マウスの皮膚腫瘍からリンパ管を介して白血球出口の定量化

ここでは、我々 は生体内の白血球、炎症、ナイーブから出口の定量化とマウス皮膚の悪性の方法を示します。我々 は 2 つのモデルの比較を実行: 経皮 FITC アプリケーションとその場で光電。さらに、光電性皮膚腫瘍から白血球出口を追跡するためのユーティリティを紹介します。

末梢組織から排出リンパ節の白血球出口免疫監視の開始に重要ではありませんが、末梢組織の応答の解像度にも貢献しています。非リンパ系、末梢組織から白血球出口を定量化するためには、さまざまなメソッドを使用、文脈依存の出力を制御する細胞・分子メカニズムままかり。ここでは、マウスの皮膚腫瘍から白血球出口の定量分析のための in situ光電の使用について述べる。光電直接ラベル白血球の皮膚組織内で常駐が可能です。紫外光に肌の露出を引き起こすローカルも炎症反応によって特徴付けられる白血球浸潤と血管の水漏れしたため、蛍光トレーサーの経皮吸収型アプリケーションとの比較で光電具体的渡り鳥の樹状細胞集団をラベルし、皮膚微小と腫瘍から骨髄性とリンパの出口の定量化を同時に有効になっています。腫瘍内白血球複雑さの私達の理解の不足しているコンポーネントのまま白血球出口のメカニズムと免疫微小両方記載ツールのアプリケーションが腫瘍のダイナミクスにユニークな洞察を提供するため定常状態と治療への反応で。

末梢組織の免疫反応は炎症のサイトに白血球動員だけでなく、後続の維持を調節するメカニズムによっても形成されます。したがって、防御免疫は、内で、滞在がリンパ管を介して末梢組織から移行というか白血球を入力すると、かどうかを決定する累積的な細胞および分子メカニズムによって決まります。重要なは、出口 (出口と呼ばれる) リンパ管を介して組織への白血球のための傾向は、その特殊な機能にリンクされます。樹状細胞 (DC) は、抗原輸送と排水のリンパ節 (dLN)、適応免疫¹に必要なプロセスのプレゼンテーションにつながる成熟信号への応答での回遊行動を取得します。マクロファージや好中球などの清掃の骨髄細胞は貪食によりアポトーシス破片をオフになります。細菌感染時に好中球が組織を離脱、最終的に dLNs²で、DSS 誘発大腸炎モデルにおけるアポトーシスを受ける、データはマクロファージ出口局所炎症³を解決する必要がある仮説をサポートします。好中球とマクロファージの出口が炎症性のすべてのコンテキストで発生するかどうかも不明です。定常状態^4,5,6、7、感染⁸、および炎症を起こして^4,9,10、から T リンパ球の出口のための証拠^11,12周辺機器、非リンパ系組織が、この出口を駆動する組織に基づく信号のままかり、T 細胞が積極的に循環させるを示します。いくつかの研究を特定 21 (CCL21) とその受容体 CCR7^{4,11、ケモカイン (C C モチーフ) 配位子を含む出力の信号に向かってリンパ毛細血管を排出方向の移行に必要なその後 13}ケモカイン (モチーフ C X) 12 (cxcl 12) リガンドとその受容体 CXCR4^2,14、そしてスフィンゴシン-1-リン酸 (S1P)^10,,1516。しかし、これらのメカニズムはすべてのコンテキストでアクティブではない、未解決の問題が残っているかどうか、彼らはすべてのセル型の出力を決定します。重要なは、さらには、出口と疾患における関連性機能を制御するメカニズムに洞察力は体内の定量的分析の方法する必要があります。

複数モデル動物体内のリンパ管の直接カニューレ装着前のヴィヴォ標識白血球、蛍光トレーサーの経皮吸収型アプリケーションの養子の転送を含む出口を定量化するいくつかの方法が使用されています。ラベル付けされた粒子と生体内で光電^17,18の注入。マウスの求心性リンパ管の直接穿刺が難しい、収集することができます流体のボリュームで小動物に限られました。大型の動物でカニュレーションが大きく行われてしたがって、(e.g。、羊) このような手術操作、実用的。これらの研究は、リンパ性と骨髄性リンパ^10,19,20細胞の存在の直接的な証拠を提供します。さらに、羊のモデルは、急性および慢性の炎症がほぼ 100 の^10、21でリンパでリンパ球の存在を増加することを明らかにします。

