التحديد الكمي لخروج الكريات البيض عن طريق الأوعية اللمفاوية من الجلد مورين والأورام

هنا، علينا أن نظهر الأساليب في فيفو التقييم الكمي لخروج الكريات البيض من السذاجة، ملتهبة، والجلد مورين الخبيثة. نقوم بمقارنة وجها لوجه بين نموذجين: فوتوكونفيرسيون التطبيق و في الموقع فيتك عبر الجلد. وعلاوة على ذلك، علينا أن نظهر الأداة المساعدة فوتوكونفيرسيون لتعقب خروج الكريات البيض من الأورام الجلدية.

خروج الكريات البيض من الأنسجة المحيطة بالغدد الليمفاوية تجفيف ليس فقط الحرجة لمراقبة محصنة وبدء بل تسهم أيضا في القرار ردود الأنسجة المحيطية. بينما يتم استخدام مجموعة متنوعة من أساليب لقياس خروج الكريات البيض من الأنسجة غير اللمفاوية، والأجهزة الطرفية، والآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم خروج تعتمد على السياق تظل غير مفهومة. هنا، نحن تصف الاستخدام في الموقع فوتوكونفيرسيون للتحليل الكمي لخروج الكريات البيض من الجلد مورين والأورام. فوتوكونفيرسيون يسمح بمباشرة العلامات من الكريات البيضاء المقيمين داخل الأنسجة الجلدية. على الرغم من تعرض الجلد للضوء فوق البنفسجي يستحث المحلية التحريضية الردود تتسم تتسرب الكريات البيض ويجتازها الأوعية الدموية، في مقارنة وجها لوجه مع التطبيق عبر الجلد لتتبع الفلورسنت، فوتوكونفيرسيون على وجه التحديد تسمية الخلية الجذعية هجرة السكان، وفي نفس الوقت تمكين التحديد الكمي لخروج النقوي واللمفاوية من ميكرونفيرونمينتس الجلدية والأورام. آليات خروج الكريات البيض تظل عنصرا مفقوداً في فهمنا لتعقيد الكريات البيض إينتراتومورال، وهكذا تطبيق الأدوات المبينة في هذا التقرير سوف توفر فريدة من التبصر في ديناميات الورم ميكرونفيرونمينتس محصنة على حد سواء في استقرار الدولة واستجابة للعلاج.

الاستجابات المناعية الأنسجة المحيطية تتشكل ليس فقط بتجنيد الكريات البيض إلى المواقع الالتهاب ولكن أيضا بالآليات التي تنظم الاحتفاظ بها بعد ذلك. وهكذا، تمليه الحصانة الواقية التراكمي الآليات الخلوية والجزيئية التي تحدد عما إذا كان يدخل الكريات البيض، يبقى داخل، أو بالأحرى يهاجر خارج الأنسجة الطرفية عبر الأوعية اللمفاوية. الأهم من ذلك، أن الميل للكريات البيضاء للخروج من الأنسجة عن طريق الأوعية اللمفاوية (يطلق عليها الخروج) مرتبط بوظائفها المتخصصة. الخلايا الجذعية (DC) اكتساب سلوك الهجرة استجابة لإشارات النضج مما يؤدي إلى نقل مستضد والعرض التقديمي في تجفيف الغدد الليمفاوية (دلن)، هي عملية ضرورية لمناعة التكيفية¹. مسح الخلايا النقوي، مثل الضامة والعدلات، تعمل على إزالة الأنقاض apoptotic عن طريق البلعمه. خلال العدوى البكتيرية، العَدلات خروج الأنسجة والخضوع في نهاية المطاف للمبرمج في دلنس² ونموذج لالتهاب القولون المستحثة بمفاجآت صيف دبي، والبيانات تدعم الفرضية القائلة بأن خروج بلعم ضروري لحل التهاب المحلية³. ومع ذلك، ما إذا كان يحدث خروج العَدلات وبلعم في جميع السياقات التحريضية، غير معروف. أدلة اللمفاويات T الخروج من حالة ثابتة^4،5،،من⁶⁷و المصابين⁸ملتهبة^4،،من^{910، 11،12} الأنسجة الطرفية غير اللمفاوية، ويشير إلى أن أوافيكم بنشاط خلايا تي، على الرغم من الإشارات المستندة إلى الأنسجة التي تدفع هذا الخروج ما زالت غير مفهومة. وقد حددت عدة دراسات خروج الإشارات الضرورية للهجرة الاتجاه نحو تجفيف الشعيرات اللمفاوية واللاحقة بما في ذلك يجند chemokine (عزر ج ج) 21 (CCL21) ولها مستقبلات^{، CCR7،من411 13}, يجند chemokine (عزر ج-س-ج) 12 (CXCL12) ومستقبلات CXCR4^2،14، وسفينجوسيني-1-فوسفات (S1P)^10،،من¹⁵¹⁶. بيد أن هذه الآليات ليست نشطة في جميع السياقات، وعما إذا كانت هي تحديد الخروج من جميع أنواع الخلايا تبقى مسألة مفتوحة. الأهم من ذلك، يتطلب أعمق للآليات التي تحكم متدفقة وأهميتها الوظيفية في المرض زيادة الكمية في فيفو أساليب التحليل.

وقد استخدمت عدة طرق التحديد الكمي للخروج في عدة نماذج حيوانية في الجسم الحي بما في ذلك كانوليشن مباشرة من الأوعية اللمفاوية، التبني نقل السابقين فيفو المسمى الكريات البيضاء، التطبيق عبر الجلد لتتبع الفلورسنت، حقن الجسيمات المسمى، و في فيفو فوتوكونفيرسيون^17،18. كانولاتيون المباشر للأوعية اللمفاوية الماوس الزبائ صعبة ومحدودة في الحيوانات الصغيرة بكميات السوائل التي يمكن جمعها. وبالتالي، إلى حد كبير أداء كانوليشن في الحيوانات الكبيرة (على سبيل المثال.، الأغنام) التي تكون فيها مثل هذه المعالجات الجراحية العملية. وتوفر هذه الدراسات أدلة مباشرة لوجود خلايا اللمفاوية سواء النقوي في الليمفاوية^10،،من¹⁹²⁰. وعلاوة على ذلك، تكشف نماذج الأغنام أن الالتهاب الحاد والمزمن زاد وجود اللمفاويات في الليمفاوية 100-fold حوالي^10،21.

