パラフィン セクションの埋め込み膵島

前のヴィヴォ膵研究、糖尿病研究のため重要です。ネイティブ 3 d アーキテクチャで培養膵島を研究する既存の技術は、時間がかかり、非効率的で、使用頻度の低いです。この作品は、全体培養膵島の高品質パラフィン セクションを生成するための新しい、シンプルで、効率的な方法を説明します。

単離膵島を用いた実験は糖尿病の研究のために重要が、小島が高価で限られた豊かな。島を含む構造化されたアーキテクチャでは、関数に影響を与える混合セル人口、膵島広く細胞組成の変数です。培養膵島の研究が現在頻繁に使用される方法には、全体の島、客種異種膵島細胞の種類、一緒にまたは顕微鏡または分散膵島細胞の分子生物学の研究膵島建築を中断することで実行される分子の研究が含まれます。膵島研究生体内で膵臓のパラフィン包埋切片、細胞特異膵のネイティブ環境での成果を評価する強力な手法です。パラフィン切片で後文化島を勉強していくつかの利点を提供すること: 同じ島 (潜在的にも、正確な同じ島、連続切片を使用して)、セル型固有の測定維持するネイティブの複数の結果の検出膵島細胞間や細胞-基質間相互作用実験の露出の間におよび分析。ただし、埋め込みの既存技術は島後文化非能率的な時間のかかる、材料の損失になりやすいと一般的に役に立つ成果を定量化するために不十分な膵島番号を持つセクションを生成を分離しました。臨床病理学研究室細胞ブロック準備設備、アクセスできないと基礎研究所の実用的ではないです。堅牢な収量と膵島の分布のセクションを生成する改良、簡易ベンチ上メソッドを開発しました。固定の島は暖かい組織 agarose のゲルで再停止される、小島、飛行機で配布するように標準的なガラスのスライドでは、平らなディスクに戻します。標準的な脱水と埋め込み後、(10 +) 4-5 μ m 複数のセクションを同じ膵島ブロックからカットできます。このメソッドを使用して、マウス、ラットおよびヒト膵島の組織学的および免疫蛍光分析を実行できます。これ培養膵島から細胞型特異、そのまま建築の成果を評価するために効果的な安価な時間の節約方法です。

膵臓ランゲルハンス島、インスリンを循環の唯一のソースは、糖尿病を勉強して研究者のための重要な組織です。任意の特定の生物から可変サイズ、セル型の頻度、およびアーキテクチャ^1,2,3島があります。体内構造と膵島内分泌細胞組成を研究する従来の戦略は、膵臓組織^4,5をしきますです。以来、島は、合計膵細胞内容のごく一部を構成する、分子の研究は膵島で行われます。前のヴィヴォ膵島培養実験栄養素への応答、遺伝子の調節 (トランスフェクション、伝達)、または実験的治療内分泌細胞の生存・増殖・機能調節のメカニズムの重要な洞察を提供します。^5,6。

膵島実験前のヴィヴォしばしば全体の島の分子研究または単層^5,6で育った分散した膵島細胞の組織学的または分子の研究を使用して分析されます。全体の島の分子解析は、混在の細胞の種類は、任意の個々 のセル型に外挿する場合、偽陰性や偽陽性の結果が生じるの深刻な注意点を紹介します。後文化顕微鏡用カバーガラス上細胞分散細胞型特異結果測定できますが膵島建築介入への応答を変更することが、アーキテクチャ関連の成果の同定を排除します。通常の 1 つの結果だけ加えてを測定ことができる;たとえば、β 細胞の増殖と同じ条件下での β 細胞死を測定、2 つの個別の実験を実行する必要があります。これらのアプローチは、ブラインド間島変動、フィールドで注目のエリアにいます。細胞タイプ特異分子研究、または単一細胞 RNA 研究のフローサイトメトリーによる並べ替えの膵島細胞、組織の豊富なアーキテクチャの根絶とルーチンの携帯文化の分析にはあまり適していませんが高価、時間のかかる、限定がエレガントです^5,7. 全体マウント immunostained 島の共焦点レーザー顕微鏡は高品質建築そのままのデータを提供しますが労働集約的、各サンプルから得られたデータは単一染色⁸で個人の成果に限られます。

後文化全体の島の高品質パラフィン セクションを生成する機能は、これらの懸念の多くに対処でしょう。高コスト、低豊富な膵島組織や人間の臓器提供者、または島の状態ポストの生体内または体外実験操作、ユニークな遺伝モデルから、貴重です。同じ島から複数のパラフィン切片を取得同じ実験から複数の細胞型特異、そのままアーキテクチャ解析できるようになります。