ラベルおよび遺伝子を組み換えられたリンパ球の養子の転送は CCR7 は CD4 の出口に必要な重要なは明らかに⁺ T 細胞急性炎症を起こした皮膚^5,11, リンパ球の前処理中から小分子 S1P 受容体アゴニスト、FTY720、部分的にしか、出口¹⁰を抑制します。興味深いことに、慢性的な炎症を起こした皮膚から転送されたリンパ球の出口は CCR7 独立¹⁰が、部分的に CXCR4⁹を必要があります。養子転送実験、ただし、提供ex vivoの非生理的番号活性およびラベル付けされたリンパ球挿入により、組織と間質性流体圧力の生体力学的環境を変える組織に初期リンパ毛細血管を開き、トランスポート プロパティ²²を変更します。かに (FITC) 皮膚刺激の有無での代替、経皮吸収型アプリケーションとして (e.g、フタル酸ジブチル、DBP) または感染^23,24の追跡が可能になります。トレーサーを蓄積し、dLNs に移行する貪食細胞。同様に、蛍光に分類された腫瘍は腫瘍材料²⁵を飲み込んでいる貪食細胞を追跡する手段を提供します。これらのメソッドは、DC の出口^13,14,17,26,の²⁷を支配するが、非貪食を追跡することができるメカニズムの重要な洞察を提供しています。リンパ球と、解釈可溶性 FITC 非渡り鳥、こうしてラベリング LN バイオハザード Dc のリンパ排液無料によって複雑になることができます。

また、生体顕微鏡観察は、リアルタイム^28,29生理関連の白血球ポピュレーションの生体内での追跡のためにできる強力なツールです。顕微鏡は空間の複合体を明らかにした生体レポーター マウスと体内に抗体を用いた免疫蛍光ラベリングと組み合わせて使用し、ダイナミクスの免疫細胞人身売買などの間質性の移行³⁰、リンパ内皮、内リンパ腔と LN エントリ^28,31に移行通路輪廻。生体イメージング技術の広範な採用経費、設定のための必要な専門知識によって制限され、種類の細胞を定量化のスループットを制限します。まだ、人口動態を分析定量メソッドを結合組織生体イメージング洞察を提供する追加と重要な機構運動とリンパ毛細血管内の移行のメカニズムに関して^18,31,32。

その結果、生体内で光電として浮上しているメソッドをその場でラベルは、貪食活性の生理的白血球出口 (フローサイトメトリーによる結合) 時での定量化のために独立した、チャレンジの有無。楓 Tg マウスは恒常不可逆的赤い蛍光性 (楓赤)³³に変換した後、紫の光にさらされるまで、蛍光グリーン (緑楓) を表わす石サンゴから分離した蛋白質を表現します。Photoconverted 細胞は末梢組織サイトから離脱する彼らを追跡できる、dLNs の蓄積します。これとその他似たような蛍光マウス モデル^34,35肌³⁶から制御性 T 細胞の構成の出口、パイエル板の^{37 から CXCR4 依存性 B 細胞の出口を含む重要な生物学を明らかにしました。}、ペプチド再チャレンジ³⁸、および広範な白血球腫瘍微小³⁹から出口に常駐メモリー T 細胞の動員。ここで、皮膚の炎症や感染症蛍光法による既存データの直接比較を可能にするためのコンテキストで経皮 FITC アプリケーションと光電の比較を実行します。さらに、我々 は移植腫瘍における光電を示し、変換効率および腫瘍微小から選択的避難説明。など、私たちは腫瘍、腫瘍内白血球複雑さ、抗腫瘍免疫の解釈にとって重要な意義があるから白血球出口の重要な生物学の解明に更にこれらのメソッドのアプリケーションを必要と主張して療法への応答。

動物のすべてのプロトコルは、機関動物ケアとオレゴン健康及び科学大学で利用委員会によって承認されています。

1. 炎症とマウス耳介の FITC 絵画の誘導

1. 層流フードの麻酔気化した isofluorane を用いた c57bl/6 マウス (3-5 %isofluorane で誘導し、1-3 %isofluorane; 維持酸素流量 0.5 〜 1.0 L/分)。ペダル反射の損失を監視することによって適切な anesthetization を確保する不随意運動と呼吸数の減少。
2. 上を向いて耳の腹側をフラット耳を置きます。ピペット 20 μ L 5 %fitc 溶液の溶解フタル酸 1:1 アセトン: ジブチル (DBP) 耳介の腹側へ。数秒間乾燥する耳を許可します。
3. FITC 塗布後 24 時間は、頚部転位続いて二酸化炭素暴露を介してマウスを安楽死させます。PBS に耳の耳介を収集するには、はさみを使って頭から耳を分離します。LNs を周囲の組織から分離するピンセットを使用して PBS に頸部 dLNs と鼠径非排水 LNs を収集します。鼠径部の非排水 LNs は、FITC⁺/Kaede 赤⁺白血球の存在に否定的なコントロールとして機能します。組織のプロトコルごとの死体を処分します。
   注: セルの種類および知られている移住性の動作の分析のための最適な時間ポスト光電によって異なります。たとえば、樹状細胞は、6 h ポスト DBP アプリケーションとして、早く dLNs に検出できます。

2. マウス耳介の炎症の誘導

1. 層流フードのケタミン 80 mg/kg および 10 mg/kg キシラジン生理食塩水に溶解した腹腔内投与によって楓 Tg マウス (背景 C57Bl/6) を麻酔します。手順 1.1 で説明されているように、適切な anesthetization を確認します。
2. 上を向いて耳の腹側をフラット耳を置きます。ピペット 20 μ L 1:1 アセトン: DBP、耳介の腹側への。数秒間乾燥する耳を許可します。
3. DBP アプリケーション後アルミ箔の部分にスリットを切り、紫外線光源に耳を公開するスリットを介して耳を引き出します。耳が上向きに両面テープを使用して箔に耳を保護する背側で平ら。
4. 3 分で 100 mw 405 nm 光源を使用して光源、および photoconvert の下で直接耳を配置します。
5. 光電後、24 h 楓 Tg マウスを安楽死させるし、手順 1.3 で説明したように耳耳介、頸の LNs と鼠径 LNs を収穫します。
   注: 手順 1.3 で引用される考慮事項に加えて増殖率決定分析のタイミング楓赤の損失が急速に細胞分裂で発生するとします。

