Tecniche di spettrometria ione Mobilità-Massa per determinare la struttura e i meccanismi del riconoscimento degli ioni metallici e dell'attività di redox degli oligopeptidi di metal linciazione

La spettrometria di massa io-masse ionica e le tecniche di modellazione molecolare possono caratterizzare le prestazioni selettive di chelatura metallica di peptidi progettati e la metanobattina peptide legante al rame. Lo sviluppo di nuove classi di peptidi chelanti metallici contribuirà a portare alle terapie per le malattie associate allo squilibrio degli ioni metallici.

La ionizzazione elettrospray (ESI) può trasferire un peptide a queous-fase o complesso di peptidi alla fase gassosa conservando la sua massa, carica complessiva, interazioni di legame metallico, e forma conformante. L'accoppiamento dell'ESI con la spettrometria di massa iosataria (IM-MS) fornisce una tecnica strumentale che consente di misurazione simultanea della massa di carico (m/z) di un peptide e della sezione trasversale di collisione (CCS) che si riferiscono alla sua stoichiometria, allo stato di e forma conformazionale. La carica complessiva di un complesso di peptidi è controllata dalla protonazione di 1) siti acidi e di base del peptide e 2) lo stato di ossidazione degli ioni metallici. Pertanto, lo stato di carica generale di un complesso è una funzione del pH della soluzione che influisce sull'affinità di legame ios metallico peptidi. Per le analisi ESI-IM-MS, le soluzioni per gli ioni di peptidi e metalli sono preparate da soluzioni acquose, con il pH regolato con acido acetico diluito aqueso o idrossido di ammonio. Ciò consente di determinare la dipendenza da pH e la selettività degli ioni metallici per un peptide specifico. Inoltre, l'm/z e il CCS di un complesso di peptidi possono essere utilizzati con la modellazione molecolare B3LYP/LanL2D per discernere i siti di legame del coordinamento degli ioni metallici e della struttura terziaria del complesso. I risultati mostrano come ESI-IM-MS possa caratterizzare le prestazioni di chelating selettivo di una serie di peptidi alternativi di metanobatteriteina e confrontarli con la metanobattina peptide legante in rame.

Gli ioni di rame e zinco sono essenziali per gli organismi viventi e cruciali per i processi tra cui la protezione ossidativa, la crescita dei tessuti, la respirazione, il colesterolo, il metabolismo del glucosio e la lettura del genoma¹. Per abilitare queste funzioni, gruppi come il tiolati di Cys, imidazole del Suo^2,3, (più raramente) thioether di methionina, e carboxylate di Glu e Asp incorporano selettivamente i metalli come cofattori nei siti attivi di enzimi in metallo. La somiglianza di questi gruppi di coordinamento solleva una domanda intrigante riguardo al modo in cui i ligandi Dei Suoi e dei Cys incorporano selettivamente cu(I/II) o n(II) per garantire il corretto funzionamento.

L'associazione selettiva è spesso realizzata mediante l'acquisizione e la tratta di peptidi, che controllano le concentrazioni di ioni di Cu(I/II)⁴. Cu(I/II) è altamente reattivo e causa danni ossidativi o legame avventuroso agli enzimi, quindi la sua concentrazione libera è strettamente regolata da chaperones in rame e proteine che regolano il rame che lo trasportano in modo sicuro in varie posizioni nella cellula e strettamente controllare la sua omeostasi^5,6. L'interruzione del metabolismo del rame o dell'omeostasi è direttamente implicata nella malattia di Menkes e Wilson⁷ così come i tumori⁷ e disturbi neurali, come il prione⁸ e il morbo di Alzheimer⁹.

La malattia di Wilson è associata all'aumento dei livelli di rame negli occhi, nel fegato e nelle sezioni del cervello, dove le reazioni di redox di Cu(I/II) producono specie reattive dell'ossigeno, causando degenerazione epatolenticola e neurologica. Le terapie di chelatazione esistenti sono la piccola penicillamina e trietilenetetramina. In alternativa, i peptidi metanoobatteri di rame metatonobatteri (mb)^10,11 presentano un potenziale terapeutico a causa della loro elevata affinità legante per Cu(I)¹². Quando il metanobatteritina (mb-OB3b) del metilosino trichosporium OB3b è stato studiato in un modello animale della malattia di Wilson, il rame è stato efficacemente rimosso dal fegato ed escreto attraverso la bile¹³. Gli esperimenti in vitro hanno confermato che mb-OB3b potrebbe masticare il rame dal metallothionein di rame contenuto nel citosol epatico¹³. Le tecniche di imaging della spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente hanno studiato la distribuzione spaziale del rame nei campioni epatici della malattia di Wilson^14,15,16 e hanno dimostrato che mb-OB3b rimuove il rame con brevi periodi di trattamento di soli 8 giorni¹⁷.

L'mb-OB3b si legherà anche con altri ioni metallici, tra cui Ag(I), Au(III), Pb(II), Mn(II), Co(II), Fe(II), Ni(II) e n(II)^18,19. Il concorso per il sito di rilegatura fisiologica Cu(I) è esposto da Ag(I) perché può spostando Cu(I) dal complesso mb-OB3b, con Ag(I) e Ni(II) che mostrano anche un legame irreversibile a Mb che non può essere spostato da Cu(I)¹⁹. Recentemente, una serie di oligopeptidi alternativi di metanobatterica (amb) con il motivo di rilegatura 2His-2Cys sono stati studiati^20,21, e le loro proprietà di rilegatura di N (II) e Cu(I/II) sono state studiate. Le loro sequenze di amminoacidi primarie sono simili, e contengono tutte il motivo 2His-2Cys, Pro e un N-terminus acetilato. Essi differiscono principalmente da mb-OB3b perché il motivo 2His-2Cys sostituisce i due siti di rilegatura enethiol oxazolone di mb-OB3b.