التبني نقل الخلايا الليمفاوية المسماة ومحوره وراثيا كشفت الأهم من ذلك أن CCR7 مطلوب للخروج من خلايا CD4 خلايا⁺ ر من حدة التهاب الجلد^5،11، أثناء المعالجة الأولية للخلايا اللمفية مع جزيء صغير S1P مستقبلات مؤثر، يمنع FTY720، إلا بصورة جزئية عن خروج¹⁰. من المثير للاهتمام، الخروج من الخلايا الليمفاوية المحولة من التهاب مزمن في الجلد مستقلة CCR7¹⁰، لكن قد تتطلب جزئيا CXCR4⁹. تجارب نقل التبني، ومع ذلك، توصيل أرقام غير الفسيولوجية السابقين فيفو لمفاوية المنشط والمسمى إلى الأنسجة عن طريق الحقن، مما يغير البيئة النشاط الحيوي للأنسجة والضغوط السائل الخلالي مرتفعة أن فتح الشعيرات اللمفاوية الأولية، وتغيير خصائص النقل على²². كبديل، تطبيق عبر الجلد من fluorescein isothiocyanate (فيتك) في وجود أو عدم وجود المهيجات الجلدية (مثلاً.، والفثالات الفثالات، دبة) أو العدوى^23،24 يسمح بالتتبع خلايا متجولة التي تتراكم الراسم وتهاجر إلى دلنس. وبالمثل، المسمى فلوريسسينتلي الأورام توفر وسيلة لتتبع الخلايا البلعمية التي تجتاح الورم المواد²⁵. ووفرت هذه الأساليب الهامة من التبصر في الآليات التي تحكم العاصمة خروج^{13،14،17،،}من²⁶²⁷ ولكن غير قادر على تتبع غير متجولة الخلايا الليمفاوية، وتفسير يمكن تعقدت اللمفاوي خالية من فيتك القابلة للذوبان وبالتالي وضع العلامات غير المهاجرة، LN المقيم وحدات تحكم المجال Dc.

وبدلاً من ذلك، الفحص المجهري إينترافيتال هو أداة قوية تسمح بتتبع في فيفو السكان الكريات البيض فسيولوجيا ذات الصلة في الوقت الحقيقي^28،29. المستخدمة في تركيبة مع مراسل الفئران والقائم على جسم في فيفو إيمونوفلوريسسينت العلامات، إينترافيتال مجهرية كشف المجمع المكاني والزماني ديناميات المناعي الخلية الاتجار بالأشخاص، بما في ذلك الهجرة فراغي³⁰ ، التهجير عبر البطانة اللمفاوية، ومرور داخل التجويف اللمفاوية، والهجرة على LN دخول^28،31. محدود بالمصروفات، الخبرة الفنية اللازمة لإعداد، اعتماد واسع النطاق لتقنيات التصوير إينترافيتال ومحدودة الإنتاجية للتحديد الكمي لأنواع متعددة من الخلايا. لا يزال، اقتران الأساليب الكمية أن تحليل الديناميات السكانية الأنسجة مع تصوير إينترافيتال سوف توفر البصيرة ميكانيكية إضافية وهامة فيما يخص آليات حركية والهجرة نحو وداخل الشعيرات الدموية اللمفية ^{18 , 31 , 32}.

ونتيجة لذلك، في فيفو فوتوكونفيرسيون برز كوسيلة تسمح الموقع في وضع العلامات، مستقل لنشاط متجولة، والتحديد الكمي لخروج الكريات البيض الفسيولوجية (عندما يقترن بالتدفق الخلوي) في غياب أو وجود التحدي. مؤثرا عن الفئران كايد تيمبل بروتين المعزولة من المرجان ستوني أن يسلك الفلورية الخضراء (كايد الأخضر) حتى تتعرض للضوء فوق البنفسجي، بعدها أنه يحول لا رجعة فيه للأسفار أحمر (كايد أحمر)³³. يمكن تعقب الخلايا فوتوكونفيرتيد كما أنها خروج من مواقع الأنسجة المحيطية، وتتراكم في دلنس. وكشفت هذه وأخرى مماثلة فوتوكونفيرتيبلي الماوس نماذج^34،35 البيولوجيا الهامة بما في ذلك خروج المكونة من خلايا تي التنظيمية من الجلد³⁶، تعتمد على CXCR4 خلية بالخروج من البقع في بييير³⁷ , تعبئة خلايا الذاكرة المقيم T عند إعادة تحدي الببتيد³⁸، وخروج الكريات البيض واسعة من ورم ميكرونفيرونمينتس³⁹. هنا، نحن إجراء مقارنة وجها لوجه من فوتوكونفيرسيون مع التطبيق فيتك عبر الجلد في سياق الالتهابات الجلدية والعدوى تسمح بإجراء مقارنة مباشرة للبيانات الموجودة باستخدام أسلوب فوتوكونفيرتيبلي. وعلاوة على ذلك، نحن تثبت فوتوكونفيرسيون في أورام مزروع ووصف كفاءة التحويل وخروج انتقائية من ورم ميكرونفيرونمينتس. على هذا النحو، يمكننا القول بأن تطبيق هذه الأساليب المزيد من توضيح بيولوجيا حاسمة لخروج الكريات البيض من الأورام، والتي سيكون لها آثار كبيرة على تفسير intratumoral الكريات البيض التعقيد، الحصانة المضادة للورم، و واستجابة للعلاج.

كافة البروتوكولات الحيوانية عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في ولاية أوريغون للصحة والعلوم بجامعة.

1-تنظيم دورات تعريفية لالتهاب وطلاء فيتك بينا الماوس

1. في غطاء الاندفاق الصفحي، تخدير ماوس C57Bl/6 استخدام إيسوفلوراني المتبخرة (حمل في 3-5% إيسوفلوراني والحفاظ على إيسوفلوراني 1-3%؛ معدل تدفق الأكسجين في 0.5-1.0 لتر/دقيقة). ضمان أنيسثيتيزيشن السليم عن طريق رصد فقدان دواسة العاكسة، حركات لا إرادية، وانخفاض معدل التنفس.
2. ويكمن إذن شقة مع الجانب البطني من الإذن التي تواجه صعودا. بيبيت 20 ميليلتر محلول فيتك 5% يذوب في الأسيتون 1:1: والفثالات الفثالات (دبة) إلى الجانب البطني من بينا الإذن. يسمح الإذن لتجف لبضع ثوان.
3. 24 ساعة بعد تطبيق فيتك، euthanize الفئران عن طريق التعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون تليها التفكك عنق الرحم. جمع بن الإذن في برنامج تلفزيوني عن طريق يفصل بين الأذنين من الرأس باستخدام مقص. جمع دلنس عنق الرحم ولنس غير استنزاف الآربي في برنامج تلفزيوني استخدام الملقط لفصل في لنس من الأنسجة المحيطة. لنس الآربي غير استنزاف سيكون بمثابة عناصر سلبية لوجود فيتك⁺⁺ /Kaede الحمراء الكريات البيضاء. التخلص من جثث كل بروتوكول المؤسسية.
   ملاحظة: فوتوكونفيرسيون وظيفة الوقت الأمثل لتحليل سيتوقف على نوع الخلية والسلوكيات الهجرة المعروفة. على سبيل المثال، يمكن اكتشاف الخلايا الجذعية، في دلنس في وقت مبكر كتطبيق افرجا بوست ح 6.