3. ワクシニア感染マウス耳介の FITC

1. 手順 1.1 で説明されているように気化した isofluorane と c57bl/6 マウスを麻酔します。
2. 耳の腹側を平らに横たわっていた。ピペット 5 x 10⁶プラーク形成単位 (PFU) ワクシニア ウイルス (VacV) の耳の耳介に 10 μ L の PBS で希釈しました。29 ゲージ針を使用して、25 回⁴⁰耳介を突きます。
3. 24 h 後感染手順 1.1 およびピペット 20 μ L 5% 耳の耳介の腹側にアセトンに溶解した FITC で説明されているように isofluorane と VacV に感染したマウスを麻酔します。数秒間乾燥する耳を許可します。
4. FITC 塗布後 24 時間はマウスを安楽死させるし、手順 1.3 で説明するように耳の耳介、頸部 LNs と鼠径 LNs を収集します。
   注: FITC DC さまざまな 24 h 間隔で人身売買を決定する任意の時間ポイント記事感染症に適用できます。我々 は、dLNs に DC 移行が日 1 に 3 記事感染⁴¹から同じようなレベルで維持されることを報告しました。

4. ワクシニア マウス耳介と光電の感染症。

1. 手順 1.1 で説明されているように気化した isofluorane と楓 Tg マウスを麻酔します。
2. ステップ 3.2 で説明されているように VacV と耳介を感染させます。
3. 24 h 後の感染症は、楓の VacV 感染マウス ステップ 2.1 で説明されるように麻酔し、2.3 2.4 の手順で説明するよう光電を実行します。
4. 光電後、24 h はマウスを安楽死させるし、手順 1.3 で説明したように耳耳介、頸の LNs と鼠径 LNs を収穫します。
   注: 手順 3.4 で上記のよう光電は任意の時間ポイントのポスト感染で管理できます。

5. 耳とリンパ節のフローサイトメトリー用処理

1. 耳の耳介の単一細胞懸濁液を作成: 離れて 1 mg/mL コラゲナーゼ D と 80 U/mL DNase の希釈を含む 24 ウェル プレートのウェルに下に向けて耳の内側でピンセットと場所の 2 つのペアを使用して耳の耳介の腹側と背側の皮をむく ハンクの緩衝生理食塩水ソリューション (HBSS) (Ca^{2 +}と Mg^{2 +}を含む)。70 μ m ナイロン携帯こし器を通って 30 分押して消化組織の 37 ° C で孵化させなさい。
2. LNs から単一細胞懸濁液を作成: 1 mg/mL コラゲナーゼ D と 80 U/mL DNase HBSS で希釈を含む 24 ウェル プレートの井戸の LNs を配置。リンパ節 2 つ 29 ゲージ針を使用してカプセルし、リンパ節の 37 ° C で 30 分間インキュベーションしていじめるオープンは、70 μ m ナイロン携帯こし器を通って消化組織を押します。

6. 皮内黒色腫腫瘍移植と光電。

1. 電気かみそりを使用して楓 Tg マウスの背中の中心から毛を剃る。
2. 29 ゲージ針を左と右の肩甲骨の間の背中の中央に位置し、掻き楓 Tg マウスの皮膚に 5 × 10⁵腫瘍細胞 (50 μ L の生理食塩水で希釈) を注入します。腫瘍は、指定されたリンパ節 (すなわち、左と右の上腕腫瘍 LNs は背中の上部中央に配置) にリンパドレナージュをように慎重に位置する必要があります。これにより、皮膚の腫瘍を LNs の直接光電、dLN 上腫瘍を配置しないでください。
3. 希望サイズ (100-650 mm³) に成長する腫瘍を許可します。
4. 組織採取前 1 日楓 Tg マウスを麻酔は、2.1 で説明されると、腫瘍周辺新しく再成長毛を剃る。
5. アルミ箔に穴をあけるし、光源に腫瘍を公開する腫瘍を通りぬけた。腫瘍が穴を通って戻って落ちるを防ぐために腫瘍よりわずかに小さい穴を開けるし、隣接する、非腫瘍性の皮膚の変換を最小限に抑えます。
6. 5 分で 200 mw 405 nm 光源を使用して photoconvert と光源直下の腫瘍を位置します。
7. 光電後、24 h は、手順 1.3 で説明するように、マウスを安楽死させます。PBS に腫瘍、上腕の dLNs と鼠径非排水 LNs を収集します。はさみを使用して周囲の皮膚から腫瘍を切り取って手順 1.3 で説明したように、LNs を削除します。

