、33、34で構成される理論のB3LYP/LanL2DZレベルを使用して、見つけます。観察されたm/z amb^種35のすべての可能なタイプの調整のための幾何学に最適化された適合子。
   注: 計算をビルドして送信する方法の詳細については、補足ファイルの GaussView の使用法を参照してください。
2. 各適合子の予測自由エネルギーを比較し、シグマ^{プログラム36}からイオンスケールレナード・ジョーンズ(LJ)法を使用して理論CCSを計算する。
3. 最も低い自由エネルギー適合体から、IM-MS測定CCSに同意するLJ CCSを展示するコンフォーマーを決定し、実験で観察された適合体の三次構造と調整の種類を特定します。

amb₁の金属結合
amb₁₍図1A)のIM-MS^研究20は、銅イオンと亜鉛イオンの両方がpH依存様式でamb₁に結合していることを示した(図2)。しかし、銅と亜鉛は、異なる協調部位における異なる反応機構を介してamb₁に結合した。例えば、Amb₁にCu(II)を加えると、ジスルフィドブリッジ形成によるamb_{1(amb 1ox)}の酸化が起こり、>6のpHでは[amb 1ox−3H+Cu(II)]-イオン(図2A)が形成された。これは、2つのイミダゾリウム、カルボキシル基、およびCu(II)を調整していた2つの追加部位の脱プロトネーションを示した。

[amb 1ox−3H+Cu(II)]-B3LYP/LanL2DZを用いたイオンの分子モデリングは、彼_の1のイミダゾールδNとCys2のバックボーンアミド群のデプロトン化窒素を介して調整された最も低いエネルギー複合体Cu(II)を決定したと_グリー3.しかしながら、6のpHの下に、Amb₁にCu(II)を添加すると、Cu(I)結合によってのみ考慮できるm/z同位方位筋パターンを形成し、「amb_1ox+Cu(I)」+イオン(図2B)を形成した。対照的に、6より高いpHはm/z同位板パターンを1m/z減少させ、正の荷電[amb 1ox−H+Cu(II)]+イオンによって説明した。Zn(II)を添加するとamb₁を酸化せず、Zn(II)結合は>6のpHで観察され、主に[amb_{1−3H+Zn(II)]−}イオン(図2C)を形成した。これは、イミダゾリウム、チオール、およびカルボキシル基の脱プロトネーションを示した。[amb 1−3H+Zn(II)]^{の分子モデリング-}イオンは、2His-2CysまたはHis-2CysおよびC-終点のカルボキシレートを介して四面体Zn(II)協調のいずれかであると決定した。

amb₂の複数 Cu(I) バインディング
Cu(II)とamb₂₍図1B)との間の酸化還元反応はCu(I)結合をもたらした。これは、IM-MS、UV-Vis分光光光法、およびB3LYP分子^{モデリング37}を用いてより詳細に研究された。pH5におけるAmb₂のCu(II)滴定の主な製品は、amb₂酸化(ジスルフィドブリッジ形成を通じて)と非酸化アン_ブ2種が3つのCu(I)イオンを調整した。

B3LYP/LanL2DZ法を用いて、3Cu(I)協調種と競合する2つの低エネルギー複合体を見つけた。最初は図3Aに示す複合体で、3Cu(I)イオンは、Cys2とCys₆₍彼_の1)のブリッジングチオレート^{グループ38}とδN₁およびδN_5(His 5の)を介して調整された複合体です。).第2の複合体(3c)は、陽子化されたHis₁側群とC末端カルボキシレート群との間に塩橋を有する。これらの結果は、3.0~6.0のpHでは、主なamb₂+3Cu(I)複合体が塩橋構造であり、最小限の構造再構成で溶液からガス相に正常に転送できることを示唆しています。

209±6Å2の理論LJ CCSは、複雑な3cに対するシグマ^{プログラム36}を用いて計算され、IM-MS測定CCSと一致し、3cがpH 3.0-6.0で[amb_{2−2H+3Cu(I)]+}コンフォメーションを表していることを示す。しかし、>6のpHでは、この複合体はIM-MSによって観察されなかった。His₁のイミダゾレウム群が脱方化されると、3Cu(I)協調は、Cys2およびCys₆のブリッジングチオレート群、ならびに彼_の1および彼_の5のδN₁およびδN 5に変換_され、5それぞれ(3a)。

amb₄ Cu(I/II)結合および酸化還元活性のpH依存性
IM-MSおよびB3LYP技術は、amb₄₍図1C)のCu(II)およびpH滴定を調査するために使用され、最大3つのCu(I)イオンまたは2つのCu(II)を含むamb₄のモノマー、ダイマー、トリマー、およびテトラマー複合体を同定した。)各モノマーサブ^{ユニット39}のイオン。複合体はまた、ジスルフィドブリッジの様々な数を含み、これらの製品は、Amb₄とのCu(II)反応が嫌気性または好気性水溶液で行われたかどうかの有無にかかわらず生成された。