2-تنظيم دورات تعريفية لالتهاب وفوتوكونفيرسيون بينا الماوس

1. في غطاء الاندفاق الصفحي، تخدير ماوس كايد تيمبل (خلفية C57Bl/6) عن طريق الحقن داخل من الكيتامين 80 ملغ/كغ و 10 مغ/كغ إكسيلازيني الذائبة في المياه المالحة. ضمان أنيسثيتيزيشن المناسب كما هو موضح في "الخطوة 1-1".
2. ويكمن إذن شقة مع الجانب البطني من الإذن التي تواجه صعودا. بيبيت 20 ميليلتر من 1:1 الأسيتون: دبة إلى الجانب البطني من بينا الإذن. يسمح الإذن لتجف لبضع ثوان.
3. وبعد تطبيق دبة، قطع فتحه في قطعة من رقائق الألومنيوم وسحب الإذن من خلال الشق لفضح الإذن لمصدر الضوء فوق البنفسجي. وضع الإذن مسطح مع الجانب الظهرية التي تواجه إلى الأعلى باستخدام الشريط على الوجهين للحصول على الإذن لإحباط.
4. ضع الإذن مباشرة تحت مصدر الضوء، وفوتوكونفيرت لمدة 3 دقيقة باستخدام مصدر ضوء 405 نانومتر في 100 ميغاواط السلطة.
5. 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون، euthanize الفئران كايد تيمبل وحصاد بن الإذن وعنق الرحم لنس لنس الاربية كما هو موضح في "الخطوة 1، 3".
   ملاحظة: بالإضافة إلى الاعتبارات المشار إليها في "الخطوة 1، 3"، أن معدلات الانتشار سيحدد توقيت التحليل كما سوف يحدث فقدان الأحمر كايد في سرعة تقسيم الخلايا.

3-اللقاحية العدوى بينا الماوس وتطبيق فيتك

1. تخدير ماوس C57Bl/6 مع إيسوفلوراني يتبخر كما هو موضح في "الخطوة 1-1".
2. ويكمن الجانب البطني من الإذن شقة. بيبيت 5 × 10⁶ تشكيل اللوحة (بفو) لوحدات اللقاحية الفيروسات (فاكف) مخفف في 10 ميليلتر من برنامج تلفزيوني على بينا الإذن. باستخدام إبرة قياس 29، كزة بينا مرات 25⁴⁰.
3. 24 ساعة بعد الإصابة، تخدير الفئران المصابة فاكف مع إيسوفلوراني كما هو موضح في "الخطوة 1-1" وبيبيت 20 ميليلتر 5% فيتك المذاب في الأسيتون على الجانب البطني من بينا الإذن. يسمح الإذن لتجف لبضع ثوان.
4. 24 ساعة بعد تطبيق فيتك، euthanize الفئران وجمع بينناي الإذن، لنس عنق الرحم ولنس الاربية كما هو موضح في "الخطوة 1، 3".
   ملاحظة: يمكن تطبيق فيتك في أي وقت نقطة وظيفة العدوى لتحديد DC الاتجار في مختلف فترات ح 24. نحن ذكرت سابقا هو الحفاظ على DC الهجرة إلى دلنس على مستويات مماثلة من العدوى من الرتبة 1 إلى 3 يوم⁴¹.

4-اللقاحية العدوى بينا الماوس وفوتوكونفيرسيون.

1. تخدير ماوس كايد تيمبل مع إيسوفلوراني يتبخر كما هو موضح في "الخطوة 1-1".
2. تصيب بينا الإذن مع فاكف كما هو موضح في "الخطوة 3-2".
3. تخدير الفئران المصابة فاكف كايد كما هو موضح في "الخطوة 2، 1" 24 ساعة بعد الإصابة، وتنفيذ فوتوكونفيرسيون كما هو موضح في الخطوات 2.3-2.4.
4. 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون، euthanize الفئران وحصاد بن الإذن وعنق الرحم لنس لنس الاربية كما هو موضح في "الخطوة 1، 3".
   ملاحظة: كما هو مذكور أعلاه في "الخطوة 3، 4"، يمكن أن تدار فوتوكونفيرسيون في أي وقت نقطة بعد العدوى.

5-الإذن والعقدة الليمفاوية التجهيز للتدفق الخلوي

1. إنشاء تعليق خلية مفردة من بن الإذن: قشر بعيداً على الجانبين البطني والظهريه من بينا الإذن باستخدام اثنين من أزواج من ملاقط ومكان مع الإذن أسفل إلى الآبار لصفيحة 24-البئر الذي يحتوي على 1 ملغ/مل كولاجيناز د والدناز يو/مليلتر 80 المخفف في الداخل مخزنة المالحة الحل (هبس في هانك) (التي تحتوي على Ca^{2 +} و Mg^{2 +}). احتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30 صحفي الأنسجة هضمها من خلال مصفاة خلية نايلون 70 ميكرومتر.
2. إنشاء تعليق خلية مفردة من لنس: ضع لنس في آبار صفيحة 24-البئر الذي يحتوي على 1 ملغ/مل كولاجيناز د والدناز يو/مليلتر 80 المخفف في حبس. فتح نفش العقدة الليمفاوية كبسولة استخدام اثنين 29-قياس الإبر، واحتضان الليمفاوية في 37 درجة مئوية ل 30 دقيقة ثم اضغط الأنسجة هضمها عبر مصفاة خلية نايلون 70 ميكرومتر.

6-زرع الورم سرطان الجلد الأدمة وفوتوكونفيرسيون.

1. يحلق الفراء من وسط الجزء الخلفي من ماوس كايد تيمبل يستخدم حلاقة الكهربائية.
2. ضع إبرة قياس 29 في وسط الظهر بين سكابولاي اليسرى واليمنى العليا، وإينتراديرمالي بحقن الخلايا السرطانية⁵ 5 × 10 (مخففة في 50 ميليلتر من المحلول الملحي) جلد الفئران كايد تيمبل. يجب أن توضع الأورام بعناية لضمان التصريف اللمفاوي إلى العقد الليمفاوية المحددة (أي، اليسار واليمين عضدي لنس لاورام وضعت في منتصف الجزء الأعلى من الظهر). تجنب وضع الورم أعلاه دلن كما يمكن أن ينتج عن هذا فوتوكونفيرسيون مباشرة من لنس عن طريق الجلد/الورم.
3. السماح للأورام تنمو إلى الحجم المطلوب (100-650 ملم³).
4. يوم واحد قبل جمع الأنسجة، تخدير كايد تيمبل ماوس كما هو موضح في 2.1 ويحلق أي الفراء ريجروون حديثا حول الورم.
5. قطع حفرة دائرية في رقائق الألومنيوم وسحب الورم عن طريق تعريض الورم إلى مصدر الضوء. قص الثقب أصغر قليلاً من الورم لمنع الورم من الوقوع مرة أخرى من خلال الثقب والتقليل من تحويل الجلد المجاور، غير الورم.
6. تحديد موضع الورم مباشرة أسفل مصدر الضوء وفوتوكونفيرت لمدة 5 دقائق باستخدام مصدر ضوء 405 نانومتر في 200 ميغاواط السلطة.
7. 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون، euthanize الفئران كما هو موضح في "الخطوة 1، 3". جمع الأورام وعضدي دلنس الاربية لنس غير استنزاف في برنامج تلفزيوني. قطع الأورام بعيداً عن الجلد المحيطة باستخدام مقص وإزالة لنس كما هو موضح في "الخطوة 1، 3".