7. 腫瘍とリンパ節のフローサイトメトリー用処理

1. 腫瘍から単一細胞懸濁液を作成: 1 mg/mL コラゲナーゼ D と 80 U/mL DNase HBSS で希釈を含む 24 ウェル プレートのウェルにハサミで腫瘍をミンチします。70 μ m ナイロン ストレーナー 1 h. プレス消化組織の 37 ° C で孵化させなさい。
2. ステップ 5.2 で説明されているようにリンパ節の単一細胞懸濁液を作成します。

8. フローサイトメトリー用染色抗体

1. 単一細胞懸濁液に組織を消化した後、興味のマーカーとセルにラベルを付ける標準流れ cytometry 染色法を実行します。96 ウェル プレートに、⁶セルを簡単に言えば、ピペット 2 x 10 です。Fc ブロック (1 μ g/mL) 氷; 上で 20 分間サンプルをインキュベートします。FACs バッファー (1% ウシ血清アルブミンの PBS) で 2 回洗浄します。ライブ/死者の汚れ (PBS で希釈) をサンプルに追加し、氷; 15 分間インキュベートFACs バッファーで 2 回洗浄します。氷; 上で 30 分間 FACs バッファーで希釈した一次抗体 (材料表) と孵化します。FACs バッファーで 2 回洗浄します。
   注: 緑楓と楓; FITC と PE fluorophores が付いて赤い蛍光性が重なっています。したがって、FITC や PE 標識抗体楓蛋白質との組み合わせでは使用できません。
2. 汚損の後流れの cytometer でサンプルを実行します。また、2% のセルを修復する PFA。

9. フローサイトメトリー解析

1. 範囲全体の 70-80% に FITC (緑楓) と PE (楓赤) チャネル PMT 電圧を設定 (人口約 10 のセンター⁴) 楓グリーン前のヴィヴォまたは楓赤単色脾細胞や血液を使用します。
   注: は、広がる大きい信号になるので楓の緑 (FITC) 楓赤 (PE) チャンネルの賠償しません。
   1. 単色楓コントロールを作成するには、楓 Tg マウスから脾臓や血液を収集します。ACK バッファーが付いて赤い血液細胞を溶解し、セルを 2 つのグループに分割: 楓の緑と変換後の楓赤をダブルクォートします。
   2. 単一色の楓赤コントロール中断 1 mL の PBS のセルと 100 の力で 405 nm 光源を使用して 5 分 24 ウェル プレートで photoconvert mW。これらの細胞を使用して楓楓緑 (FITC) を設定する流れの cytometer (ステップ 9.1) の赤の PMT 電圧。
2. 楓蛋白質のため電圧を設定すると、単一分子蛍光ラベルの製造元の指示に従って補償ビーズを使用して他のすべての一次抗体の汚れを補正します。
3. データを収集するために流れの cytometer でサンプルを実行します。
   注: 楓蛋白質は細胞によって生産されて継続的に。つまり、24 h、光電変換されたセル楓緑の二重肯定的なとが楓新生楓 (緑) として赤いタンパク質は細胞内蓄積してきた。
4. FlowJo ソフトウェアまたは類似のソフトウェアを使用してデータを分析します。

我々 はまず効率を評価し、マウス皮膚に関連付けられている炎症を決定する文献で公表された光電結果を複製しようと思う。耳の耳介は、100 mW の青紫の光にさらされた (405 nm) 3 分で³³が前述の。単一の細胞懸濁液すべて CD45 の 78% の変換効率を明らかに露出の後すぐに、耳の皮膚や子宮頸 dLNs から生成された⁺ dLNs (図 1 a) にみられたない変換されたセルで皮膚の白血球。CD45 の浸潤の数を数値化光電に関連付けられている炎症反応を評価する⁺変換された耳 0 と 24 h で白血球ポスト変換 (図 1 b) と急性変化血管透過性の測定としてマイルのアッセイ⁴² (図 1)。簡単に言えば、エバンス ブルーが、巡って 0.5 %200 μ L は、光電後 2 h を注入しました。耳は、注射し、エバンス ブルーでホルムアミド 55 ° C (610 nm⁴²を読む吸光度) で 24 時間抽出した後、30 分を収集しました。両方 CD45⁺ (24 h) の浸潤し、血管漏出 (2 h) が次の光電、この短い露出でも光電自体が衝撃が組織特異炎症性応答を示す有意に増加します。CD45 比較⁺ (図 1 b) の浸潤し、血管漏出 (± 0.75 μ g/耳 1.4) VacV 感染耳 24 h ポスト感染⁴¹紫光 (0.08 μ g/耳 ± 0.01) による炎症の範囲のコンテキストを提供します。