IM-MS技術を用いて、これらの個々の種は、到着時間の違いのために同位体パターンが重なり合っていても分離・定量化できることを示した(図4)。これらの密接に関連する種の同定と定量は、他の器械的または分析的な技術が達成できないタスクである。これらのIM-MS研究は、pH依存性酸化還元反応に関するかなりの洞察を提供し、正確に中間または分子内ジスルフィドブリッジの数、Cu(I)またはCu(II)イオンの数、および各複合体の脱プロトネーション部位の数を同定しました(図 5)。

さらに、複合体CCSを測定すると、個々の種の立体サイズの決定も可能となり、これは、広範なB3LYP/LanL2DZサーチで使用され、正しい分子の両方に合意した構造を持つ適合体を見つけるために使用されました。IM-MSで測定したストイチオメトリーとCCS。この方法により,様々な複合体のCu(I/II)の調整が同定された.Cu(II)とamb₄との間の反応は、溶液のpHに応じて、Cu(I)またはCu(II)のいずれかを調整するダイマー、トリマー、およびテトラマーの形成を含んだ。

例えば、軽度の酸性(pH = 3.0-6.0)の溶液では、主にCu(I)イオンを結合し、酸化を解除し、わずかに基本的な溶液(pH=8.0-11.0)では、主にCu(II)イオンを結合し、すべての嚢胞形成によって酸化された。債券(図6)。B3LYP/LanL2DZは、Cu(I)イオンがチオレートおよびイミダゾール基によって線形および橋渡しされ、Cu(II)イオンはイミダゾールによって歪んだT字形または正方形の平面形状と非プロトン化されたバックボーン窒素によってキレートされたと判断した。アミドグループ。

mb-OB3bのIM-MS分析
IM-MS研究19、mb-OB3b(図1D)^の40は、ガス相において、Cu(I)フリーmb-OB3bが3つの負電荷種として存在することを示した:[mb-OB3b-H] – [mb-OB3b-2H]^2-, [mb-OB3b-3H]^3-期待されるソリューションフェーズの動作と一致します。個々の金属イオン滴定^を行い、mb-OB3bの金属イオン選択性を決定した。図7は、選択された金属イオン滴定の結果を示し、mb-OB3bの明らかな結合選択性が3つの主要なグループとして分類できることを示しています:1)Cu(I)およびAg(I);。2) Ni(II)、Zn(II)およびCo(II);そして3)Pb(II)、Fe(II)、およびMn(II)。この結合選択性の順序は、蛍光消光^実験19および他相性滴定カロリーメ^トリー18によって見出されたものと一般的に一致していることが示された。

mb-OB3bとアンブの比較₇金属結合選択性
mb-OB3bの明らかな結合選択性は、7のpHにおけるamb₇の結合選択性と比較した。amb₇はmb-OB3bと同じアミノ酸配列で設計されたが、2つのエネチオールオキサゾロン基を2つのHis-Cys群に置き換えた。amb₇ (図 1E)は、Cys₆と Cys₁₂の間に単一のジスルフィド結合を有する。負の荷電複合体(図8)の形成の結果は、Amb₇がNi(II)およびZn(II)に対して好ましい結合選択性を示し(60%)、次いでCo(II)およびPb(II)(40%)が続いた。さらに、約20%Cu(II)結合があった。Ag(I)、Mn(II)、またはFe(II)のトレースまたはamb₇バインディングが行われなかった。これは、Cu(I)およびAg(I)結合に対するmb-OB3bの好ましい結合選択性と比較した。