7-الورم والعقدة الليمفاوية التجهيز للتدفق الخلوي

1. إنشاء تعليق خلية واحدة من الأورام: فرم الأورام مع مقص إلى الآبار لصفيحة 24-البئر الذي يحتوي على 1 ملغ/مل كولاجيناز د والدناز يو/مليلتر 80 المخفف في حبس. احتضان في 37 درجة مئوية حاء 1 الصحافة هضم الأنسجة من خلال مصفاة نايلون 70 ميكرومتر.
2. إنشاء تعليق خلية واحدة فقط من العقد الليمفاوية كما هو موضح في "الخطوة 5-2".

8-جسم تلطيخ للتدفق الخلوي

1. بعد هضم الأنسجة في تعليق خلية مفردة، تنفيذ معيار التدفق الخلوي تقنيات المصبوغة لتسمية الخلايا مع علامات الاهتمام. بإيجاز، بيبيت 2 × 10⁶ خلايا في لوحة 96-جيدا. احتضان العينات مع كتلة Fc (1 ميكروغرام/مل) لمدة 20 دقيقة على الجليد؛ تغسل مرتين مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (ألبومين المصل البقري 1% من برنامج تلفزيوني). إضافة وصمة عار يعيش الميت (مخففة في برنامج تلفزيوني) للعينات واحتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد؛ تغسل مرتين مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (جدول المواد) المخفف في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لمدة 30 دقيقة على الجليد؛ تغسل مرتين مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
   ملاحظة: كايدى الخضراء وكايدي ومضان أحمر يتداخل مع fluorophores فيتك والمؤسسة العامة؛ وهكذا، لا يمكن استخدام فيتك والأجسام المضادة مترافق PE في تركيبة مع البروتينات كايد.
2. بعد تلطيخ، تشغيل العينات على سيتوميتير تدفق. وبدلاً من ذلك، إصلاح الخلايا مع 2% منهاج عمل بيجين.

9. التدفق الخلوي التحليل

1. تعيين فيتك (كايد الأخضر) وقناة PE (كايد الأحمر) الفولتية PMT إلى 70-80% من مجموع النطاق (مركز السكان في حوالي الساعة 10⁴) استخدام السابقين فيفو الأخضر كايد أو كايد حمراء اللون المفرد سبلينوسيتيس أو الدم.
   ملاحظة: لا تعوض عن كايد الأخضر (فيتك) وقنوات كايد أحمر (PE) كهذا سيؤدي إلى إشارة أكبر انتشار.
   1. لإنشاء عناصر تحكم كايد أحادي اللون، جمع من الطحال أو الدم من ماوس كايد تيمبل. خلايا الدم الحمراء مع ACK المخزن المؤقت، ثم تقسيم الخلايا إلى مجموعتين: غير محولة كايد كايد الخضراء وتحويلها أحمر.
   2. للون واحد كايدى ضوابط حمراء، تعليق الخلايا الموجودة في 1 مل من برنامج تلفزيوني وفوتوكونفيرت في صفيحة 24-جيدا لمدة 5 دقائق باستخدام مصادر ضوء 405 من شمال البحر الأبيض المتوسط في طه 100 ميغاواط. تستخدم هذه الخلايا لتعيين كايد الخضراء (فيتك) وكايد الفولتية PMT حمراء على تدفق سيتوميتير (9.1 الخطوة).
2. بمجرد تم تعيين الفولتية للبروتينات كايد، التعويض عن سائر البقع الأولية جسم واحد-fluorophore المسمى الخرز تعويض كل إرشادات الشركة المصنعة باستخدام.
3. تشغيل العينات على سيتوميتير تدفق لجمع البيانات.
   ملاحظة: ويجري إنتاج البروتين كايد باستمرار بالخلايا. وهذا يعني أن 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون، سيتم تحويل الخلايا إيجابية مزدوجة كايد الخضراء وتراكمت البروتين كايد حمراء كالمركبة حديثا كايد (الأخضر) في الخلية.
4. تحليل البيانات باستخدام برنامج فلووجو أو برامج مماثلة.

أولاً سعينا إلى تكرار النتائج فوتوكونفيرسيون نشرت في الأدب لتقييم الكفاءة وتحديد التهاب المرتبطة بها في الجلد الماوس. تعرضت بينا الإذن إلى 100 ميغاواط البنفسجي الخفيف (405 نانومتر) لدقيقة 3 كما تم وصفه سابقا³³. واحد تعليق خلية المتولدة من الجلد الإذن أو دلنس عنق الرحم مباشرة عقب التعرض وكشف من كفاءة تحويل 78% من جميع CD45⁺ ملاحظة الكريات البيضاء في الجلد مع أي من الخلايا المحولة في دلنس (الشكل 1A). لتقييم الاستجابة الالتهابية المرتبطة فوتوكونفيرسيون، نحن كمياً الأرقام من التسلل إلى CD45⁺ الكريات البيضاء في آذان المحولة 0 وح 24 وظيفة التحويل (الشكل 1B) والتغيرات الحادة في نفاذية الأوعية الدموية كقياس بميل للمقايسة⁴² (الشكل 1). بإيجاز، حقن 200 ميليلتر من 0.5% كان "الأزرق إيفانز" إينترافاسكولارلي ح 2 بعد فوتوكونفيرسيون. وجمعت الأذان 30 دقيقة بعد الحقن و "الأزرق إيفانز" كان يستخرج مع ميثلامين عن 24 ساعة عند درجة 55 درجة مئوية (امتصاص قراءة في 610 نيوتن متر⁴²). كلا CD45 تتسرب⁺ (24 ساعة) وتسرب الأوعية الدموية (ح 2) كانت زيادة كبيرة عقب فوتوكونفيرسيون، مشيراً إلى أن فوتوكونفيرسيون نفسها قد تؤثر حتى على هذا التعرض القصير، الاستجابة الخاصة بالانسجة الملتهبة. مقارنة CD45 تتسرب⁺ (الشكل 1B) وتسرب الأوعية الدموية (1.4 ميكروغرام/الإذن ±0.75) في فاكف المصابة آذان ح 24 وظيفة العدوى⁴¹ يوفر سياقا لمدى الالتهاب الناجم عن الضوء فوق البنفسجي (ميكروغرام/الإذن 0.08 ± 0.01).

