播種性カンジダ症のハチミツガWaxworm 感染症モデル

ハチミツガは播種性カンジダ症の無脊椎動物モデルとして機能します。ここで、感染は詳細プロトコルし、モデルの有効性のサポート データを提供します。

カンジダ菌は、皮膚、粘膜の表面や消化管を植民地化する人間の共通の真菌によってです。特定の条件下でカンジダも生命脅迫的全身感染症として、その関連する高死亡率の原因の調査の主要な焦点である粘膜感染症の衰弱の結果自然なニッチにはびこることができます。播種性感染症の動物モデルは、病気の進行を勉強してカンジダ病原性の特性を解剖します。これらのハチミツガwaxworm 感染モデルは全身の毒性の高スループットの調査のためコスト効果の高い実験的なツールを提供します。多く他の細菌と真核生物の感染エージェントは、広く受け入れられているモデル システムg. mellonella 、病原性を理解するために効果的に研究されている.まだ、 g. mellonellaに感染するために使用方法の変化は、表現型の結果を変更し、結果の解釈を複雑にできます。ここでは、利点と欠点の waxworm モデルを全身カンジダ発症機序を研究し、再現性を向上させる方法の詳細をまとめました。我々 の結果はg. mellonellaの死亡率を反応速度論の範囲を強調表示し、これらの速度を調節することができる変数を記述します。最終的には、このメソッドは、播種性カンジダ症モデルにおける病原性を研究する倫理的な迅速かつコスト効果の高い方法として立っています。

カンジダ種は日和見病原体として浮上することができる共通の人間によって深刻な免疫不全と dysbiotic 患者。多くのカンジダ種は、病気を引き起こすことができます、 c. アルビカンス播種性カンジダ症^1,2の最も一般的な原因です。C. アルビカンス以前制限ホスト壁のいずれかの直接浸透や施術部位と他³体の違反で導入を介して血流にアクセスするから全身疾患の結果します。カンジダは、粘い、バイオ フィルム形成、免疫細胞の脱税とエスケープ、および清掃⁴鉄を含むホスト内で全身の病気を引き起こす病原性プロセスの範囲を利用します。個々 の病原性のメカニズムを調査する生体外でのアプローチが存在しますが、動物モデルが病気結果^5,6の全体を調査するための最良の選択肢を提供し続けます。前の研究は有望な体外体内^7,8の再現に失敗した病原性の調査の多くのインスタンスを詳しく説明します。したがって、モデル動物病原性を評価する必要があります体内。ほとんどの疾患モデルは、自然共生⁹としてマウス システムを植民地化するC. albicans無力にもかかわらず人間の感染症のためのサロゲートとして機能するマウスに依存します。播種性カンジダ症の無脊椎動物モデル線虫線虫など、フルーツ ・ フライがショウジョウバエと waxwormハチミツガ、根本的な違いについての懸念基本的な生理学、曝露の経路とホストの体温、幅広く受け入れられている^10、11.を妨げています。

最近、 g. mellonella waxworm 感染モデルはモデル病原性細菌、真菌病原体^12,13,14の広い範囲に採用されています。このモデルの利点の比較的低コスト、増加のスループット、使いやすさでは、削減とマウスのモデルと比較して動物の善行に関する倫理的な問題です。研究者は、複数の変数、強い信頼区間より迅速な実験や動物のプロトコルのバイパスをテストする能力の増大につながります。G. mellonellaが臨床分離株^{11,15 全体バイオ フィルム形成、粘いと遺伝子制御に必要な遺伝子の摂動に続くc. アルビカンスの病原性を迅速に評価するためのプラットフォームとして提供しています ,16}。最近の研究は、抗真菌性の薬の活動とそれ以外に挑戦し、時間のかかる^{である生体内で設定の下の抵抗の薬物動態を評価するためにg. mellonellaを用いた調査を取り入れています。17,18}。G. mellonellaにおけるc. アルビカンスの病原性の研究が実験と異なる病原性表現型を作り出す研究グループ間の一貫性のないプロトコル内のバリエーションの伝えられる高レベルによって複雑になっているまだ、マウスおよび waxworms^{11,13,19,20,21}。ここでは、病原性の実験により, C. albicans感染症,増加再現性を標準化しマウスにおける病原性の前述の研究との整合性を示すG. mellonellaプロトコルをまとめましたモデル。