La ionizzazione dell'elettrospray accoppiata con la spettrometria di massa-massa a ioni (ESI-IM-MS) fornisce una potente tecnica strumentale per determinare le proprietà di legame dei metalli dei peptidi perché misura la loro massa a carica (m/z) e la collisione (CCS) conservando la massa, la carica e la forma conformazionale dalla fase della soluzione. I m/z e ccS si riferiscono alla stochichiometria dei peptidi, allo stato di protonazione e alla forma conformazionale. La stoichiometria è determinata perché l'identità e il numero di ogni elemento presente nella specie sono esplicitamente identificati. La carica complessiva del complesso di peptidi si riferisce allo stato di protonazione dei siti acidi e di base e allo stato di ossidazione degli ioni metallici. Il CCS fornisce informazioni sulla forma conformazionale del complesso di peptidi perché misura la dimensione media rotazionale che si riferisce alla struttura terziaria del complesso. Lo stato di carica generale del complesso è anche una funzione di pH e colpisce l'affinità di legame degli ioni metallici del peptide perché i siti di base deprotonizzati o acidi come il carboxyl, His, Cys e Tyr sono anche i potenziali siti di legame per gli ioni metallici. Per le analisi, il peptide e gli ioni metallici vengono preparati in soluzioni acquose con il pH regolato da acido acetico aluto o idrossido di ammonio. Ciò consente di determinare la dipendenza da pH e la selettività degli ioni metallici per il peptide. Inoltre, l'm/z e la CCS determinati da ESI-IM-MS possono essere utilizzati con la modellazione molecolare B3LYP/LanL2D per scoprire il tipo di coordinamento degli ioni metallici e la struttura terziaria del complesso. I risultati mostrati in questo articolo rivelano come ESI-IM-MS può caratterizzare le prestazioni di chelating selettivo di una serie di amb peptidi e confrontarli con il peptide mb-OB3b di legame di rame.

1. Preparazione dei reagenti

1. Cultura Methylosinus trichosporium OB3b, isolare il Mb-OB3b senza Cu(I)^18,22,23, congelare il campione e conservare a -80 gradi centigradi fino all'uso.
2. Sintetizzare i peptidi dell'amb (>98% purezza per amb₁, amb₂, amb₄; >70% purezza per amb₇), liofilizzare i campioni, e conservarli a -80 gradi centigradi fino all'uso.
3. Acquisto >98% di colcalo di purezza(II), cloruro di cobalto (II), cloruro nickle(II), cloruro di rame(II), nitrato di rame(II), nitrato d'argento(II), cloruro di zinco(II), cloruro di ferro(III) e cloruro di piombo(II).
4. Acquistare i polimeri poli-DL-alanina utilizzati come calibronti per misurare le sezioni trasversali di collisione della specie amb e l'idrossido di ammonio superiore o superiore, l'acido acettico glaciale e l'acetonitrile.

2. Preparazione della soluzione di stock

1. Soluzione stock di peptidi
   1. Pesare con precisione, utilizzando almeno tre figure significative, la massa di 10.0–20.0 mg del mb-OB3b o amb in una fiala di plastica 1.7 mL.
      NOTA: La massa pesata dovrebbe produrre 12,5 mM o 1,25 mM, a seconda della solubilità del peptide, quando vengono aggiunti 1,00 mL di acqua deionizzata (DI).
   2. Utilizzando un pipet, aggiungere 1,00 mL di acqua deionizzata (>17,8 cm) al campione di peptide pesato per produrre la soluzione da 12,5 mM o 1,25 mM. Mettere il tappo in modo sicuro e mescolare accuratamente con almeno 20 inversioni.
   3. L'utilizzo di un micropipet eroga 50,0 aliquote dal campione di peptide in fiale da 1,5 mL etichettate individualmente e le conserva a -80 gradi centigradi fino all'uso.
2. Soluzioni per ioni metallici
   1. Pesare con precisione, utilizzando almeno tre figure significative, la massa di 10.0–30.0 mg del cloruro metallico o nitrato d'argento in una fiala da 1,7 mL.
      NOTA: La massa pesata deve produrre 125 mM quando viene aggiunto 1,00 mL di acqua DI.
   2. Aggiungere 1,00 mL di acqua DI al campione di metallo pesato nella fiala da 1,7 mL per produrre la soluzione da 125 mM. Mettere il tappo in modo sicuro e mescolare accuratamente con almeno 20 inversioni.
3. Soluzioni per il serbatoio di idossido di ammonio: preparare una soluzione di acido acetico di 1,0 M diluindo 57 -L della soluzione di acido acetico del 99,5% con acqua DI ad un volume finale di 1,00 mL. Preparare una soluzione di idrossido di ammonio di 1,0 m diluindo 90 -L della soluzione di idrossido di ammonio del 21% con acqua DI ad un volume finale di 1,00 mL. Fare due diluizioni successive di ogni soluzione prendendo 100 L delle soluzioni da 1,0 M per preparare soluzioni di acido acetico e idrossidi di ammonio da 0,10 M e 0,010 M.
4. Soluzione di stock poli-DL-alanina: preparare la poli-DL-alanina (PA) pesando 1,0 mg di PA e sciogliendo in 1,0 mL di acqua DI per dare 1.000 ppm. Mescolare accuratamente. Utilizzando un micropipet, erogare aliquote di 50,0 gradi centigradi, e metterle in una fiala da 1,7 mL e conservarle a -80 gradi centigradi.