非リンパ系、末梢組織から白血球出口を追跡するため、様々 な研究でいくつかのモデルが使用されている間は不明だ彼らは皮膚を終了、特定の集団を追跡する能力でこれらのメソッドがどのように比較するのか。その結果、我々 は、LNs に DC 出力を追跡する 2 つの一般的に使用されるメソッドの直接頭に頭の比較を実行することを決めた FITC、塗料及び生体内での光電効率と各法の特異性を評価するために定量的な皮膚の炎症、感染した皮膚から定常状態で DC 出力の分析。各解析の皮膚が皮 FITC のアプリケーションを受けるまたは 3 分 LN DC 集団は、CD3ε として定義されたために、100 mW 405 nm の光にさらされている^-CD19^-MHCII⁺CD11c⁺ 1 にさらに成層) MHCII^{こんにちは}CD11c^int Dc、渡り鳥の Dc (Mdc) の両方 CD103 を潤す⁺ batf 3 依存、Dc と CD11b クロス提示⁺真皮 Dc;・ 2) MHCII^intCD11c^{こんにちは}、Dc CD8α を含む居住者 dc (rDCs) を潤す⁺ batf 3 依存クロス提示 Dc (図 2 a)。FITC アプリケーションまたは光電後 24 h 標識細胞が流出で簡単に検出がない非排水 LNs (図 2 b)。LNs に DC 移行の程度を定量化し同時に移行する集団と常駐しない LN 集団ラベリング法の特異性を決定するラベルの付いた Mdc と定常状態、DBP は, 投与 24 h で Rdc を数値化48 h VacV 乱切 (図 2)。光電 (楓) と FITC 標識すべての条件で Mdc 中、VacV 感染症の 2 つのメソッドが同様の出口のレベルを定量化を除いて dLNs の Mdc の楓ラベルよりもより FITC 標識を見ました。さらに、DBP のコンテキストで FITC さらに rDC 集団光電残った Mdc (図 2) に固有のラベル。これらのメソッドの両方を使用して、見ました VacV から約 200 Dc の出口感染皮膚トイレらによって経皮 FITC アプリケーションを使用して以前に発行した調査結果をこのレベルの出口に繰り返す重要な指摘⁴¹したがって、炎症性のコンテキストに応じて経皮的 FITC アプリケーション可能性があります dLNs と非特異的光電中の非移動性の LN バイオハザード DC 集団のラベリングの結果で検出されたラベル付きの Dc の数の増加。mDC 人口に陥る DCs を明確に識別します。

^5,33,43と皮膚、粘膜、^5、、^6,35,38から出口で白血球保持を定量化する楓 Tg マウスが使用されているとリンパ系組織は、定常状態下と条件を炎症し、腫瘍腫瘍がマウスの耳に小さなボリューム³⁹photoconverted 皮内移植された 1 つのパブリケーションだけに適用されます。したがって、我々 は生体内で光電さらに免疫学的仮説検定を有効に確立された、大規模な原発腫瘍から白血球出口の定量化のための有用性を評価ましょう。まず、MC38 腫瘍細胞は、左と右の肩甲骨の間楓 Tg マウスに掻き我々 注入。埋込型腫瘍モデルはように知られている LNs; するためにリンパ腫瘍の正確な位置決めを有効にします。腫瘍の上の皮膚には、左と右の上腕の LNs に主にドレインをバックアップします。100 〜 150 ミリメートル³に達し後、腫瘍が photoconverted (10 分、200 mW) 腫瘍と dLNs 光電の直後に収穫します。フローサイトメトリーによる解析に⁺腫瘍 CD45 の重要な転換が明らかになった楓赤⁺ (69%; 楓グリーン⁺からの細胞図 3 a)、間重要なは、dLNs 楓赤⁺細胞陰性となった。蛍光顕微鏡 photoconverted YUMM 1.7 腫瘍の腫瘍組織に深く浸透し、光電を明らかにした (> 1 mm;図 3 b)。興味深いことに、皮膚や血管の細胞は図 3 bに見られるようにこれらの細胞型の高い光変換効率につながる楓蛋白質の高レベルを表現します。免疫細胞 (ダブルクォートおよび変換の両方) を識別するが困難なこの高楓赤式蛍光顕微鏡を用いたします。

悪性黒色腫免疫学に興味があるを考えると、我々 は次に様々 な埋込型腫瘍のセルラインを使用して光変換効率に及ぼす腫瘍径とメラニンを評価: MC38 (色素性大腸癌線)、B16。F10 (メラニン産生黒色線)、YUMM 1.1 (無着色黒色線)、および YUMM 1.7 (無着色黒色線)⁴⁴。それぞれの行は様々 な腫瘍体積 (50 650 mm³) で上記のように楓 Tg マウス、photoconverted、皮移植されました。腫瘍を光変換後すぐに収穫し、楓赤 CD45 の存在を評価⁺フローサイトメトリーによる白血球。興味深いことに、CD45 の光変換効率⁺白血球が腫瘍のタイプおよびサイズ (図 3) の間で大幅に変化します。CD45⁺白血球それぞれ YUMM 1.7 YUMM 1.1 腫瘍の発揮 80%、60% と最も効率的な光電を小 (50 〜 150 ミリメートル³) 内。ボリュームは、これらの腫瘍の増加、変換効率は大きな腫瘍 (> 600 mm³) の約 50% に減少しました。メラニンが光変換効率の顕著な影響を持っていた: CD45 の最大光電内 B16 メラニン産生細胞の⁺ 。F10 の腫瘍は約 30% にすぎなかったし、腫瘍 400 mm³のボリュームに達するように 10% に低下しました。興味深いことに、cd8 陽性腫瘍の解析⁺ T 細胞、メラニン産生 (図 3 D) に関係なく小さな腫瘍の約 80-90% にこれらのセル明らかに光変換効率です。CD8 無着色腫瘍に対する⁺ T 細胞変換残った腫瘍に達する大規模なボリュームとしても高いが、サイズの大幅減少、メラニンが存在します。このように、B16 のユーティリティ。F10 キー マウス黒色腫と他のメラニン産生黒色ラインは光を吸収メラニンの生物学的機能に一貫しているは小さな腫瘍 (50 mm³) に制限されるかもしれない。CD45 の数を数値化の腫瘍に関連付けられている炎症反応を評価する⁺細胞の未変換腫瘍と変換された腫瘍 24 h ポスト光電 (図 3E)。CD45 の数字の合計の差は見なかった⁺細胞腫瘍 24 h 光電変換されていない腫瘍と比較して、次の。