以前の研究は、嵌合タイプのような染色体 5 (MTL) 軌跡C. albicansが細胞の識別と合う酵母や他の子嚢菌の菌類の²²と同様の能力を調節することを示した。C. アルビカンス分離株の大半中央構造線 中央構造線とα 対立遺伝子(/αMTL)のそれぞれの 1 つをエンコードMTL遺伝子座でヘテロ接合体は、したがって滅菌^15,23,24. loh または突然変異の損失MTL対立遺伝子の一つの喪失はホモMTL、または滅菌 'ホワイト' 状態から表現型スイッチを受けることができる中央構造線α 系統につながる、有能な '不透明' 状態²⁵を交配します。前作はMTLヘテロ接合性消失また別の系統の背景²⁶で全身感染症マウスモデルにおける病原性の減少することを強調しています。ここでは、 g. mellonellaの病原性にMTLをヘテロ接合性の貢献を描写する遺伝的に類似の実験セットを使用して播種性カンジダ症のg. mellonellaモデルを詳しく説明します。MTLα 系統だった/α に中央構造線と中央構造線の調査結果と同様の細胞の両方に関してより少なく劇毒性、 c. アルビカンスの病原性をMTL構成に影響を紹介します。内マウス感染モデル²⁶。

記載されているすべてのメソッドは無脊椎動物のホストの使用に依存し、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の承認は必要ありません。

1ハチミツガWaxworm 幼虫。

1. 卸売業者とサプライヤー ホルモン、抗生物質、または幼虫に対する他の治療法を取り上げないでください、生きている標本は、出荷することができているから幼虫を注文します。
   1. 必ず同一の供給者から実験の過程ですべての幼虫を購入してください。気温 30 ° C を超える減少幼虫生存率夏季に幼虫をご注文の際は注意してください。
   2. 予想される航路全体の温度を監視し配送と配信をそれに応じて計画または環境条件への露出を最小限に抑えるため迅速な出荷を選択します。
2. 幼虫が到着したときは、実行可能な健全な幼虫は存在であることを確認する各コンテナーを確認します。健康的な幼虫は、移動、寝具の下に完全に冠水するだろうし、黒マークまたは変色体に沿ってを含むいくつかの幼虫とライト イエロー/タン着色を所有しています。
3. 周囲温度 (25 ° C) で換気空間で自分の容器に幼虫を保管します。幼虫の初期の状態に応じて彼らは 2 週間の使用可能性があります。