3. Analisi della spettrometria della mobilità-massa agli ioni elettrospruzzi

1. Pulire accuratamente il tubo d'ingresso ESI e l'ago capillare con circa 500 sl di acido acetico glaciale di 0,1 m, idrossido di ammonio da 0,1 m e infine acqua DI.
2. Scongelare una 50,0 l'una della soluzione di 1.000 ppm PA e diluirla con 450 l di acqua DI per dare un 100 ppm PA. Pipet 100.0 l di questa soluzione e diluirlo a 1,00 mL con 500 l di acqua DI e 500 L di acetonitrile per dare la soluzione PA 10 ppm.
3. Raccogliere gli spettri IM-MS negativi e positivi della soluzione PA da 10 ppm per 10 min ciascuno utilizzando condizioni ESI-IM-MS native, come descritto nella sezione di discussione.
4. Scongelare una soluzione di riserva di 12,5 mm o 1,25 m amb m e fare diluizioni successive con acqua DI per dare una concentrazione finale di 0,125 mM amb. Mescolare accuratamente ogni diluizione.
5. Tubo 100.0 ll della soluzione di scorta di ioni metallici da 125 mM, mettere in una fiala da 1,7 mL e diluire a 1,00 mL con acqua DI per dare ioni metallici 12,5 mM. Ripetere con altre due diluizioni successive per dare un'ultima concentrazione di 0,125 mm di ioni metallici. Mescolare accuratamente ogni diluizione.
6. Pipet 200.0 L dell'amb di 0,125 mM in una fiala da 1,7 ml, diluire con 500 l di acqua DI e mescolare accuratamente la soluzione.
7. Regolare il pH del campione a 3,0 aggiungendo 50 , luna di 1,0 M soluzione di acido acetico.
8. Aggiungere al campione regolato il pH di 200,0 l ioni metallici. Aggiungere l'acqua DI per produrre un volume finale di 1,00 mL del campione, mescolare accuratamente e lasciare che il campione equilidestina per 10 min a RT.
9. Utilizzando una siringa naso smussata prendere 500 L del campione e raccogliere lo spettro ionegativo e positivo ES-IM-MS per 5 min ciascuno. Utilizzare i restanti 500 l del campione per registrare il suo pH finale utilizzando un elettrodo micro pH calibrato.
10. Ripetere i passaggi da 3,6 a 3,9, modificando il passaggio 3.7 per regolare il pH a 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 o 10.0 aggiungendo nuovi volumi delle soluzioni 0.010 M, 0.10 M o 1.0 M acetico acido o ammonito hydroxide.
11. Raccogliere gli spettri ESI-IM-MS negativi e positivi della soluzione PA da 10 ppm per 10 min ciascuno.

4. Preparazione della tizione degli ioni metallici dei campioni di amb

1. Seguire i passaggi descritti nei passaggi da 3.1 a 3.5.
2. Pipet 200.0 l of the 0.125 mM amb in a 1.7 mL flebo, diluire con 500,0 l di acqua DI e mescolare accuratamente la soluzione.
3. Regolare il pH del campione in modo da ottenere 9,0 ordini di 9,0 m aggiungendo 80 -L della soluzione di idrossido di ammonio da 0,010 m.
4. Aggiungere 28 l della soluzione di ioni metallici da 0,125 mm per dare 0,14 equivalenti molare dello ione metallico, aggiungere acqua DI per fare il volume finale del campione 1,00 mL, mescolare accuratamente e lasciare che il campione equiligua 10 min a RT.
5. Utilizzando una siringa naso smussata prendere 500 L del campione e raccogliere gli spettri ioni negativi e positivi ESI-IM-MS per 5 min ciascuno. Utilizzare i restanti 500 l del campione per registrare il suo pH finale utilizzando un elettrodo micro pH calibrato.
6. Ripetere i passaggi da 4,2 a 4,5, modificando il passaggio 4.3 per aggiungere un volume appropriato della soluzione iosciolataria da 0,125 mM per fornire equivalente a 0,28, 0,42, 0,56, 0,70, 0,84, 0,98, 1,12, 1,26 o 1,40 molari.
7. Raccogliere gli spettri IM-MS negativi e positivi della soluzione PA da 10 ppm per 10 min ciascuno.

5. Analisi dei dati di titola di PH ESI-IM-MS

1. Dagli spettri IM-MS identificano quali specie cariche di ambs sono presenti abbinandole ai loro modelli teorici di isotopi m/z.
   1. Aprite MassLynx e fate clic su Cromatogramma per aprire la finestra Chromatogram.
   2. Vai al menu File e Apri per individuare e aprire il file di dati IM-MS.
   3. Estrarre lo spettro IM-MS facendo clic con il pulsante destro del mouse e trascinando lo cromatogramma e rilasciandolo. Si aprirà la finestra dello spettro che mostra lo spettro IM-MS.
   4. Nella finestra spettro, fare clic su Strumenti e modello Isotope. Nella finestra di modellazione degli isotopi, immettere la formula molecolare della specie amb, selezionare la casella Mostra ione caricato e immettere lo stato di carica. Fare clic su OK.
   5. Ripetere l'operazione per identificare tutte le specie nello spettro IM-MS e registrare la loro gamma di isotopi m/z.
2. Per ogni specie di amb, separare tutte le specie casuali m/z ed estrarre le loro distribuzioni del tempo di arrivo (ATD) utilizzando i loro modelli di isotopi m/z per identificarli.
   1. In MassLynx fare clic su DriftScope per aprire il programma. In DriftScope fare clic su File e Apri per individuare e aprire il file di dati IM-MS.
   2. Utilizzare il mouse e clic sinistro per ingrandire il modello isotope m/ z della specie amb.
   3. Usate lo strumento selezione e il pulsante sinistro del mouse per selezionare il motivo isotopo. Fare clic sul pulsante Accetta selezione corrente.
   4. Per separare qualsiasi specie casuale di m/z, utilizzare lo strumento Selezione e il pulsante sinistro del mouse per selezionare il modello ATD allineato al tempo con il modello isotopo della specie di amb. Fare clic sul pulsante Accetta selezione corrente.
   5. Per esportare l'ATD, passare a File Esporta in MassLynx, quindi selezionare Mantieni tempo di deriva e salvare il file nella cartella appropriata.
3. Determinare il centroide dell'ATD e integrare l'area sotto la curva ATD come misura della popolazione di specie.
   1. Nella finestra Cromatogramma di MassLynx aprire il file esportato salvato. Fare clic su Processo . Integrare dal menu. Selezionare la casella ApexTrack Peak Integration (Integrazione picco apexTrack) e fare clic su OK.
   2. Registrare l'ATD centroide (t_A) e l'area integrata come mostrato nella finestra del cromatogramma. Ripetere l'operazione per tutti i file di dati amb e PA IM-MS salvati.
4. Utilizzare l'ATD integrato per tutte le specie di amb estratti degli ioni positivi o negativi in ogni punto di titore per normalizzare a una scala percentuale relativa.
   1. Inserisci le identità delle specie di amb e il loro ATD integrato ad ogni pH in un foglio di calcolo.
   2. Per ogni pH, utilizzare la somma degli ATD integrati per normalizzare l'ATD del singolo amb in una scala percentuale.
   3. Tracciare le intensità percentuali di ogni specie di amb rispetto al pH in un grafico per mostrare come la popolazione di ogni specie varia in funzione del pH.