بينما استخدمت عدة نماذج في دراسات مختلفة لتعقب خروج الكريات البيض من الأنسجة غير اللمفاوية، والأجهزة الطرفية، من غير الواضح كيف يمكن مقارنة هذه الأساليب في قدرتها على تعقب فئات معينة من السكان كما أنها الخروج من الجلد. ونتيجة لذلك، قررنا إجراء مقارنة مباشرة وجها لوجه من اثنين من الأساليب استخداماً لتعقب خروج العاصمة إلى لنس، فوتوكونفيرسيون الطلاء و في فيفو فيتك، بغية تقييم الكفاءة والنوعية لكل أسلوب للكمية تحليل لخروج العاصمة في حالة مستقرة، أثناء الالتهابات الجلدية، ومن إصابة الجلد. لكل تحليل، يتعرضون لتطبيق فيتك عبر الجلد الجلد أو يتعرض إلى 100 ميغاواط 405 نانومتر الضوء لسكان العاصمة LN 3 دقيقة كانت تعرف بأنها CD3ε^–CD19^–مهسيي⁺CD11c⁺ وكذلك طبقات إلى 1) مهسيي^مرحبا CD11c^int DCs، مما يثري للهجرة وحدات تحكم المجال Dc (مدكس) كلا CD103⁺ BATF3-تعتمد على تقديم عبر وحدات تحكم المجال Dc، و CD11b⁺ Dc عن طريق الجلد؛ و 2) مهسيي^intCD11c^مرحبا DCs، مما يثري للمقيمين DCs (نسق) بما في ذلك CD8α⁺ BATF3-تعتمد على الصليب-عرض وحدات تحكم المجال Dc (الشكل 2A). 24 ساعة بعد تطبيق فيتك أو فوتوكونفيرسيون، كانت الخلايا المسماة سهولة الاكتشاف في تجفيف ولكن لا عدم استنزاف لنس (الشكل 2). لتقدير مدى هجرة العاصمة إلى لنس وفي نفس الوقت تحديد خصوصية الأسلوب لوسم ترحيل السكان والسكان LN غير المقيمين، ونحن كمياً المسمى مدكس ونسق في حالة مستقرة، 24 ساعة بعد تطبيق دبة، وبعد 48 ساعة فاكف تشريط (الشكل 2). بينما تسمية كل من فوتوكونفيرسيون (كايد) وفيتك مدكس في جميع الظروف، لاحظنا فيتك المسمى أكثر من المسمى كايد مدكس في دلنس، باستثناء الإصابة فاكف فيها الطريقتين كمياً إلى مستوى مماثل للخروج. وعلاوة على ذلك، في سياق دبة، المسمى فيتك بالإضافة إلى ذلك سكان جمهورية الكونغو الديمقراطية حيث لا يزال فوتوكونفيرسيون محددة على مدكس (الشكل 2). باستخدام كل من هذه الأساليب، لاحظنا خروج البلدان النامية حوالي 200 من فاكف إصابة الجلد، والأهم من ذلك أشار إلى أن هذا المستوى من خروج يلخص النتائج المنشورة سابقا باستخدام تطبيق فيتك عبر الجلد بالحمام et al. ⁴¹-وهكذا، تبعاً للسياق التحريضية، تطبيق فيتك عبر الجلد قد زيادة إعداد DCs المسمى الكشف عنها في دلنس والنتيجة في وسم غير محددة من السكان العاصمة LN المقيمة غير المهاجرة، بينما فوتوكونفيرسيون بالتحديد على وحدات تحكم المجال Dc الوقوع في عدد سكان حركة التغيير الديمقراطي.

كايد تيمبل الفئران قد استخدمت لقياس الاحتفاظ الكريات البيض في^5،،من³³⁴³ والخروج من^5،6،،من³⁵³⁸ الجلدية، والأغشية المخاطية، و الأنسجة اللمفاوية تحت ثابت الدولة وملتهبة الشروط وتطبيقها على الأورام في منشور واحد حيث كانت مزروع الأورام الأدمة في آذان الفأر وفوتوكونفيرتيد في كميات صغيرة³⁹فقط. وهكذا، سعينا إلى إجراء تقييم لجدوى في فيفو فوتوكونفيرسيون للتحديد الكمي لخروج الكريات البيض من الأورام الأولية كبيرة وثابتة لتمكين اختبار الفرضية المناعية كذلك. أولاً، نحن زرع الخلايا السرطانية MC38 إينتراديرمالي في الفئران كايد تيمبل بين سكابولاي الأيمن والأيسر. تمكين النماذج القابلة للغرس الورم الموضع الدقيق للأورام لضمان التصريف اللمفاوي إلى لنس المعروفة؛ أورام في الجلد من الجزء العلوي إلى استنزاف أساسا لنس اليسار واليمين عضدي. بعد أن وصلت إلى 100-150 ملم³، كانت الأورام فوتوكونفيرتيد (10 دقيقة، 200 ميغاواط) والأورام وتحصد فور فوتوكونفيرسيون دلنس. وكشف التحليل بالتدفق الخلوي كبيرة تحويل intratumoral CD45⁺ الخلايا من كايد الأخضر⁺ إلى كايد الأحمر⁺ (69 في المائة؛ الشكل 3 ألف)، بينما الأهم من ذلك، ظلت سلبية بالنسبة للخلايا الحمراء كايد⁺ دلنس. مجهر الفلورة الأورام فوتوكونفيرتيد YUMM 1.7 كشف فوتوكونفيرسيون أن يخترق عمق الورم الأنسجة (> 1 مم؛ الشكل 3). من المثير للاهتمام، الجلد وخلايا الأوعية الدموية التعبير عن مستويات عالية من البروتين كايد مما يؤدي إلى كفاءة عالية فوتوكونفيرسيون من هذه أنواع الخلايا كما هو موضح في الشكل 3 (ب). هذا التعبير كايد حمراء عالية تجعل من الصعب تحديد الخلايا المناعية (غير المحولة وتحويلها على حد سواء) باستخدام مجهر الفلورة.

نظراً لاهتمامنا خاصة في علم المناعة سرطان الجلد، نحن التالية تقييم أثر كل من حجم الورم والميلانين على كفاءة فوتوكونفيرسيون باستخدام مختلف خطوط الخلايا القابلة للغرس الورم مورين: MC38 (الزغب خط سرطان القولون والمستقيم)، B16. المفتاح F10 (خط الميلانوما إنتاج الميلانين)، YUMM 1.1 (الميلانوما أونبيجمينتيد خط) و 1.7 YUMM (خط أونبيجمينتيد الميلانوما)⁴⁴. كل من هذه الخطوط تم زرعها الأدمة في الفئران كايد تيمبل وفوتوكونفيرتيد، كما هو موضح أعلاه على وحدات التخزين المختلفة الورم (50-650 ملم³). الأورام هي تحصد فورا بعد فوتوكونفيرسيون وتقييمها لوجود CD45 كايد أحمر⁺ الكريات البيضاء بالتدفق الخلوي. من المثير للاهتمام، كفاءة فوتوكونفيرسيون CD45⁺ الكريات البيضاء التي اختلفت اختلافاً كبيرا عبر الورم أنواع وأحجام (الشكل 3). CD45⁺ الكريات البيضاء داخل الصغيرة (50-150 ملم³) أظهرت الأورام YUMM 1.7 و YUMM 1.1 فوتوكونفيرسيون الأكثر كفاءة في 80% و 60%، على التوالي. زيادة وحدات التخزين لهذه الأورام، انخفضت كفاءة التحويل إلى حوالي 50% للأورام الكبيرة (> 600 مم³). الميلانين أثر ضرب على كفاءة فوتوكونفيرسيون: فوتوكونفيرسيون الحد الأقصى ل CD45⁺ الخلايا داخل الميلانين المنتجة B16. أورام F10 فقط حوالي 30 في المائة وانخفض إلى 10 في المائة كما الأورام بلغت كميات من 400 مم³. من المثير للاهتمام، خلايا تحليل intratumoral CD8⁺ تي فوتوكونفيرسيون كشف الفعالية لهذه الخلايا في حوالي 80-90% في الأورام الصغيرة بغض النظر عن إنتاج الميلانين (3D الشكل). للأورام أونبيجمينتيد، CD8⁺ تحويل خلية T ظلت عالية حتى وأن الأورام بلغت كميات كبيرة، ولكن انخفضت إلى حد كبير مع الحجم عندما حضر الميلانين. عليه، فإن فائدة B16. F10 مورين الأورام الخبيثة، وخطوط سرطان الجلد الميلانين المنتجة الأخرى، قد تكون محدودة للأورام الصغيرة (³من 50 مم)، وما يتسق مع الوظيفة البيولوجية الميلانين في امتصاص الضوء. لتقييم الاستجابة الالتهابية المرتبطة فوتوكونفيرسيون للأورام، ونحن كمياً عدد CD45⁺ الخلايا في الأورام غير المحولة وأورام المحولة ح 24 وظيفة فوتوكونفيرسيون (رقم 3E). رأينا لا يوجد فرق كبير في مجموع إعداد CD45⁺ الخلايا التي تكتشف في الأورام 24 ساعة عقب فوتوكونفيرسيون مقارنة بالأورام غير محولة.