2. 文化ハチミツガ感染に備えて

注: 適切なラボの服装は、手袋、白衣、安全メガネなどのプロトコルのこの部分全体で着用すべき。

1. 酵母ペプトン デキスト ロース (YPD) 液体および寒天プレートを作る。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 70% エタノール溶液 × 1 を準備します。
2. 一晩中速および 30 ° C で回転ドラムの標準カルチャ チューブで新鮮な YPD 3 mL 注入するC. albicans系統を成長します。
3. 卓上遠心分離機で 5 分間 2,500 x g でセルを回しなさい。細胞ペレットを邪魔にならないように注意しながら上澄みを離れて注ぐ。
   1. 繰り返しピペッティングまたはボルテックスで 5 mL の 1x PBS で完全に細胞を再懸濁します。遠心分離とすべての培地の除去を確保するためにさらに 2 回 PBS のセルの巻き上げを繰り返します。
4. 最終的な洗浄後 1 mL の PBS で細胞を再懸濁し、微量遠心チューブにそれらを転送します。
5. 000、1: 100、1:1 を生成する PBS のシリアル希薄のセットを行うと 1: 100,000 希釈系列。
   注: 代替希釈目的のセル数に到達する必要があります。
   1. 診断を使用して、セル、1: 100 の縮尺希釈カウントします。ほとんどの場合、縮尺希釈C. albicans文化の適切なセルをカウントを提供します。
   2. 5 x 5 グリッドを中央でカウント 30 300 セル間を目指して、検定のグリッドの演算を使用して初期の文化内のセルの合計濃度を計算します。自動化された細胞カウンター可能性があります; の代わりとして使用します。しかし、細胞数は細胞の形態(サイズ、形状等)としてお勧めする光の密度を使用してその精度影響ことができます。
6. 測定セルのカウントを使用して、微量遠心チューブに 1x PBS で 2.5 x 10⁷セル/mL の新しい希釈を行います。この希釈は、各接種c.albicansとg. mellonellaのための基礎となります。各注入は、250,000 c.albicans細胞の伝染性の線量のこの菌の 10 μ L を必要があります。
7. 感染症で使用される各カルチャの YPD 寒天 100 コロニー形成単位 (CFUs) のための 1: 100,000 希薄の正しいボリュームをメッキすることによって伝染の線量の正確性を確認します。
8. 手順 2.7 からセルのカウント板をインキュベート 48 時間 (h) 30 ° C で、プレートあたりのコロニー数をカウントします。80 と 120 の植民地間接種で精度の許容範囲を構成します。

3. 感染症カンジダ文化ハチミツガの幼虫の

注: 適切なラボの服装は、手袋、白衣、安全メガネなどのプロトコルのこの部分全体で着用すべき。

1. 2 つの独立したマイクロ遠心チューブ用に 1 mL の 1x PBS の 100% エタノール 1 mL を追加します。エタノールと PBS は、感染症の注射針を洗浄する使用されます。
2. Waxworm の空の各独立した緊張に接種幼虫を収容する、100 × 15 mm 滅菌シャーレ、寝具の少量を広めます。寝具の追加制限死者の付着ペトリ皿表面にG. mellonella幼虫。
3. 26 G、10 μ L のシリンジを取って、3 回続けて 1x PBS の 10 μ L で 3 つの洗浄 70% のエタノールの 10 μ L を抹消で滅菌します。渦接種希釈C. albicansの文化の 10 μ L を取る。空気の注入は、死を促進し、下流の分析が複雑になります、注射器内の空気の泡がないことを確認します。
4. G. mellonella幼虫を保持しているコンテナーを開き、慎重に幼虫を明らかに指で寝具を裏返します。健康で、活発な動き、ライト イエロー/タンの色と幼虫の体に黒色の色素沈着の欠如によって識別される幼虫を選択します。これらの幼虫完全実験と同様のサイズの設定してください。
5. 単一の幼虫を拾うを押し軽くインデックス/中指と親指の間鉛筆のよう。足直面しているので、その背中の上に幼虫をロールバックします。指と親指の間のボディの完全な長さを保持で、幼虫をカールまたは注入を引き離すことができます。
   注: 必要な場合は、100% エタノールに浸した綿棒を使用して注入のサイトを滅菌します。
6. 針の傾斜面が上を向くので注射器を回転させ、体内最後尾左脚との接合部に面取りの長さを含む針の先端をゆっくりと挿入します。針が体を貫く幼虫内側のボディを単に押していないことを確認します。力を使わないと針がすぐに幼虫を貫通完全に体に浸透します。針で軽く持ち上げると、適切な浸透を確認します。完全 10 μ Lカンジダ菌を注入して針を抽出します。
7. ステップ 3.3 3.5 各幼虫に対して繰り返します。細胞沈降、渦のカンジダを防ぐためにすべての 3 番目の注入後接種培養します。コントロールとして 10 μ L の 1 × PBS とg. mellonellaのセットを挿入します。
8. 共同住宅 10 幼虫接種各 100 × 15 mm のペトリ皿に同じカンジダ文化から注入します。8 日間、死を監視するすべての 24 h の幼虫をチェック 37 ° C で幼虫を孵化させなさい。
   1. 最初暗い色素沈着、黒くまたは体の形成によって死亡率を評価し、運動の不足。死亡を確認するには、彼らの背中に瀕死の幼虫をゆっくりと転がして、ピンセットで幼虫の底面を軽く突くピンセットを使用します。死と非応答体や脚に見える動きの欠如によって観測されたを獲得し、ペトリ皿から幼虫が削除されます。
9. 時間かけて幼虫死亡率を記録します。蛾に蛹化し始める幼虫は解析に含めることができるが、彼らが脱皮を開始する場合に削除する必要があります。Pupating の幼虫は、幼虫や蛹の病原性の違いが明確ではない、終了点解析から検閲されることが。
10. マントルピース コックス検定を使用して統計的有意性を評価します。