6. Sezioni trasversali di collisione

1. Utilizzando un foglio di calcolo, convertire il CCSs (z) di PA negativo^25,26 e positivo²⁷ ioni misurati in Egli buffer gas²⁸ per correggere CCS_(z)utilizzando l'equazione 1 di seguito, dove: z - carica iola; e _c - carica elettronica (1.602-10^-19 C); m _{N 2} - massa di Gas N₂ (Da); e m_ione - massa iola. ²⁹ del 22 221

2. Convertire gli orari medi di arrivo (t_A) dei calibranti PA e delle specie amb in tempi di deriva (t_D)utilizzando l'equazione 2 di seguito, dove: c - il coefficiente di ritardo del ciclo di servizio migliorato (1,41), e m/z è la massa a carica dello ione peptide.

3. Tracciare i calibranti PA' t_D vs. Quindi, utilizzando un adattamento di regressione dei minimi quadrati dell'equazione 3 mostrato di seguito, determinare i valori A' e B, dove: A' è la correzione per i parametri di temperatura, pressione e campo elettrico; e B compensa l'effetto non lineare del dispositivo iM.

4. Utilizzando questi valori A' e B e il valore centroide t_D dall'ATD degli ambs determinare il loro_c utilizzando l'equazione 3 e il loro s utilizzando l'equazione 1. Questo metodo fornisce CCS per le specie di peptidi con errori assoluti stimati di circa 2%^25,26,27.

7. Metodi computazionali

1. Utilizzare il livello di teoria B3LYP/LanL2D, che comprende il Becke 3-parametro funzioni ibride³⁰ e la base Dunning set³¹ e potenziali nucleo elettronico^32,33,34 per individuare conformatori ottimizzati per la geometria per tutti i possibili tipi di coordinazioni delle specie m/z amb osservate³⁵.
   NOTA: per informazioni dettagliate su come creare e inviare calcoli, fare riferimento all'utilizzo di GaussView in File supplementare.
2. Confrontare l'energia libera prevista di ciascuno dei conformatori e calcolare le loro CS teoriche utilizzando il metodo Lennard-Jones (LJ) in scala iosciata dal programma Sigma³⁶.
3. Dai conformatori di energia libera più bassi determinano quale conformatore presenta la LJ CCS che concorda con l'IM-MS misurata CCS per identificare la struttura terziaria e il tipo di coordinamento per i conformatori osservati nell'esperimento.

Rilegatura metallica di amb₁
Lo studio IM-MS²⁰ di amb₁ (Figura 1A) ha mostrato che sia gli ioni di rame che quelli di zinco sono legati all'amb₁ in modo dipendente dal pH (Figura 2). Tuttavia, rame e zinco legati all'amb₁ attraverso diversi meccanismi di reazione in diversi siti di coordinamento. Ad esempio, l'aggiunta di Cu(II) all'amb₁ ha provocato l'ossidazione di amb₁ (amb_1ox) dalla formazione del ponte disulfide e, con un pH di >6, è stato formato il [amb_1oxs3H(II)]^- ione (Figura 2A). Ciò indicava la deprotonazione di due imidazolium, gruppo carboxyl e due siti aggiuntivi che coordinavano Cu(II).

La modellazione molecolare dello ione [amb 1ox-3H-Cu(II)] è stato determinato dal complesso di energia più bassa, che era il Cu(II) coordinato tramite l'imidazolo che lo rifondeva del suo₁ e gli azoti deprotonati della spina dorsale amide dei gruppi di Cis₂ e Gly₃. Tuttavia, al di sotto di un pH di 6, l'aggiunta di Cu(II) all'amb₁ formava un modello isotopo m/z che poteva essere rappresentato solo dall'associazione Cu(I), formando il [amb_1ox-I)]^- ione (Figura 2B). Al contrario, un pH superiore a 6 ha fatto sì che il modello di isotopo m/z diminuisse di 1 m/z, rappresentato dalla carica positiva [amb_1ox: H-Cu(II)]^- ione. L'aggiunta di n(II) non ha ossidato amb₁, e l'associazione n(II) è stata osservata in un pH di >6, formando principalmente l'[amb₁-3H sn(II)]^- ion(Figura 2C). Ciò indicava la deprotonazione dei gruppi imidazoliums, thiol e carboxyl. La modellazione molecolaredel sistema di modellazione molecolare del sistema di modellazione molecolare del piano di composizione molecolare dei 3On(II)^- ha determinato che il più basso conformatore dell'energia fosse il coordinamento tetraedronsale n (II) tramite 2His-2Cys o His-2Cys e il carboxylate del caporino C.