نحن كمياً بعد خروج الكريات البيض من ورم ميكرونفيرونمينتس باستخدام الفئران كايد تيمبل، الذي يسمح باستجواب سلوك الاتجار بالأشخاص من كلا النوعين النقوي واللمفاوية خلية. تم زرع الخلايا السرطانية MC38 أو YUMM 1.7 إينتراديرمالي في الفئران كايد تيمبل. كانت الأورام فوتوكونفيرتيد مجرد وحدات التخزين التي تم التوصل إليها بين 100-150 ملم³ (5 دقائق، 200 ميغاواط)؛ جمعت دلنس عضدي ولنس الآربي غير تجفيف 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون. تم قياس كمية السكان الكريات البيض إينتراتومورال من MC38 وأورام YUMM 1.7 مزروع في مكافحة الفئران C57Bl/6 وجمعها مرة واحدة الأورام بلغت 100-150 ملم³. نحن تقييم تعقيد الكريات البيض داخل الأورام والسكان اجريسيد بالتدفق الخلوي: خلايا تي (CD3ε⁺CD4^+/-CD8^+/-)، خلايا ب (CD3ε^–CD19⁺)، وحدات تحكم المجال Dc (CD11c⁺مهسيي⁺CD11b^+/- )، العَدلات (CD11b⁺مهسيي^–Ly6G⁺)، الضامة (CD11b⁺مهسيي⁺⁺F4/80)، والتهاب وحيدات (CD11b⁺Ly6G^–Ly6C⁺؛ الشكل 4A). استخدام هذا المخطط النابضة نفسه، يمكننا تقييم عن النسبة المئوية لكل السكان الكريات البيض في دلنس التي أعرب عنها كايد الأحمر يشير إلى الإقامة السابقة في ورم ميكرونفيرونمينتس (الشكل 4 باء). من المثير للاهتمام، في حين كلا MC38 (الشكل 4) والأورام YUMM 1.7 (الشكل 4) وقد تسلل أساسا مع الخلايا النقوي (وحيدات، وحدات تحكم المجال Dc، والضامة)، وحوالي 50% الخلايا التي قد اجريسيد من كلا النوعين الورم تي الخلايا الليمفاوية (CD4 كلا⁺ و CD8⁺). بالإضافة إلى خلايا تي، لاحظنا أيضا وحدات تحكم المجال Dc، ب الخلايا، وكان لم يتم الكشف عن وحيدات داخل السكان اجريسيد من الأورام ولكن الضامة والعدلات من أي نوع الورم. بالإجمال، يوضح هذه البيانات الأداة المساعدة كايد تيمبل فوتوكونفيرتيبلي الفئران لتتبع الأنساب الكريات البيض متعددة في بيئة محلية. وعلاوة على ذلك، تحليلنا تشير إلى أن خروج عملية انتقائية، النشطة قد تكون لها آثار هامة لتحديد إينتراتومورال الكريات البيض التعقيد.

رقم 1: فوتوكونفيرسيون الكفاءة والمرتبطة التهاب في الجلد مورين. مورين الأدمة وكان فوتوكونفيرتيد لمدة 3 دقائق على 100 ميغاواط (405 نانومتر الضوء). (A) تدفق الممثل مؤامرات تصف فوتوكونفيرتيد (الأحمر كايد⁺) CD45⁺ الخلايا من الإذن غير المحولة والمحولة وفور فوتوكونفيرسيون دلن عنق الرحم. السكان كانوا قبل بوابات على العيش، CD45⁺ واحدة من الخلايا. (ب) بتعداد إجمالي CD45⁺ الخلايا في آذان غير محولة (-)، وآذان جمعها مباشرة عقب فوتوكونفيرسيون، آذان جمعت 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون، وآذان جمعت 24 ساعة بعد الإصابة فاكف (n = 3). (ج) أجرى المقايسة "ألف ميل" للتحديد الكمي للأوعية الدموية يجتازها مباشرة بعد التعرض إلى 405 نانومتر الضوء (3 دقيقة، 100 ميغاواط). صورة تمثيلية للتسرب في الإذن الجلد (يسار) والتحديد الكمي لصبغ المستخرجة (يمين) (n = 3). أشرطة الخطأ تمثل sem. *ف< 0.05 و * *ف< 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: خروج العاصمة من السذاجة، ملتهبة، وإصابة الجلد. (أ) جاتينج مخطط لتحديد وحدات تحكم المجال Dc المهاجرة (مدكس؛ مهسيي^مرحباCD11c^int) والمقيمين DCs (نسق؛ مهسيي^مرحباCD11c^مرحبا). (ب) تدفق الممثل المؤامرات التي تشير إلى فيتك⁺ أو الأحمر كايد⁺ وحدات تحكم المجال Dc، بوابات مسبقاً على مدكس، من الفئران المصابين فاكف (دلن) أو LN كونترالاتيرال غير استنزاف عناصر التحكم. (ج) التحديد الكمي لإعداد كايد أحمر⁺ ومدكس فيتك⁺ ونسق في دلنس حالة ثابتة وأفرجا ملتهبة (24 ح تطبيق وظيفة)، وفاكف إصابة الجلد (48 ساعة بعد الإصابة). أشرطة الخطأ تمثل sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: فوتوكونفيرسيون الكفاءة في الورم ميكرونفيرونمينتس- كانت الأورام فوتوكونفيرتيد لمدة 10 دقائق في 200 ميغاواط (405 نانومتر الضوء). (أ) قطع تدفق الممثل كايد الخضراء والحمراء في الأورام MC38 غير المحولة والمحولة وعضدي دلن فور فوتوكونفيرسيون كايد. السكان كانوا قبل بوابات على العيش، CD45⁺ خلايا مفردة. (ب) ميكروكوبي الفلورة المجمدة، وجزءاً لا يتجزأ من أكتوبر YUMM 1.7 الأورام كلا غير المحولة وفوتوكونفيرتيد. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (ج) كفاءة التحويل من CD45⁺ الكريات البيضاء و CD8 (د) ⁺ الخلايا الليمفاوية في إنتاج الميلانين (B16. F10) والزغب (MC38، YUMM 1.1، YUMM 1.7). وتمثل كل نقطة ماوس واحدة. (ه) بتعداد إجمالي CD45⁺ الخلايا في الأورام غير المحولة والأورام فوتوكونفيرتيد جمعت 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون (n = 3). أشرطة الخطأ تمثل sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: خروج الكريات البيض من ورم ميكرونفيرونمينتس ليست انتقائية. (أ) جاتينج مخطط لتحديد السكان النقوي واللمفاوية في دلنس MC38. (ب) يرسم تدفق الممثل تحديد الخلايا كايد أحمر⁺ بين الخلايا اللمفاوية والنقوي في MC38 دلنس ح 24 بعد فوتوكونفيرسيون. النسب المئوية في قطع تدفق الإشارة إلى تواتر كايدى أحمر⁺ الخلايا ضمن السكان الكريات البيض الأصل المشار إليه في لنس- (ج، د) نسب intratumoral النسبي (% من CD45⁺ الخلايا) واجريسيد (الخلايا الحمراء كايدى⁺ %؛ الكريات البيضاء دلنس عضدي) من MC38 (C، n = 3) و YUMM 1.7 (د، ن = 4) الأورام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