C. アルビカンスを用いた感染症の播種性カンジダ症モデルを提案するG. mellonella waxworms の使用のための再現可能な方法を示します。適切な保管、保守、および感染幼虫の選択は、 G. mellonella死亡率 (図 1A) の再現性を保証する重要なコンポーネントです。アクティブで健康的な幼虫ライト イエロー/タンの色、このシステムとは、通常感染の可能な体に不足黒パッチを使用する次の到着まで 2 週間。G. mellonella生理学の潜在的交絡効果を最小限に抑えるために幼虫は、同様のサイズと重量の選ばれました。十分に混合された接種と幼虫の体の同じ解剖学的サイトで一貫性のある注入はまた実験間の再現性を促進する上で重要な変数として立っています。画像は、実験 (図 1B) の期間を通じて感染した幼虫のメンテナンスを紹介します。

病原性の幼虫時代の影響を評価するために独立した PBS 制御感染を行った幼虫到着後ゼロまたは 10 日。これらのグループ (図 2A) 間g. mellonella死の動態に有意差はなかった。病気の特徴的な兆候が感染症に屈して両方のグループから生まれた幼虫幼虫のもともとイエロー/日焼け着色変色になったし、運動し、最終的に、死 (図 2B) の総損失の前に黒いパッチへの道を与えた。C. アルビカンスの感染変色と罹患率のこのプロセスを高速化が、大幅に感染幼虫や幼虫 PBS 注入 (図 2C) に比べて死に至る表現型マーカーのカスケードは変わりません。

感染用量も大幅G. mellonella感染症の死亡率の速度に影響を与えます。C. アルビカンス菌サイズの効果を評価するために 4 つの異なる臨床分離株とg. mellonellaを感染 (12 C、P60002、P75010、および SC5314:表 1) 3 つの異なる投与量で。SC5314 に感染幼虫は、この分離実験 (図 2D) 内で使用される他のほとんどの相対的な増加に対する病原性と一貫性のある全ての用量で死亡率を表示しました。多くの幼虫は 1.0 x 1.0 x 10 の⁴セルと比較して 10 の⁵ SC5314 または 12 C 細胞で感染に屈した。1.0 x 10 の⁶セルの最高用量でより少なく劇毒性の分離、P60002 および 12 C を含むすべての菌株の感染死亡幼虫過度に致命的な証明P75010 と SC5314 注入幼虫は 24 h より穏健な伝染性の線量は病原性の差異を決定する適切な内感染に屈した。その結果、2.5 x 10 の⁵の伝染性の線量は、すべての後の実験に使われました。

毒性マウスと全身性疾患のg. mellonellaモデルとの間の類似性を示すため、我々 はいずれかのエンコーディング SC5314 由来c. アルビカンス菌の病原性を試金されるヘテロ接合体 (、/α またはホモ (、/-またはΑ/-) MTLの軌跡。SC5314 またはその, 誘導体 BWP17 の遺伝的背景からMTLのヘテロ接合体とg. mellonellaの感染は作り出した PBS を注入した動物と比較して死亡率が高いです。制御幼虫の 4 分の 3 の損失と比較して 8 日目に生き残った 8 dpi (図 3A, 3 b) が増し、感染症 (dpi) を投稿 3 日以内のすべての注入C. albicans動物の半分以上。BWP17 感染湿らせたこのモデルでc. アルビカンス致死 (SC5314 の 4% の生存率と比較して 27% 生存 8 dpi でMTLのヘテロ接合体図 3C、3 D)。G. mellonella幼虫MTLα/株大幅に長く生き残った感染に比べてMTLヘテロ接合体の親系統 (ログランク検定、SC5314; p = 0.0006、BWP17; p = 0.0002)。興味深いことに、 MTL/C. albicansの細胞病原性はそのMTLのヘテロ接合体相手 SC5314 と BWP17 の両方の背景を一致します。したがって、 MTL構成は、 MTLα/- 株MTL/αやMTL/-細胞に比べて減少の殺害を表示するc. アルビカンスの病原性に影響を及ぼすをが。