Rilegatura Cu(I) multipla di amb₂
Le reazioni di redox tra Cu(II) e amb₂ (Figura 1B) hanno provocato l'associazione Cu(I). Questo è stato studiato in modo più dettagliato utilizzando IM-MS, spettrofotometofo UV-Vis e modellazione molecolare B3LYP³⁷. I principali prodotti della titolazione Cu(II) dell'amb₂ a un pH di 5 erano l'ossidazione amb₂ (attraverso la formazione del ponte disulfide) e le specie di amb₂ non sxizzate che coordinano tre ioni Cu(I).

Una ricerca con il metodo B3LYP/LanL2D, ha localizzato due complessi a bassa energia che si contendono la specie coordinata 3Cu(I). Il primo è stato il complesso illustrato nella Figura 3A, in cui gli ioni 3Cu(I) sono stati coordinati tramite i gruppi tiolati di collegamento³⁸ di Cys₂ e Cys₆ (del suo₁₎così come la ). Il secondo complesso (3c) ha un ponte di sale tra il suo gruppo laterale_{protonato 1} e il gruppo carboxylate del terminale C. Questi risultati suggeriscono che a un pH di 3,0–6,0, il complesso principale di 2 amb₂-3Cu(I) è la struttura con ponte di sale, che può essere trasferita con successo dalla soluzione alla fase gassosa con solo un minimo riarrangiamento strutturale.

L'teorico LJ CCS di 209 x 6^,calcolato utilizzando il programma Sigma³⁶ per il complesso 3c, concordato con la IM-MS misurava CCS, indicando che 3c rappresenta [amb₂s2. 3Cu(I)]^- conformazione a pH 3.0-6.0. Tuttavia, a un pH di >6, questo complesso non è stato osservato da IM-MS, probabilmente perché un'ulteriore deprotonazione del suo₁ (pK_a6.0) si traduce in un complesso neutro complessivo. Una volta che il gruppo imidazoleo di His₁ è deprotonato, il coordinamento 3Cu(I) può convertirsi ai gruppi di tiolati di ponte di Cys₂ e Cys_6, nonché alla 0rl,₁ e 5_copie della Sua₁ e della Sua₅, rispettivamente (3a).

La dipendenza dal pH dell'attività di legame amb₄ Cu(I/II)
Le tecniche IM-MS e B3LYP sono state utilizzate per studiare le titrazioni Cu(II) e pH di amb₄ (Figura 1C)e i complessi monomerici, dimero, trimer e tetramer identificati di amb₄ contenenti fino a tre cu(I) ioni o due Cu(II) ) per ogni unità monomera³⁹. I complessi contenevano anche vari numerosi ponti disulfide, e questi prodotti sono stati prodotti indipendentemente dal fatto che le reazioni Cu(II) con amb₄ siano state condotte in soluzioni anaerobiche o aerobiche.

Utilizzando la tecnica IM-MS, è stato dimostrato che queste singole specie potrebbero essere separate e quantificate anche se avevano modelli isotopi sovrapposti a causa delle differenze nei loro tempi di arrivo (Figura 4). L'identificazione e la quantificazione di queste specie strettamente correlate è un compito che nessun'altra tecnica strumentale o analitica può raggiungere. Questi studi IM-MS forniscono una notevole comprensione delle reazioni di redox dipendenti dal pH e hanno identificato esattamente il numero di ponti disulfidi intero o intramolecolari, il numero di ioni Cu(I) o Cu(II) e il numero di siti di deprotonazione in ciascuno dei complessi ( Figura 5).

Inoltre, la misurazione dei complessi CCS ha anche permesso la determinazione di ciascuna delle singole specie di dimensioni conformazionali, che è stato utilizzato con un'ampia ricerca B3LYP/LanL2D per individuare i conformatori con strutture che concordavano sia con la corretta molecolare stoichiometria e CCS misurati da IM-MS. Attraverso questo metodo, è stato identificato il coordinamento Cu(I/II) dei vari complessi. Le reazioni tra Cu(II) e amb₄ includevano la formazione di dimeri, trimer e tetrameri che coordinavano Cu(I) o Cu(II), a seconda del pH della soluzione.

Ad esempio, nelle soluzioni leggermente acide (pH - 3,0–6,0), legavano principalmente gli ioni Cu(I) e non erano prive di sxidizzazione, mentre in soluzioni leggermente basilari (pH - 8,0–11,0), legavano principalmente gli ioni Cu(II) e sono state ossidati da tutti i Cis che formavano disulfide obbligazioni (Figura 6). Il B3LYP/LanL2D determinato che gli ioni Cu(I) erano lineari e colmati dai gruppi di tiolati e imidazoi, mentre gli ioni Cu(II) venivano chelati tramite geometrie distorte a forma di T o planari quadrati da un imidazolo e dagli azoti spina dorsale deprotonizzati di gruppi intermedi.

Analisi IM-MS di mb-OB3b
Gli studi IM-MS^19,40 di mb-OB3b (Figura 1D) hanno dimostrato che nella fase gassosa, Cu(I)free mb-OB3b esiste come tre specie caricate negativamente: [mb-OB3b-H]^–[ mb-OB3b–2H]^2–, e [mb-OB3b–3H] ^3–, coerente con il comportamento previsto della fase della soluzione. Le singole titrazioni di ioni metalli sono state eseguite¹⁹ per determinare la selettività degli ioni metallici di mb-OB3b. La figura 7 mostra i risultati delle titrazioni di ioni metallici selezionati e mostra che l'apparente selettività di legame di mb-OB3b può essere classificata come tre gruppi principali: 1) Cu(I) e Ag(I); 2) Ni(II), n(II) e Co(II); e 3) Pb(II), Fe(II) e Mn(II). Questo ordine di selettività vincolante è stato dimostrato essere in generale d'accordo con quello trovato dagli esperimenti di spegnimento della fluorescenza¹⁹ e dalla calorimetria di titola isotermica¹⁸.