図1:代替メタノバクチン(amb)およびメタノバクチン(mb-OB3b)ペプチドの一次構造。(A)アセチルヒ_ス1-Cys₂-Gly₃-Pro₄-His₅-Cys₆ (amb_1);(B)アセチル-彼_の1-Cys₂-Tyr₃-Pro₄-彼_の5-Cys₆ (amb_2);(C)アセチル-ヒ_ス1-Cys₂-Gly₃-Ser₄-Tyr₅-Pro₆-His₇-Cys₈-Ser₉ (amb_4);(D) 1-(N-[メルカプト-(5-オキソ-2-(3-メチルブタノイル)オキサゾール-(Z)-4-イリデン)メチル]-_グリ1--グリ1--_サー2–Cys₃–Tyr_4)-ピロリジン-2-yl-(メルカプト-[5-オキソオキサゾール-(Z)-4-イリデン]メチル)-_サー5–Cys₆–メット7(mb-OB3b);(E)アセチル・ルー₁-彼の₂-Cys₃-Gly₄-Ser₅-Cys₆-Tyr₇-Pro₈-彼の₉-Cys₁₀-Ser 11 -Cys₁₂-Cys₁₂-Met₁₃ (amb₇₎シェーディングは示しています: 2His-2Cys またはエネチオール-オキサゾロン結合部位 ( );プロリンまたはピロリジンヒンジ();アセチルまたはメチルブタノール群N終位 ();第2の溶解シェルπ-カチオン相互作用を介して金属イオンの協調を安定させることができるチロシン(この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:代替メタノバクチンの平均相対強度(amb₁₎アセチル-ヒ_ス1-Cys2-Gly₃-Pro₄-His₅-Cys₆および金属結合複合体(amb₁+X) X = Cu または Zn)。観察は、ambの1:1モル比溶液の負および正イオン質量分析の間に行われました:X_Cl2は3.0〜11.0のpH範囲にわたって。誤差バーは、3回の反復pH滴定実験からの相対強度とpHの両方の平均の標準偏差を示す。amb:CuCl₂の1:1モル溶液は、Cys2およびCys6を有するアンブ(amb_ox)の酸化をもたらし、二硫化橋を形成した。 (A) ambの陰性イオン分析:CuCl₂を示す [amb_ox-H]^-および [アンブ_オックス-3H+Cu(II)]^{- .}(B) ambの正イオン分析:CuCl₂ [amb_ox]^{+ および}[amb_ox+Cu(I/II)]⁺;複合体内のCuの酸化状態はpH依存性であり、[amb_ox+Cu(I)]+; 8のpHの下に [amb_ox-H+Cu(II)]⁺;pH の上に 8。(C) ambの負のイオン分析:ZnCl₂ [amb]ⁿ⁻および [amb+Zn(II)]ⁿ⁻(D) ambの正イオン分析:ZnCl₂ [amb]ⁿ⁺と [amb+Zn(II)]ⁿ⁺を示す.この図は、以前の^出版物20から適応されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:理論のB3LYP/LanL2DZレベルから位置する最も低いエネルギーおよび幾何学に最適化された構造を用いて[amb₂+3Cu(I)]+の提案された構造。(A)3 Cu(I) 彼_の1とHis₅のδN₁δN₅を介した調整と、217±6Å2の理論的断面を有するCys2およびCys ₆のチオリンジチオ化チートをチオレートする。(B)δN₁δN₅とチオレートブリッジ調整の図。(C)カルボキシル化末端(Cys6)を介した3Cu(I)協調を示す塩橋梁構造(Cys6)、δN5、および209±6Å2の理論断面を有するチオレートブリッジング。(D)カルボキシル化端子、δN_5、およびチオレートブリッジ調整の図。接合距離A、B、C、D、E、およびFはÅの単位で示される。この図は、以前の^出版物37から適応されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:pH=4.4におけるamb 4:Cu(II)の1:1混合物の産物のIM-MS分析。 (A) [amb₄-2H+3Cu(I)]+^の同位体パターンを抽出し、[diamb 4 -4H+6Cu(I)]2+、[トライアン_{ム4−6H+9Cu(I)]3+}および[テトラ_{アン4−8H+12Cu(I)]4}^種。 (B) [amb₄-2H+3Cu(I)]^{+ ,}[diamb 4 -4H+6Cu(I)]²⁺, [トライアンブ₄-6H+9Cu(I)]³⁺および [テトラアン₄-8H+12Cu(I)]⁴⁺相対的な強度を計算するために使用されました。相対的強度のパーセンテージを計算するために、各滴定点に対して抽出されたすべての種の積分面積の合計を使用して、パーセントスケールに正規化しました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:単体Cu(I/II)結合amb₄の同位体パターンの変化は、Cu(II):pH=4.04、6.02、および9.98_のpH等価物のpH滴定の間に観察された。pH = 4.04 では、実験結果は主に [amb₄+Cu(I)]⁺の同位元モデルと一致します。pH = 6.02 では、-2 m/z のシフトがあり、ジスルフィド ブリッジの形成 (amb_4oxの酸化として示される) と[amb_4ox+Cu(I)]⁺の同位体パターンとの一致を示します。pH = 9.98 では、Cu(II) バインディングを意味し、+1 電荷状態を維持するためにプロトンを除去し、[amb4ox-H+Cu(II)] +の同位体パターンと一致する-1 m/z の更なるシフトがあります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:3.0~11.0のpH範囲にわたってamb₄のモノマー、ダイマー、トリマーのCu(I/II)複合体のアイデンティティの相対的強度を変化させる。 (A) 1 Cu(I/II) イオンを持つモノマー、(B)ダイマーに2Cu(I/II)イオン、(C)3Cu(I/II)イオンを含むトリマー。 キャプションは、複合体内にいくつの二分性結合が存在していたかを示しています。この図は、以前の出版物³⁹から適応されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図7:Cu(I)、Ag(I)、Zn(II)、Ni(II)、Co(II)、Mn(II)、Pb(II)、またはFe(II)複合体のメタノバクチンの形成の割合。メタノバクチンの個々の金属イオン滴定の間に観察される。なお、Cu(I)結合は、Fe(III)の添加によるCu(II)およびFe(II)結合の添加に起因する。この図は、以前の^出版物19から適応されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図8:cu(I/II)、Ag(I)、Zn(II)、Ni(II)、Co(II)、Mn(II)、Pb(II)、またはFe(II)のプレートをmb-OB3bとamb₇で比較したpH=7。比較は、負の荷電イオンの形成に関する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル。ガウスビューの使用法。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