区分のための膵島のペレットを生成する既存の技術は完璧ではないです。組織に最適化されたアガロースはプロセス⁹しにくい小さなまたは断片化された組織サンプルを含む組織・細胞診標本の処理に広く使用されている水性低融点ゲルです。アプローチを埋め込み 1 膵島を微量遠心チューブに agarose の小島を中断、材料をペレット、寒天プラグを取得し、処理し断面^10,11の埋め込む遠心分離機です。チューブの底から固化したサンプルを抽出は時間がかかり、困難なサンプルの時折の断片化とけがのリスクに 。小島はこのメソッドから取得したセクションで不十分な膵島の分布につながるプラグの先端に集中しています。プラグの丸底は、膵島の貧しい地域に区分を行うことなどを埋め込むことを複雑にします。全体的にみて、このメソッドは低降伏点と結果のセクションで周辺固定支持の膵島の分布に します。

この新しいメソッドは、膵島のセクションの準備のため簡体字および改善されたアプローチです。小島は少量で集中して、単一の平面を島と、小さなディスクを形成する顕微鏡スライドの滑らかな表面を配置します。Histogel 膵島ディスク短縮脱水とキシレン浸潤プロトコルを埋め込むパラフィンの処理が行われる。および microfuge の管の底に島を集中して、前のアプローチは、比較としても行われます。この新しい技術は各セクションで、膵島の分布セクションあたりの小島の収率が向上し、カセットに膵島ブロックを転送する時間がかかります。この手法は、膵島の生物学者のまたはそのネイティブの組織アーキテクチャの 1 つのサンプルに複数の結果を測定することによって低豊富な組織の生産性を最大化する希望組織の小片を勉強して他の科学者を使用しています。

動物を含むすべてのプロシージャは、マサチューセッツ州立大学付属学校機関動物医療および使用委員会によって承認されました。ヒトの膵島の研究は、被験者の使用を伴わないため IRB 審査または免除の対象とならないように UMass 制度審査会により決定しました。

1. 膵島の分離と培養

1. 島を分離し、あなたの選択法を用いた膵外分泌と膵組織を汚染から分離します。
   注: このメソッドは、コラゲナーゼ管注入と Ficoll 分離¹² (齧歯類) または統合された膵島配布プログラム (IIDP¹³; 人間) から出荷後島によって分離島を使用して最適化されました。小島は、P200 ピペットで抜てきされました。
2. 膵島の形態を最適化するため一晩中 10 mL 完全な膵島 (10 %fbs、ペニシリン/ストレプトマイシン、5.5 モル/L のグルコースと RPMI) 37 ° C で 5% CO₂を含む加湿チャンバー内を回復する島を許可します。この手順は、セクションを取得する必要はありません、小島がよりそのまま回復期間後 (図 2参照)。

2. 膵島固定

1. 低結合 p200 でもヒントを使用すると、約 250 のアイレット同等 (IEQ)¹³ 1.5 mL 低結合および microfuge の管に顕微鏡下で校正グリッドを使用して手で摘みます。低結合ヒントやチューブは、膵島の損失を減らします。
2. および microfuge の管の底に沈殿する島を許可します。任意の小島を削除しないように注意して、P200 ピペット先端部とほとんど上清を除去します。
3. 1 mL の PBS を追加します。速度 200 x g に達するまでスイング バケツ遠心管を遠心し、スピンを停止します。上澄みを除去します。2 洗浄の合計のため PBS 洗浄を繰り返します。
4. 10% ホルマリン溶液や焼きたての 4% のパラホルムアルデヒドの 500 μ L を追加します。30 分間室温で修正します。この方法でテストした結果、これらの固定方法は区別されました。短い固定も可能します。所期の固定期間を最適化することをお勧めします。
5. P200 ヒントと定着剤を削除します。
6. 1 mL の PBS を追加します。速度 200 x g に達するまでチューブを遠心し、スピンを停止します。上澄みを除去します。2 洗浄の合計のため PBS 洗浄を繰り返します。
7. 次のステップに進んでください。