Confronto tra mb-OB3b e amb _{7 (in} questo stato selettività di rilegatura metallica
L'apparente selettività di rilegatura di mb-OB3b è stata confrontata con la selettività di rilegatura dell'amb₇ a un pH di 7. L'amb₇ è stato progettato con la stessa sequenza di amminoacidi mb-OB3b, ma con i due gruppi enethiol oxazolone sostituiti con due gruppi His-Cys. L'amb₇ (Figura 1E) ha un unico legame disulfide tra Cys₆ e Cys₁₂. I risultati della formazione di complessi con carica negativa (Figura 8) hanno mostrato che amb₇ preferiva la selettività di legame per Ni(II) e n(II) (60%), seguiti da Co(II) e Pb(II) (40%). Inoltre, c'era circa 20% Cu(II) vincolante. C'era traccia o nessun amb₇ associazione di Ag(I), Mn(II), o Fe(II). Questo rispetto alla selettività di rilegatura preferita di mb-OB3b di oltre il 90% per l'associazione Cu(I) e Ag(I).

Figura 1: strutture primarie dei peptidi alternativi di metanobatteritina (amb) e metanobatterica (mb-OB3b). (A) Acetil-His₁-Cys₂-Gly₃-Pro₄-His₅-Cys₆ (amb₁); (B) acetil-His₁-Cys₂-Tyr₃-Pro₄-His₅-Cys₆ (amb_2); (C) acetil-His₁-Cys₂-Gly₃-Ser₄-Tyr₅-Pro₆-Il suo₇-Cys₈-Ser₉ (amb₄); (D) 1-(N-[mercapto-(5-oxo-2-(3-metilbutanoyl)oxazol-(')-4-ylidene)methyl]-Gly_{1 –1}–Ser₂– Cis₃–Tyr₄)-pyrrolidin-2-yl-(mercapto-[5-oxo-oxazol-(z)-4-ylidene]metile)-Ser₅ –Cys₆–Met₇ (mb-OB3b); e (E) acetil-Leu₁-Il suo₂-Cys₃-Gly₄-Ser₅-Cys₆-Tyr₇-Pro₈-Suo₉-Cys₁₀-Ser₁₁-Cys₁₂-Met ₁₃ (amb₇). L'ombreggiatura mostra i: 2His-2Cys o enethiol-oxazolone siti vincolanti (); cerniere proline o pirrodine ( ); acetil o metilbutanol gruppo N-terminus (); e tirosina, che possono stabilizzare la coordinazione degli ioni metallici attraverso una seconda interazione di solvazione -cation (). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Intensità media relativa del metanobatteritarina alternativa (amb₁) acetil-His₁-Cys₂-Gly₃-Pro₄-His₅-Cys₆ and metal-bound complex (amb₁x)(dove X - Cu o n). Le osservazioni sono state fatte durante le analisi di spettrometria di massa iomatica negativa e positiva della soluzione del rapporto molare 1:1 di amb:XCl₂ nell'intervallo di pH di 3,0–11,0. Le barre di errore mostrano le deviazioni standard dei mezzi sia dell'intensità relativa che del pH da tre esperimenti di titolamento del pH replicati. La soluzione molare 1:1 di amb:CuCl₂ ha portato all'ossidazione di amb (amb_ox) con Cys₂ e Cys₆, formando un ponte disulfide. (A) Analisi negativa degli ioni di amb:CuCl₂ che mostra [amb_oxsH]^- e [amb_oxs3H-Cu(II)]^. (B) Analisi iosa positiva di amb:CuCl₂ che mostra [amb_ox]^, e [amb_ox lo stato di ossidazione di Cu nel complesso era dipendente dal pH,essendo [amb_oxs.[  al di sotto di un pH di 8 e [amb_ox sopra un pH di 8. (C) Analisi iosnegativa di amb: . . . . . . . . ._. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (D) Analisi iosa positiva di amb: Questa cifra è stata adattata da una precedente pubblicazione²⁰. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Strutture proposte di [amb₂- 3Cu(I)]^- utilizzando le strutture più basse ottimizzate per l'energia e la geometria situate dal livello di teoria B3LYP/LanL2D. (A) 3 Cu(I) coordinamento tramite_{n. 1}che fa parte di 1 del Suo₁ e del suo₅ e tiolate bridging gruppi di Cys₂ e Cys₆ con una sezione teorica di 217 6 ^. (( B) Illustrazione della coordinazione bridging di tiolate_n.1 e di tiolata. (C) Struttura a ponte con salto che mostra la coordinazione di 3 Cu(I) tramite il terminale carboxylate (Cys₆,_{n, N 5}e il tiolato ponte con una sezione trasversale teorica del 2099 - 6^. (D) Illustrazione del terminale carboxylate, ovvero il n₅e la coordinazione del bridging del tiolato. Le distanze di incollaggio A, B, C, D, E e F sono mostrate nell'unità di . Questa cifra è stata adattata da una precedente pubblicazione³⁷. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi IM-MS dei prodotti della miscela 1:1 di amb₄:Cu(II) a pH 4.4.  (A) Modelli di isotopo estratti per le specie [amb₄s2H (I)]^,[diamb₄,4H-6Cu(I)]^2,[triamb₄s9H.9Cu(I)]³ e [tetraamb₄s8H-12Cu(I)]^4. (B) Integrazione degli orari di arrivo estratti di [amb₄s2H s3.3Cu(I)]^,[diamb₄,4H-6Cu(I)]^{2 ,}[triamb₄s6H , 9Cu(I)]³ e [tetraamb₄, 8H , 12Cu(I)]⁴ sono stati utilizzati per calcolare la loro intensità relativa. Per calcolare l'intensità relativa percentuale, la somma dell'area integrata per tutte le specie estratte per ogni punto di titolazione è stata utilizzata per normalizzare la scala percentuale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Cambiamento del modello di isotopo per il Pingly Cu(I/II) legato amb₄ osservato durante la titolazione pH degli equivalenti molare di Cu(II):amb₄ a pH 4.04, 6.02, e 9.98. A pH - 4,04, il risultato sperimentale corrisponde principalmente al modello isotopico per [amb₄-Cu(I)]^. A pH - 6,02, c'è uno spostamento di -2 m/z, che significa la formazione del ponte disulfido (mostrato come ossidazione di amb_4ox) e l'accordo con il modello isotopico per [amb_4ox- Cu(I)]^. A pH - 9,98, c'è un ulteriore spostamento di -1 m/z, che significa legame Cu(II) e la rimozione di un protone per mantenere lo stato di carica di 1, che poi corrisponde allo schema isotopico per [amb_4ox) Cu(II)]^. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Modifica dell'intensità relativa delle identità dei complessi Cu(I/II) del monomero, dimero e trimer di amb₄ su intervallo di pH di 3.0–11.0.  (A) Monomer con uno cu(I/II) ioni, (B) dimero con 2 ioni Cu(I/II) e (C) trimer con 3 cu(I/II) ioni. Le didascalie indicano quanti legami disulfide erano presenti nel complesso. Questa cifra è stata adattata da una precedente pubblicazione³⁹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Percentuale di formazione dei complessi Cu(I), Ag(I), N(II), Ni(II), Co(II), Mn(II), Pb(II) o Fe(II) di metanobatteria. Osservato durante le titrazioni individuali agli ioni metallici di metanobatterica. Va notato che l'associazione Cu(I) derivava dall'aggiunta dell'associazione Cu(II) e Fe(II) dall'aggiunta di Fe(III). Questa cifra è stata adattata da una precedente pubblicazione¹⁹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Confronto della percentuale di Chelazione Cu(I/II), Ag(I), N(II), Ni(II), Co(II), Mn(II), Pb(II) o Fe(II) di mb-OB3b e amb₇ a pH - 7. Il confronto è per la formazione di ioni caricati negativamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare. Utilizzo di GaussView. Fare clic qui per scaricare questo file.