重要なステップ:ESI-IM-MSを介した検査のためのソリューションフェーズの動作の保存
ネイティブESIインストゥルメンタル設定は、ペプチオメトリー、電荷状態、および立体構造を保存するために使用する必要があります。ネイティブ条件の場合、コーン電圧、温度、ガスフローなどのESIソースの条件を最適化する必要があります。また、ソース、トラップ、イオンモビリティ、および移動波(特にIMセルへの射出電圧を制御するDCトラップバイアス)の圧力と電圧が、充電状態およびイオンモビリティ分布に与える影響をチェックする必要があります。

本作業で使用した一般的な動作条件を以下に示します。水性ペプチドサンプルは、10 μL^分−1流量、2.0kVキャピラリー電圧(+)またはマイナスイオン(-)、マイナスイオン(-)、130°C源温、250°C脱溶解、20Vサンプリングコーン、および4.0Vを用いて鈍い鼻1.0mLシリンジを使用して注入した。抽出コーン。IMセクションは1.5 mL/min流量を使用して2.25 x 10^-2 mbarのアルゴン圧力が付いているトラップセルへの6.0 V入口電圧と作動した。IMセルにイオン(トラップDCバイアス)を注入する電圧は、最初に窒素バッファーガスと衝突したイオンの解離を避けるために12Vに設定した。IM細胞は電荷と衝突断面に基づいてイオンを分離し、0.52 mbar窒素圧力と20.0mL^分−1流量を利用した。IM は、12.0~20.0 V (+) または 8.0-30.0 V (−)走行波の高さで動作し、800-1,500 m s^-1 (+) または 250-1,000 m^s−1 () ベロシティで、IM 走行波のセルをスイープするたびに動作しました。転写セルはトラップ細胞と同じアルゴン圧で作動し、IM分解イオンを直交時間質量対電荷アナライザに導いた。イオンモビリティ質量スペクトルは、イオンのゲート放出をIM細胞内に同期させることにより、飛行時間質量電荷アナライザと同期して取得した。

ネイティブ ESI 条件を使用すると、IM-MS 解析中に電荷状態や立体構造状態などのソリューションフェーズプロパティが保存されます。例えば、IM-MS^{分析20、37}の間に観察されたmb-OB3bおよびambの電荷状態^は、溶液^{フェーズ40}で予想される電荷状態と密接に関連していた。mb-OB3bペプチドは四面体であり、Im-MS^分析40の間に負に帯電したイオンのみを形成し、Cu(I)結合またはCu(I)フリーのいずれであっても、C-終端(pKa<1.7)、2つのエネチオールオキサゾロン基(pKa = 5.0および9.7)、およびTyrグループ(pKa = 11.0)42.完全にプロトン化された形態のAMbは、C-終位(pKa ≥ 2)、2つのHis(pKa = 6.0)、2つのCys(pKa = 8.3)、およびTyr(pKa = 11.0)^{サイト19、41}のために+2の全体的な電荷を持つことになります。したがって、それらは一般に<6のpHで正に帯電したイオンを形成し、>6のpHで負に帯電したイオンを形成する。