على الرغم من أن خروج الكريات البيض من الأنسجة المحيطية، غير اللمفاوية أمر حاسم لبدء والقرار من الاستجابات المناعية، هي غير مفهومة الآليات الجزيئية التي تنظم متدفقة. هذه الفجوة في المعرفة إلى حد كبير بسبب توفر أدوات للقياس الكمي في فيفو. هنا، يمكننا وصف استخدام الفئران فوتوكونفيرتيبلي (تيراغرام كايد) التحديد الكمي لخروج الكريات البيض الذاتية من الجلد والأورام، وتوفر مقارنة مباشرة وجها لوجه مع الطلاء فيتك في التهابات وعدوى نماذج. وعلينا أن نبرهن أن بينما تتبع كلا النموذجين الذاتية DC السكان، الصرف الحرة فيتك وسوء امتصاص الخلايا غير متجولة يحد من الأداة المساعدة فيتك الطلاء لتحليل واسع النطاق لخروج النقوي والليمفاوي من الأنسجة غير اللمفاوية، والأجهزة الطرفية، بما في ذلك الأورام. وعلاوة على ذلك، نقدم البيانات التي تشير إلى الخروج من الأورام انتقائية بدلاً من العشوائية مما يؤكد الاستنتاجات التي قدمها تورسيلان et al. ³⁹-قد تكشف عن مواصلة التحقيق في الآليات التي تحكم خروج الكريات البيض من الأورام رواية ثاقبة التهاب المرتبطة بورم والحصانة.

نحن أولاً تقييم كفاءة فوتوكونفيرسيون في الجلد مورين وأثره على التهاب المحلية عند استخدام إعدادات ذكرت في الأدبيات. تعرض أذنيه للبنفسجي خفيفة لمدة 3 دقائق في 100 ميغاواط طاقة أسفرت عن كفاءة فوتوكونفيرسيون من CD45⁺ الخلايا داخل الجلد الإذن (78 في المائة) مع عدم التحويل في دلنس المتلقين للمعلومات. وتبين التقارير في الأدب التعرض دقيقة 3-5 الأمثل للأنسجة الجلدية^5،،من³³³⁸. بيد أن هذا التعرض أدت إلى زيادة في إعداد CD45⁺ الخلايا في الإذن بينا 24 ساعة بعد التحويل، ويستحث تسرب الأوعية الدموية مما يشير إلى أن فوتوكونفيرسيون في هذه الإعدادات في جلد الإذن التهاب المحلية، التي ينبغي النظر فيها عند تفسير البيانات. التالي سعينا إلى مقارنة DC الاتجار إلى لنس باستخدام فوتوكونفيرسيون كايدى وأوسع استخداماً فيتك الطلاء المقايسة^23،24 في حالة مستقرة، أثناء الالتهابات الناجمة عن دبة، ومن آذان فاكف إصابة مباشرة. لاحظنا العلامات المرتفعة في فيتك معاملة مقارنة بالجلد فوتوكونفيرتيد في حالة مستقرة والمعاملة افرجا التالية. فيتك مجاناً للجلد يمكن أن يسفر تطبيق الصرف المباشر عبر الأوعية اللمفية إلى استنزاف لنس حيث المقيم سكان العاصمة، التي لا يتم ترحيل (مثلاً.، CD8α⁺ DCs)، عينة فيتك. واتساقا مع ذلك، لاحظنا عددا كبيرا من نسق مع التسمية فيتك عندما تعامل مع دبة مهيجة. على النقيض من ذلك، كايد الأحمر المسمى وحدات تحكم المجال Dc فقط لوحظت في حركة التغيير الديمقراطي في أعقاب السكان فوتوكونفيرسيون مشيراً إلى أن فوتوكونفيرسيون يوفر طريقة أكثر تحديداً لتسمية مدكس. حتى داخل السكان حركة التغيير الديمقراطي، ومع ذلك، لاحظنا مدكس كمياً المسمى أكثر عند استخدام فيتك عبر فوتوكونفيرسيون. في حين قد يفسر هذا أيضا بالحرة فيتك الصرف، فمن الممكن أن الاختلافات في فترة وضع العلامات، حيث فوتوكونفيرسيون يمكن فقط تسمية وحدات تحكم المجال Dc حاليا المقيم في الجلد بينما فيتك يبقى في الجلد لمدة فترة 24 ساعة ، تستأثر بالاختلافات في خروج لوحظت حركة التغيير الديمقراطي. من المثير للاهتمام، في سياق العدوى الفيروسية، فوتوكونفيرسيون وتطبيق فيتك قياس مستويات متساوية نسبيا من خروج حركة التغيير الديمقراطي ونسق فيتك⁺ القليلة في لنس تجفيف الأذنين المصابين فاكف. ونحن مؤخرا أفادت أن اللمفاوي العدوى فاكف التالية انخفاضا كبيرا، وبالتالي انخفاض الفيروسية الناجمة عن النقل اللمفاوية قد يحسن خصوصية الطلاء فيتك وخفضت وسم LN السكان المقيمين DC³¹ . الأهم من ذلك، يسلط هذا العمل الضوء أيضا على الحقيقة أن ضمن السكان حركة التغيير الديمقراطي (CD3ε^–CD19^–مهسيي^مرحباCD11c^int)، هو عدد وحدات تحكم المجال Dc التي تم ترحيلها بنشاط داخل ح 24 سكان البسيطة، وبالتالي إجمالي حركة التغيير الديمقراطي أرقام لا بديل جيد للهجرة النشطة⁴¹. وأخيراً، من المثير للاهتمام أن نلاحظ أننا دائماً قياس الخروج حركة التغيير الديمقراطي في حوالي 200 من الخلايا لأي ح 24 المعطى الفترة التالية فاكف العدوى⁴¹، أثناء خروج 1500-2000 DCs من ورم ميكرونفيرونمينتس. نظراً لفعالية هائلة من فاكف كمنصة لقاحات، لا سيما عند تطبيقها بتشريط^45،،من⁴⁶⁴⁷، أنها مثيرة للاهتمام التكهن بأنه من نوعية وحدة تحكم المجال DC وربما نوع DC عرض مستضد، بدلاً من الكمية، التي تحدد قوة الحصانة الواقية.