Passaggi critici: conservazione dei comportamenti della fase della soluzione per l'esame tramite ESI-IM-MS
Devono essere utilizzate impostazioni strumentali ESI native che conservino la stoichiometria dei peptidi, lo stato di carica e la struttura conformazionale. Per le condizioni native, le condizioni nella sorgente ESI, come le tensioni del cono, le temperature e i flussi di gas, devono essere ottimizzate. Inoltre, le pressioni e le tensioni nella sorgente, nella trappola, nella mobilità degli ioni e nel trasferimento delle onde (in particolare la distorsione della trappola DC che controlla la tensione di iniezione nella cella IM) devono essere controllate per verificarne le influenze sulle distribuzioni dello stato di carica e della mobilità ionico.

Di seguito sono riportate le condizioni operative tipiche utilizzate in questo lavoro. I campioni acquosi di peptidi sono stati iniettati con una siringa dal naso smussato di 1,0 mL utilizzando una velocità di^flusso di 10 min, una tensione capillare di 2,0 kV per ioni positivi ( ) o 1,8 kV per ioni negativi (-), una sorgente di temperatura di 130 gradi centigradi, una desolvazione di 250 KV, un campionamento di 20 V e 4,0 V cono di estrazione. La sezione IM è stata azionata con una tensione di ingresso di 6,0 V alla cella di trappola con una pressione di argon di 2,25 x 10^mbar utilizzando una portata di 1,5 mL/min. La tensione per l'iniezione di ioni (trap DC bias) nella cella IM è stata impostata a 12 V per evitare la dissociazione degli ioni mentre inizialmente si scontravano con il gas tampone di azoto. La cella IM separava gli ioni in base alla loro sezione trasversale di carica e collisione e utilizzava una pressione dell'azoto di 0,52 mbar e una portata di 20,0 ml di^min. L'IM è stato utilizzato con rampe di 12,0–20,0 V (z) o 8,0–30,0 V ) di altezze delle onde viaggianti e ha aumentato 800–1.500 m s^{n. 1} (n) o 250–1.000 m di velocità da¹ a 1 per ogni spazzamento attraverso la cella dell'onda itatra iM. La cella di trasferimento è stata azionata con la stessa pressione dell'argon come la cella trappola e ha guidato gli ioni risolti IM verso l'analizzatore ortogonale di massa-to-charge. Gli spettri di massa ios mobilità sono stati acquisiti sincronizzando il rilascio gated di ioni nella cella IM con l'analizzatore di massa-carica del tempo di volo.

Utilizzando le condizioni ESI native, le proprietà della fase della soluzione, ad esempio lo stato di carica e lo stato conformazionale, vengono conservate durante le analisi IM-MS. Ad esempio, gli stati di carica di mb-OB3b e ambs osservati durante le analisi IM-MS^20,37 erano strettamente correlati agli stati di carica previsti nella fase di soluzione⁴⁰. Il peptide mb-OB3b è tetraprotico e forma solo ioni caricati negativamente durante l'analisi IM-MS⁴⁰, sia che Cu(I)-bound o Cu(I)-free, perché contiene il capolinea C (pKa < 1.7), due gruppi enethiol oxazolone (pKa 5.0 e 9,7) e il gruppo Tyr (pKa 11,0)⁴². Gli ambnellanellamente nella loro forma completamente protonata avranno un addebito complessivo di 2 dollari a causa del capolinea C (pKa 2), due Suoi (pKa 6,0), due Cys (pKa 8,3) e Tyr (pKa 11,0) siti^19,41. Pertanto, essi formano generalmente ioni caricati positivamente a un pH di <6 e ioni caricati negativamente a un pH di >6.