我々 は次に骨髄性とリンパ性セルどちらの人身売買行動の尋問のためことができます楓 Tg マウスを用いた腫瘍微小から白血球出口を定量化しました。MC38 または YUMM 1.7 腫瘍細胞は掻き楓 Tg マウスに移植されました。腫瘍はかつてボリュームに達した 100 〜 150 ミリメートル³間 photoconverted (5 分、200 mW);上腕 dLNs と鼠径非排水 LNs は、光変換後 24 時間を収集しました。腫瘍血白血球ポピュレーション MC38 から定量を行ったと YUMM 1.7 腫瘍 c57bl/6 マウス制御に注入し、腫瘍に達する 100 〜 150 ミリメートル³を収集します。フローサイトメトリーによる腫瘍と egressed 集団内白血球複雑さを評価した: T 細胞 (CD3ε cd 4⁺cd 8⁺⁺)、B 細胞 (CD3ε^-CD19⁺)、Dc (CD11c⁺MHCII⁺CD11b^+/-)、好中球 (CD11b⁺MHCII^-Ly6G⁺)、マクロファージ (CD11b⁺MHCII⁺F4/80⁺)、および炎症性単球 (CD11b⁺Ly6G^-Ly6C⁺;図 4 a)。この同じゲートを用いた、微小腫瘍 (図 4 b) の前の住居を示す赤い楓を表す dLNs の各末梢血白血球ポピュレーションの割合を評価されます。興味深いことに、両方の MC38 中 (図 4) YUMM 1.7 (図 4) 腫瘍が主に骨髄系細胞 (単球、マクロファージ、Dc) で濾過、両方の腫瘍のタイプから egressed いた細胞の約 50% が Tリンパ球 (CD4⁺および CD8⁺)。T 細胞に加えてまた B 細胞、Dc が観測され、腫瘍が、マクロファージや好中球から egressed 集団内の単球はいずれかの腫瘍のタイプから検出されなかった。完全に、このデータは、楓 Tg 蛍光マウス内在性の設定で複数の白血球系統を追跡するためのユーティリティを示します。さらに、我々 の分析は出口が腫瘍内白血球の複雑性を決定するための重要な意味があるかもしれない選択的なアクティブなプロセスであることを示します。

図 1: 光変換効率マウスの皮膚の炎症に関連付けられているとします。マウス真皮は 100 で 3 分間 photoconverted mW (405 nm の光)。 (A)代表的な流れが描いた photoconverted (楓赤⁺) をプロット CD45 未変換、変換後の耳頸 dLN 直後光電から細胞の⁺ 。集団がゲート前に住んで、CD45⁺の細胞します。(B)合計 CD45 の列挙、未変換の耳 (-) 細胞の⁺ 、耳耳次の光電、すぐに収集 24 h 光電後、耳の収集および 24 h VacV 感染後 (n = 3)。(C) A マイルのアッセイを行った血管水漏れしたため 405 nm の光への露出の直後の定量化 (3 分、100 mW)。耳の皮膚 (左) と抽出された色素 (右) の定量化漏れの代表的な画像 (n = 3)。誤差範囲を表す SEM. *p< 0.05 と * *p< 0.01。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: ナイーブから DC 出口、炎症し、皮膚を感染しています。(A)渡り鳥 Dc (Mdc; するゲーティング方式MHCII^{こんにちは}CD11c^int) とバイオハザード Dc (rDCs;MHCII^{こんにちは}CD11c^{こんにちは})。(B)代表的な流れのプロットを示す FITC⁺またはコントロール VacV (dLN) または対側の非排水 LN に感染して楓赤⁺ Dc、マウスからの Mdc のゲート前。(C) ⁺楓赤の数字の定量化と FITC⁺ Mdc rDCs の定常状態、DBP 炎症 (24 h 投稿アプリケーション)、および VacV dLNs の皮膚 (48 h ポスト感染症) に感染しています。誤差範囲を表す SEM.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 腫瘍微小光変換効率。腫瘍が 200 で 10 分の photoconverted mW (405 nm の光)。(A)代表的な流れは緑楓と楓未変換、変換された MC38 腫瘍と上腕 dLN 光電の直後に赤のプロットします。集団がゲート前に住んで、CD45⁺単一細胞。冷凍し、10 月に埋め込まれた YUMM 1.7 腫瘍両方ダブルクォート ・ photoconverted (B)蛍光顕微鏡。スケール バー 200 μ m (C)の変換効率 CD45 =⁺白血球および(D) CD8⁺リンパ球メラニン産生 (B16。F10) (MC38、YUMM 1.1 YUMM 1.7) 無色素性と。各ポイントは、単一のマウスを表します。合計 CD45 の(E)列挙未変換腫瘍細胞の⁺と photoconverted 腫瘍光電後 24 h を収集 (n = 3)。誤差範囲を表す SEM.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 腫瘍微小から白血球出口は選択。(A)ゲーティング MC38 dLNs で骨髄性とリンパ性の個体を識別する方式。(B)代表的な流れは、光電後 MC38 dLNs 24 h 中の骨髄性とリンパ性細胞の識別の楓赤⁺セルがプロットされます。流れのプロットのパーセンテージを示す楓赤⁺細胞腫瘍の LNs (C, D)の相対的な割合で指定された親の末梢血白血球ポピュレーション内の周波数 (CD45 の %⁺細胞) egressed (% 楓赤⁺細胞とMC38 から上腕 dLNs) 白血球 (C, n = 3) と YUMM 1.7 (Dn = 4) 腫瘍。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