また、低pHでCu(I)結合が高いpHでCu(II)結合に転移した明確なpH依存性Cu(I/II)結合挙動および酸化還元活性も明らかであった。Cu(I/II)反応は、ジスルフィド結合および様々なマルチマーおよび複数のCu(I/II)結合を含む酸化されたアンブ種(amb_ox)を形成することを含む(図5および図6)。これらの酸化還元反応は時間依存性であり、サンプル調製とIM-MS分析との間の時間間隔(最大210分)が長いほど、より酸化された製品^が37を観察されたことが示された。そのため、製品の観察に対する反応時間依存の慎重な検討も必要である。

制限事項:IM-MSと理論的衝突断面は、各金属イオンが好む調整のタイプを特定します
IM-MS m/z および CCS データの解釈に役立つよう、理論の B3LYP/LanL2DZ レベルを使用して広範な検索を行いました。異なるコーディネーション部位を有する幾何学的最適化された適合体は、予測された自由エネルギーとIM-MSによって測定されたCCSとの合意との間で比較された。これらの比較的大きなシステムに適用できる構造計算。研究または推奨されている他の方法は、M05-2Xが最高のDFT機能であり、PM7およびMNDO/dがZn(II)含有^化合物44に対する良好なNDDO半経験的方法であったことが判明したTruhlar et^{al. 43}による研究を含む。これらのペプチドは、大きな立体構造空間を有し、最も低いエネルギー適合体を見つけるために徹底的な調査は、様々な金属キレート部位、様々なシスおよびトランスペプチド結合、塩橋、水素結合、およびπ-cationを比較することを含む必要があります芳香族Tyr側群と金属陽イオンとの相互作用。

既存の方法に関する意義:cu(I/II)およびmb-OB3bとambsとの比較による他の選択された金属イオン結合
X線結晶学およびNMR分光法は、ペプチド三次構造の原子分解能を決定するために使用される最も一般的な技術である。しかしながら、メタロペプチドのX線結晶学研究は、これらの^複合体45の結晶化に関する問題のために乏しい。NMRはまた、密接に関連する個々のオリゴペプチド種が存在する試料の解釈には適^{していない46。}したがって、IM-MSおよびDFT分子モデリングは、特に複雑な酸化還元およびCu(I/II)結合^{反応20、37、40}に起因するペプチド反応を研究するための代替技術である。^47.IM-MSの強みは、各製品を分解し、そのm/zと、修道的、原生状態、立体構造に関連する到着時間を同時に測定することによって、その分子組成を同定できることです。

例えば、mb-OB3bは様々な金属イオンをキレートし、各イオンに対する選択性をIM-MS金属イオン滴定によって表示した(図7)。結果は、Cu(I)およびAg(I)の結合のためのmb-OB3bの好みを示し、一方で、amb₇とpHのpHで結果を比較した。図8は、amb₇が優先的にZn(II)およびNi(II)をキレートすることを示す。一般的に、ambの研究は、2つのエネチオール-オキサゾロンを2His-2Cysに置き換えることはCu(I/II)結合を排除しなかったことを示したが、それは単核Cu(I)とは対照的に、線形ブリッジ調整を介して複数のCu(I)結合をもたらした(図3)。mb-OB3bの四面体協調の結合⁴⁸.Cu(II)還元はまた、apo-mb-OB3bの既存のジスルフィドブリッジと対照的にチオール酸化およびジスルフィドブリッジ形成によって媒介され、Cu(I)49の強い好みをサポートする銅搭載mb-OB3bの高い還元電位.

今後のアプリケーション
アンブペプチドのさらなるIM-MS研究が進行中であり、その一次配列は、彼らの一次配列がGlyまたはAspに置き換えることによって修飾され、Tyr残渣はGlyまたはPheのいずれかに置き換えられる。これらの研究はまた、10.0 mMの酢酸アンモニウムで行われており、pHを水酸化アンモニウム(pH=7、8、9の場合)で修飾し、各サンプルの総イオン強度を一定に保ちます。これらの結果はまもなく公開されます。

著者は何も開示していない。

この資料は、1764436、NSF機器サポート(MRI-0821247)、ウェルチ財団(T-0014)、エネルギー省(TX-W-20090427-0004-50)およびL3コミュニケーションズの下で国立科学財団が支援する作業に基づいています。.私たちは、シグマプログラムを共有するためのカリフォルニア大学サンタバーバラのバウアーのグループに感謝し、ビデオで技術を実証するためのアヨバミ・イレサンミ。