L'ambs ha anche mostrato un chiaro comportamento di associazione Cu(I/II) dipendente dal pH e un'attività di redox in cui Cu(I)-binding a un pH basso passato all'associazione Cu(II) a un pH superiore. Le reazioni di Cu(I/II) includevano la formazione delle specie ossidizzate (amb_{ox )}che contenevano legami disulfide e vari multimeri e rilegature multiple di Cu(I/II) (Figura 5 e Figura 6). Queste reazioni di redox dipendono dal tempo ed è stato dimostrato che più lungo è l'intervallo di tempo (fino a 210 min) tra la preparazione del campione e le analisi IM-MS, più prodotti ossidati sono stati osservati³⁷. Pertanto, è necessaria anche un'attenta considerazione della dipendenza dal tempo di reazione dall'osservazione dei prodotti.

Limitazioni: IM-MS e sezioni teoriche di collisione identificano quale tipo di coordinamento preferisce ogni io.
Per facilitare l'interpretazione dei dati IM-MS m/z e CCS, è stata condotta un'ampia ricerca utilizzando il livello di teoria B3LYP/LanL2D. I conformatori ottimizzati per la geometria con diversi siti di coordinamento sono stati confrontati tra l'energia libera prevista e l'accordo con il CCS misurato dalla modellazione molecolare di questi peptidi e dei loro complessi è limitato dal tipo di energia elettronica calcoli della struttura che possono essere applicati a questi sistemi relativamente grandi. Altri metodi che sono stati studiati o raccomandati includono il lavoro di Truhlar et al.⁴³, che ha scoperto che M05-2X era il miglior funzionale DFT e PM7 e MNDO/d erano buoni metodi semi-empirici NDDO per i composti contenenti⁴⁴. Questi peptidi hanno un ampio spazio conformazionale e un'indagine approfondita per individuare i conformatori di energia più bassi devono includere il confronto dei vari siti di chelazione del metallo, vari legami cis- e trans-peptidi, ponti di sale, legame di idrogeno, e z-cation l'interazione tra il gruppo aromatico di Tyr e la cation metallica.

Significato rispetto ai metodi esistenti: Cu(I/II) e altri rilegatura ioscosa metallica selezionata rispetto a mb-OB3b e ambs
La cristallografia a raggi X e la spettroscopia NMR sono le tecniche più comuni utilizzate per determinare la risoluzione atomica della struttura terziaria dei peptidi. Tuttavia, gli studi di cristallografia a raggi X di metallopeptidi sono scarsi a causa di problemi con la cristallizzazione di questi complessi⁴⁵. NMR inoltre non è adatto per l'interpretazione di un campione in cui sono presenti specie di oligopeptide individuali strettamente correlate⁴⁶. Pertanto, la modellazione molecolare IM-MS e DFT sono tecniche alternative per studiare le reazioni dei peptidi, in particolare quelle che derivano da complesse reazioni di legame redox e Cu(I/II)^{20,37,40, 47}. La forza di IM-MS è che può risolvere ciascuno dei prodotti e identificarne la composizione molecolare misurando contemporaneamente i loro m/z e i tempi di arrivo che si riferiscono alla stoichiometria, allo stato di protonazione e alla struttura conformazionale.

Ad esempio, l'mb-OB3b madicherà una varietà di ioni metallici e la sua selettività verso ogni ione è stata visualizzata dalle titrazioni degli ioni metallici IM-MS (Figura 7). I risultati hanno mostrato la preferenza mb-OB3b per il legame Cu(I) e Ag(I), confrontando al contempo i risultati a un pH di 7 con amb₇. La figura 8 mostra amb₇ chela preferibilmente n(II) e Ni(II). In generale, gli studi amb hanno mostrato che la sostituzione dei due enethiol-oxazolones con 2His-2Cys non escludeva l'associazione Cu(I/II), ma ha portato a un legame multiplo di Cu(I) tramite coordinamento lineare(Figura 3) in contrapposizione al Cu(I) mononucleare rilegatura del coordinamento tetraedro di mb-OB3b⁴⁸. La riduzione di Cu(II) è stata mediata anche dalla formazione di ponti per l'ossidazione e il dialfide in contrasto con l'attuale ponte disulfide in apo-mb-OB3b e l'elevato potenziale di riduzione dell'mb-OB3b caricato in rame, che supporta la forte preferenza per Cu(I)⁴⁹ .

Applicazioni future
Ulteriori studi IM-MS di amb peptidi sono in corso, in cui la loro sequenza primaria viene modificata sostituendo il His o Cys con Gly o Asp, mentre il residuo Tyr viene sostituito con Gly o Phe. Questi studi sono anche condotti in acetato di ammonio da 10,0 mM, con il pH modificato con idrossido di ammonio (per pH 7, 8 e 9) per mantenere costante la forza ionica totale per ogni campione. Questi risultati saranno pubblicati a breve.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo materiale si basa sul lavoro supportato dalla National Science Foundation nell'ambito del 1764436, dal supporto dello strumento NSF (MRI-0821247), dalla Welch Foundation (T-0014) e dalle risorse informatiche del Department of Energy (TX-W-20090427-0004-50) e delle comunicazioni l3 . Ringraziamo il gruppo Bower dell'Università della California - Santa Barbara per aver condiviso il programma Sigma e Ayobami Ilesanmi per aver dimostrato la tecnica nel video.