周辺機器、非リンパ系組織から白血球の出口は、開始と免疫応答の解像度の重要が、出口を支配する分子メカニズムはよくわかっていません。知識で、このギャップは主に定量化の vivoのためのツールの準備状況のためです。ここでは、蛍光マウス皮膚腫瘍から内因性白血球出口を定量化し、炎症性の FITC ペンキを直接頭に頭の比較を提供 (楓 Tg) と感染症モデルの使用について述べる。両方のモデルは、内因性の DC 集団を追跡、FITC と貧しい吸収非貪食細胞の自由な排水は FITC 塗料を含む周辺、リンパ系の組織から骨髄性とリンパの出口の広範な分析のためのユーティリティを制限することを示す腫瘍。さらに、提案する腫瘍から出口が Torcellanらによって提示された結果を裏付けて確率よりもむしろ選択を示すデータ³⁹. 腫瘍から白血球出口を支配するメカニズムのそれ以上の調査は腫瘍炎症と免疫に新しい洞察力を明らかにするかもしれない。

文献で報告されると設定を使用してマウスの皮膚とその局所炎症に対する光電の効率性をまず評価しました。耳の紫の 100 mW の発電で 3 分の光への暴露は、CD45 の効率的な光電⁺細胞内下流 dLNs で変換されずに耳の皮膚 (78%)。文献のレポートを示す 3-5 分の露出は皮膚組織^5,33,38に最適です。しかし、この暴露は CD45 の増加につながった⁺細胞の耳介 24 h 次の変換とその光電耳介皮膚にこれらの設定を示す血管漏れ時に考慮すべき局所の炎症を誘導します。データの解釈。我々 は次に直接売買は LNs DBP 誘起性炎症、および VacV 感染耳から両方楓光電とより広く利用された FITC ペイント アッセイ^23,定常状態で²⁴を使用して DC を比較しようと思う。定常状態と次の DBP 治療で photoconverted 肌に比較として扱われ昇格した FITC 標識を見ました。無料 FITC の皮膚への応用につながるリンパ管を介して直接排水ドレイン LNs に居住者が移行されないこと DC 集団 (e.g。、CD8α⁺ Dc)、FITC のサンプル。これに一貫した、FITC ラベル刺激 DBP と扱われたときに Rdc の重要な番号を観察しました。対照的に、楓の赤いラベルの Dc でのみ観察されました mDC 人口以下を示すその光電光電ラベル Mdc により具体的な方法を提供します。MDC 人口の中でもただし、観測した定量的よりラベル付き Mdc 光電上 FITC を使用する場合。これはまた、無料の FITC 排水によって説明されるかもしれない、それは、ラベリングの期間に違いがあるどこ光変換することができます現在 Dc をラベルのみ FITC 肌在住まま皮膚の 24 時間の期間の持続期間のために可能な限り、観測 mDC 出口の違いを占めます。興味深いことに、ウイルス感染症の中では、光電と FITC アプリケーションの両方測定の mDC 出口といくつかの FITC⁺ rDCs 排水 VacV 感染耳 LNs の比較的等しいレベル。我々 は最近、リンパ排液が大幅に削減できる次 VacV 感染と従ってリンパ輸送におけるウイルス性削減 FITC 塗料の特異性を向上させることが DC 住民^{31 LN のラベリングを減少を報告}.重要なは、この作品がまた事実を強調する mDC 人口内 (CD3ε^-CD19^-MHCII^{こんにちは}CD11c^int)、24 h 内で移行が積極的に Dc 数はマイナーな人口、従って合計 mDC数字は、アクティブな移行⁴¹良い代理ではありません。最後に、我々 は一貫して任意指定された 24 h 期間次 VacV 感染症⁴¹、腫瘍微小から 1500-2000 Dc 出力中の約 200 のセルで mDC 出口を定量化して興味深いです。乱切^45,46,47によって適用されるとき特にワクチンのプラットフォームとして VacV の驚異的な効果を考えると、それはそれは DC の品質とおそらく種類の DC を推測する興味深い量ではなく、抗原を提示、それは堅牢な防御免疫を決定します。