خروج الكريات البيض من الورم ميكرونفيرونمينتس، خارج وحدات تحكم المجال Dc^25،48، ما زال يشكل مجالاً التحقيق سيئة. على الرغم من أن تعتبر الأورام ميكرونفيرونمينتس التهاب مزمن، عما إذا كان تنظيم آليات مماثلة الخلوية الخروج من الأنسجة غير خبيث والخبيث لا يزال غير معروف. وعلاوة على ذلك، ما إذا كان خروج الكريات البيض من الأورام العشوائية انتقائية أو بالأحرى ستترتب عليها آثار كبيرة لتفسير تراكم الكريات البيض والاحتفاظ بها في ميكرونفيرونمينتس الورم. على هذا النحو، قد تكون حاسمة لفهم كيفية التهرب من الأورام مراقبة محصنة ضد خروج الكريات البيض من الأورام ويؤدي إلى استراتيجيات جديدة للعلاج المناعي. هنا نقوم بتطبيق نموذج فوتوكونفيرتيبلي تيراغرام كايدى لدراسة الكريات البيض الخروج من الأورام الجلدية القابلة للغرس، حيث الطلاء فيتك لن تكون كافية لتسمية عامة السكان النقوي واللمفاوية على حد سواء. كشفت الدراسات الأولية أن الكفاءة فوتوكونفيرسيون في أورام مزروع كانت تعتمد على حجم الورم والميلانين على حد سواء. بينما الكفاءة فوتوكونفيرسيون تنخفض سرعة نمو الأورام عند وجود الميلانين (B16. F10)، يحمل خطوط غير مصطبغة الورم مثل الأورام YUMM و MC38 أكثر استقرارا من كفاءة التحويل عبر أحجام الورم اختبارها. من المثير للاهتمام، لاحظنا كفاءة التحويل المحسنة في CD8⁺ حجرة خلية T بالمقارنة مع CD45⁺ الخلايا التي انخفضت كزيادة في حجم الأورام. وهناك احتمال عدة عوامل تسهم في هذه الملاحظة. أولاً، سوف تؤثر الموقع داخل ورم التعرض، وبالتالي كفاءة التحويل لأنواع معينة من الخلايا. خلايا تي توجد غالباً ما تقتصر على واجهة الجلد-الأورام في النماذج القابلة للغرس الورم وهكذا قد يكون أكثر سهولة من فوتوكونفيرتيد بالنسبة إلى الخلايا النقوي تسلل حمة الورم. ثانيا، ليس كل الكريات البيضاء التعبير عن نفس مستويات البروتين كايد⁴⁹ وبالتالي قد لا جميعا على قدم المساواة الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي؛ قد يؤدي هذا إلى انخفاض نسب المشاهدة من فوتوكونفيرسيون عند تحليل سكان خلية غير متجانسة أكثر مثل CD45 جميع⁺ الخلايا. وأخيراً، من المهم ملاحظة أن البيانات المعروضة في الشكل 3 دقيقة 10 التالية التي تم إنشاؤها من التعرض للضوء فوق البنفسجي. واختير هذا الوقت التعرض الأولى استناداً إلى التقارير في الأدب نقلا عن أوقات فوتوكونفيرسيون للأجهزة المختلفة بما في ذلك الجلد ولنس والأنسجة المخاطية والأورام^5،،من^{633،35 ،،}من³⁹⁴³. فقط الدراسة الأخرى تستخدم نظام فوتوكونفيرتيبلي في الأورام، وأجرى فوتوكونفيرسيون عن 20 دقيقة³⁹. وكشف المزيد من التحسين في أيدينا تحسين الكفاءة مع وقت تعرض لتقصير مدة 5 دقائق للكميات الصغيرة والكبيرة على حد سواء. فمن المحتمل أن التعرض لفترة طويلة يؤدي إلى فوتوبليتشينج الأسفار كايد، وعلى هذا النحو، قد يكون لدينا كفاءات التحويل المبلغ عنها حقيقته. التعرض لفترات طويلة قد يؤدي إلى زيادة التهاب المرتبطة فوتوكونفيرسيون أيضا، والخلط بين نتائج الدراسة. الأورام فوتوكونفيرتيد لمدة 5 دقائق أظهرت الخلايا لا يوجد فرق كبير في عدد intratumoral CD45⁺ 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون مقارنة بالأورام غير محولة. بالإضافة إلى ذلك، أثبتت فوتوكونفيرتيد الأورام لمدة 5 دقائق خروج قابلة للقياس واستنساخه للسكان النقوي واللمفاوية على حد سواء. ونتيجة لذلك، الأمثل الفردية داخل أنسجة محددة أو الأورام الاهتمام اللازم لتحقيق نتائج مثلى.

وأخيراً، كنا في الموقع فوتوكونفيرسيون التحديد الكمي لخروج الكريات البيض الذاتية من الأورام مزروع في الفئران كايدى تيراغرام. استخدام اثنين من نماذج مختلفة من الأورام القابلة للغرس، وغير مصطبغة لاحظنا خروج كبيرة من وحدات تحكم المجال Dc، خلايا تي، ووحيدات. تمشيا مع العمل المنشورة مؤخرا³⁹، سواء CD4⁺ و CD8⁺ تي اجريسيد خلايا من الورم ميكرونفيرونمينتس جنبا إلى جنب مع عدد كبير من النفي المزدوج CD3ε⁺ تي الخلايا. على الأقل، قد يكون عنصر واحد من هذه الفئة من السكان جاما دلتا تي الخلايا كما هو موضح سابقا³⁹، على الرغم من أهمية هذه الملاحظة الفنية ما زال يتعين تحديد. الأهم من ذلك، عندما قارنا نسب الكريات البيضاء اجريسينج من الأورام إلى الارتفاع النسبي للكريات البيضاء موجودة داخل ميكرونفيرونمينتس الورم، لاحظنا تخصيب الكريات البيض في اجريسيد السكان بالنسبة إلى تجمعات intratumoral في كلا النموذجين تشير إلى خروج الكريات البيض انتقائية. جدير بالذكر أن تغيب الضامة والعدلات في السكان اجريسيد، على الرغم من كل أنواع الخلايا قد وصفت للخروج تحت ظروف ملتهبة والمصابة^2،50،،من^{5152 , 53 , 54} وهي إسهاما كبيرا في intratumoral الكريات البيض مبدع^39،،من⁵⁵⁵⁶. وهكذا، خروج الكريات البيض من الأورام يمكن قياسها كمياً باستخدام نماذج فوتوكونفيرتيبلي، وليست العشوائية ولكن بدلاً من ذلك عملية تنظيم، ولا يزال علم الأحياء الهامة والمداريين مع آثار هامة لفهم التحريضية و ديناميات محصنة في ميكرونفيرونمينتس ورم في حالة مستقرة، واستجابة للعلاج.

الكتاب على لا تعارضات بالكشف عن.

الكتاب يود أن يشكر الدكتور ماركوس بوثينبيرج لتوفير YUMM 1.1 و YUMM 1.7 الميلانوما مورين خطوط والدكتورة ديبورا ج. فول لتوفير B6. Cg-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr الفئران باﻻتفاق مع BRC بتبريد عن طريق بيو الموارد الوطنية من يأمرون، اليابان.