図 1.感染手順の概要です。(A)フローチャートは、順序と幼虫、感染文化準備、および注入のストレージなどを含む感染症のプロシージャの重要な要素を強調表示します。(B)代表的な画像表示正常な貯蔵条件、感染感染幼虫、噴射、空間メンテナンスの準備。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2.G. mellonella感染対策の効果。(A) PBS コントロールは、すぐに到着 (青、PBS D0) または 10 日 (赤 PBS D10) 後に感染していた。(B)代表的な画像強調幼虫変色と死。(C)感染症板の画像シリーズ PBS (中央) と噴射の効果の詳細や SC5314 (下) と感染していない幼虫 (top) 日 1、3、5、および 7 次の注射に比べています。(D)臨床分離株のコレクション内で用量効果が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3.MTL対立遺伝子促進g. mellonellaのc. アルビカンス殺害。MTL軌跡ヘテロ接合体(/α)とホモ接合体 (、/- α/-) (A)と BWP17 (C)誘導体が 8 日間幼虫死亡率のプロット SC5314。信頼区間が各 SC5314 のプロット(B)と BWP17 (D)誘導体ひずみ実験で幼虫の死亡率の速度の一貫性を強調します。平均 (実線) は (空間で満ちている) 標準偏差 10 幼虫の 3 つの生物学的複製のプロットされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1.C. アルビカンス s本研究で使用される電車。

表 2。考慮事項について G. mellonella 感染。

G. mellonella waxworm モデルは、 c. アルビカンスの病原性の迅速かつ再現性の高い分析のための効果的なツールとして立っています。この詳細なプロトコルは、幼虫のバッチ間で同じサイトに定義されている伝染性の線量の一貫性のある配信に依存します。伝染性の線量は、初期の到着と受領日から 10 日間幼虫の使用生産同様の結果に対しG. mellonellaの死亡率に深い衝撃を持ってください。C. albicansMTL対立遺伝子の損失は、 MTLα 遺伝子の中断に幼虫の死は影響しなかったが減らされた毒性マウスの前の実験で一貫しての結果します。

G. mellonella感染症の結果は、実験的なデザインによって著しく影響を受けます。感染症の脊椎動物モデルと対照をなして注射部位や接種量、接種量の小さな変化は可能性がありますデータの解釈に影響を与えます。C. アルビカンス細胞数の増加と感染症は、感染した幼虫の大きいより迅速な罹患率につながった。特定の時点で、毒素性ショックを介して可能性がありますホストの急速な死に至るホストの防御を圧倒的なことができる表示されます多すぎるc.albicansを注入します。ただし、SC5314 は一貫して 12 C 続く全ての用量で最も悪性のひずみし、他の系統であります。したがって、感染パラメーターは、感染症の絶対反応速度論に大きな影響を持つが、まだ相対的な毒性の推定値があります。これらの実験の内で前の仕事はさらに、カンジダ細胞を徹底的に洗浄の重要性を示した。大幅注入食塊に含まれている残留 YPD 幼虫生存率 (データは示されていない) が減少します。