Dc^25,48, を超えての腫瘍微小から白血球出口調査が不十分な地域のまま。腫瘍、慢性的な炎症を起こして微小と考えられるが、同様のメカニズムが非悪性および悪性組織からの細胞の出口を規制するかどうか不明であります。さらに、白血球の腫瘍から出口は確率的というか選択がかどうか白血球集積と腫瘍微小の保持の解釈に大きな影響を与えます。など、腫瘍から白血球出口は腫瘍が免疫監視を回避する方法を理解できるし、免疫療法のための新しい戦略につながる可能性があります。ここで我々 は埋込型皮膚腫瘍、FITC 塗装をするのに十分なことだろうから白血球の出口を研究する蛍光楓 Tg モデルを適用広く骨髄性とリンパ性の人口にラベルを付けます。初期の研究では、埋め込まれた腫瘍の光変換効率が両方腫瘍サイズとメラニンに依存していたことを明らかにしました。一方、腫瘍成長メラニンが存在する場合、急速に、光変換効率が脱落 (B16。F10)、YUMM MC38 腫瘍など非色素性腫瘍の線は、腫瘍サイズのテスト間でより安定した変換効率を展示します。興味深いことに、我々 は CD8 の改善された変換効率を観察⁺ T 細胞コンパートメントに比べて CD45⁺細胞は、腫瘍のサイズが増加と減少しました。この観測に貢献する可能性がありますいくつかの要因があります。まず、腫瘍内の位置に露出とこのように特定の細胞のタイプの変換効率に影響します。T 細胞埋込型腫瘍モデルで皮膚腫瘍インターフェイスに制限されて頻繁に見られるあり、従ってより容易に骨髄性細胞浸潤腫瘍実質基準 photoconverted。第二に、すべて白血球楓タンパク質⁴⁹の同じレベルを表現し、可能性がありますすべてではない同様に検出フローサイトメトリー;これはすべて CD45 などより異種細胞集団を分析する際、光電観測率を下げることにつながる可能性があります⁺細胞。最後に、図 3で示したデータだった紫光の生成された次の 10 分であることに注意することが重要です。この最初の露出時間は光電回皮膚、LNs、粘膜組織腫瘍^{5,6,33,35 など様々 な臓器を引用文献のレポートに基づいて選ばれました ,,3943}。のみ、他の研究腫瘍蛍光方式を採用した 20 分³⁹の光電を行いました。私たちの手でさらに最適化は、小規模および大規模なボリュームの 5 分の短縮の露光時間と効率の向上を明らかにしました。楓蛍光の変質につながる長期暴露など、報告された変換効率は、過少評価かもしれないそうです。長期暴露可能性がありますも光電関連付けられている増加炎症につながるし、研究結果を混同します。5 分の腫瘍 photoconverted を示した腫瘍 CD45 数⁺で有意差は光電変換されていない腫瘍と比較して後 24 h 細胞なし。さらに、5 分間腫瘍 photoconverted は骨髄性とリンパ性の人口のための測定をし、再現性のある出口を示した。したがって、特定のティッシュか関心の腫瘍内の個々 の最適化は、最適な結果を達成するために必要なです。

最後に、楓 Tg マウスに移植した腫瘍から内因性白血球出口を定量化する光電場を使用しました。Dcs は、重要な出口を見ました 2 つ異なる埋込型、非色素性腫瘍モデルを用いた T 細胞と単球。最近出版された作品³⁹CD4 と一貫性のある⁺および CD8⁺ T 細胞は細胞⁺ T 二重否定 CD3ε のかなりの数と共に腫瘍微小から egressed。少なくとも、この人口の 1 つのコンポーネント可能性がありますガンマ ・ デルタ T 細胞として前述の³⁹、決定するこの観察の機能的意義は残ります。重要なは、白血球の腫瘍微小内の相対的な割合に腫瘍から egressing 白血球の比率を比較すると、我々 は白血球の腫瘍内プール基準 egressed 集団で濃縮を観察両方のモデルは、選択的白血球の出口を示します。特に、マクロファージや好中球が欠席 egressed 集団でしかし両方の細胞の種類記載されている炎症や感染した条件^2,50,,5152の下で出口に^,53,腫瘍内白血球レパートリー^{39,55,56 54}とは重要な貢献者したがって、腫瘍から白血球出口光変換モデルを用いて定量化することができます、規制プロセスではなく、確率ではないし、残る炎症の理解にとって重要な意義を持つ重要な流生物学と定常状態における腫瘍微小と応答療法に免疫ダイナミクス。

著者を開示するとの競合があります。

著者は、B6 を提供するため YUMM 1.1 YUMM 1.7 マウス黒色線と博士デボラ ・ j ・ Fowell を提供する博士マーカス ボーゼンベルクを感謝したいです。理研 BRC を通じて、国立生物資源文部科学省、日本の合意 cg Tg(CAG-tdKaede) 15Utr マウス。