G. mellonella実験を行うとき、ワーム健康は重要な変数です。幼虫は頻繁に夏の真ん中に標準出荷を使用して転送到着途中で高齢者や、ストレス、生存率の低下と黒のパッチで覆われています。罹患率で幼虫のサイズの重要な役割は以前観察されていないが、ほぼ同じ質量の幼虫の試金に焦点を当てた実験をここで説明。健康的な幼虫と PBS の制御の幼虫は幼虫生存率別の日に行った生物の複製の間ですべての変更を考慮する感染症グループと一緒に常に実行する必要があります。G. mellonellaは感染幼虫受領後直ちに感染の動態を一致した到着後 10 日間です。したがって、幼虫の単一の郵送物は、十分な材料と完全実験を行うための時間を提供できます。これらの実験はマウスモデル、観察の結果^11,27の強い信頼の結果で通常利用されているよりもはるかに大きな動物は、病原性の差異を決定するひずみあたり 30 動物に依存^,28. このモデルも倫理的な問題、時間、および感染症の脊椎動物モデルと比較してコストを削減します。したがって、ワックス幼虫の使用は他のシステムで使用可能な全身性の毒性に及ぼす影響小さいの同定を促進するかもしれない。

宿主-病原体相互作用の研究にその有用性を制限するG. mellonellaシステムに固有の注意事項が存在します。まず、 G. mellonellaは適応免疫系を欠いているし、抗原性または高等真核生物²⁹のように免疫記憶を調査する使用ことはできません。幼虫の体は、体液でいっぱい連続押出し成るシグナリング分子、免疫細胞や抗菌ペプチド、栄養素を循環させる機能を。これらの免疫細胞、血液細胞、好中球と同様、したがって貪食、酸化のバーストを生成、次の細胞病原体認識受容体³⁰を介して活性化細胞壁溶解酵素を分泌します。しかし、この関数はすべての白血球の活動を完全に反映していない脊索動物システム内の生得の免疫細胞のプロセスのサブセットです。もう一つの主要な警告ゲノムは最近シーケンスされた³¹ g. mellonellaのゲノムのアセンブリの欠乏であります。その結果、種内遺伝的多様性の程度は知られている、可能性がありますほとんどの製造者出荷実験の死亡率の影響を与えることができる遺伝的に異質の集団。さらに、分子技術有機体のために存在していないホストへの病態を分析しようが複雑になります。まだ、一貫性のある病原性結果C. albicans感染実験で、ベンダー、時間、および演習をサポートしています彼らのユーティリティ病原性の基本的な質問で。

中央構造線の損失は、 C. albicansのMTLのヘテロ接合体とMTLα ホモ接合体背景に対する病原性を低減しました。この傾向は、全身毒性²⁶のマウスモデルを使用して事前作業と一致。マウス モデルと対照をなしてMTLα の損失にMTL/α 親株に対する病原性は影響しなかった。これらの結果の間に不一致は明確ではないが、適応免疫の無脊髄生物で不足しているコンポーネントを含めることができます。また、 MTLヘテロ接合性に関連付けられている増加病原性は複数のひずみ背景全体評価の必要性を増強、SC5314 のMTLα 遺伝子にのみ起因するかもしれない。したがって、私達は病原性 2 つのMTL対立遺伝子間の微分の役割を提案します。

全体的にみて、 g. mellonellaモデルは、全身性カンジダ症を評価するための迅速かつ再現性の高いモデルとして機能します。病原性の他のリードアウトは、このモデルでコロニー形成単位 (CFUs)¹¹またはまた真菌ローカリゼーション³²を提供する生物発光の幼虫を磨砕液をメッキすることによって菌の有病率を含む試金することができます。このモデルを展開して、新しく創発の高い薬剤耐性など他のカンジダ種の病原性特性評価と将来的にカンジダ オーリス種³³。G. mellonella 、カンジダに感染するとやり取りする内リンパ球を視覚化するツールを介して、感染症の結果との感染の過程の可視化の変動を減らすために近交系 waxworm の血統の継続的な開発レポーターカンジダ行³⁴はさらに病気のこのモデルを調整したり、体内のより深い調査の宿主-病原体相互作用を許可します。

著者が明らかに何もありません。

著者は、本研究で使用するためのハチミツガの取得でパメラ ワシントンとリア ・ アンダーソンの支援を認めると思います。