3. 膵島ディスク (図 1) の準備

1. 初回の使用で 70 ° C で (例えばHistogel) のゲルを溶かす、1.5 mL 長期貯蔵のための microfuge の管で因数を作る。因数は再利用することができますので、分注量は、重要ではありません。
2. 70 ° C に設定ヒート ブロックのゲルの因数を含むおよび microfuge の管を配置することによって 70 ° C でゲル (1 サンプルあたり約 100 μ L) を温める
3. 1.5 mL きれいおよび microfuge の管に青いアガロース ビーズ (サンプルごとに 10 μ L) を転送します。徹底的にピペットで移す前に、ビーズを再懸濁します。
   注: 青いビーズ混合される agarose ボタンとパラフィン ブロックの埋め込み材料の視覚的な識別を支援する島。青ビーズの数が結果に重要ではありませんが、過剰なビーズを避けるため (> 小島の数 × 5) のセクションで小島の最適な配分を許可します。
4. 1 ml の PBS、青いビーズを 2 回洗います。各洗浄のため 800 × g で 1 分ビーズをスピンします。第 2 洗浄後 10 μ L の PBS、 nはサンプル チューブの数 x (n+2) のビーズを再懸濁します。たとえば、2 のサンプル チューブ、ビーズに追加する PBS のボリュームは 40 μ L でしょう。
5. 小島 (200 x g 簡単なスピン) を含むおよび microfuge の管を遠心し、上清のほとんどを取除きます。はさみや刃物で 10 μ L マイクロ ピペット チップの先端を切断し、各サンプルのきれいヒントを使用して、各膵管にビーズの 10 μ L を追加します。(島を失うことを避けるため) に混在させないでください。
6. 小島とビーズ (200 x g 簡単なスピン) を遠心します。ノーカットの 10 μ L マイクロ ピペット チップで可能な限り多くの PBS を削除します。
7. 顕微鏡スライド サンプル識別用ラベルです。2、3 のサンプルは、各スライドに用意できます。温めたジェルをヒート ブロックの近くのベンチにスライドを配置します。カミソリやハサミでサンプルごとの 20 μ L 低結合マイクロ ピペット ヒント 5 対 3 のヒントをカットします。マイクロ ピペット P20 2 急速な他に 1 つからの切り替えを許可するカットのヒントを読み込みます。
8. 温かいゲルの 15-20 μ L を加える最初のマイクロ ピペットを使用して、小島/ビーズおよび microfuge の管;すぐに混合、バブルを回避します。寒天/小島/ビーズ混合液をフォームにスライドに適用して、< 1 cm 径ディスク。外側のゲルのリングのためのスペースを残して、スライドの端の近くのディスク (次の手順)。優しく数回のスライドをタップすると、島とビーズを解決します。
9. 2 番目のマイクロ ピペットを使用して、サンプル チューブに温かいゲルの 20 μ L を追加します。スライドに元のディスクを取り巻くこの混合物を適用し最初マイクロ ピペット、ミックス、残り島/ビーズ、再熱ブロック地球温暖化固化、起動する場合新しいゲルを使用して。ディスクが必要な大きさと厚さになるまで、カット済みの追加のヒントを使用して、必要に応じて繰り返します。
   注: は、外リングはわずかにより厚い場合、簡単にゼリー化したディスクの処理です。通常、ゲルの 3 x 20 μ L で十分です。この手順はチューブ洗浄によって島の損失を最小限に抑えるし、ディスクの処理を容易にするためにディスクの外側に膵島の貧しい agarose を追加します。
10. 各ディスクを個別に用意し、各スライドに複数のディスクを配置する場合サンプル順序の慎重な追跡。
11. 10 分または凝固するゲルまで、カバー付きのぬれた氷の平らな面にスライドを配置します。それはガラスからディスクをスライドに乾く場合に難しくなります。
12. 鉛筆で、1 つのサンプル処理/埋め込み組織カセット ラベル生検。青い紙の湿潤を避けるためにスライドの背面を乾燥させます。
13. ガラスから自由に各方向にディスクをかみそりの刃の鈍いエッジを使用して、軽く押します。それは簡単にスライド、するとき青い画用紙に顕微鏡のスライドからディスクを押しゆっくりと。ディスク、平らな面を用紙に直接配置します。
14. 用紙カセットを移動しないように、ディスクをカセットに折り畳まれた紙に置いて閉じたりするディスク、ディスク、平らな折目を維持します。ディスクきれいにガラスをスライドされない場合より多くのゲルを追加および/または氷の数分以上のためにスライドを取得します。
15. ビーカーに PBS でカセットが水没します。同じ日に最適な形態を埋め込むパラフィン プロセス。

4. パラフィン包埋

注: 下記のとおり短縮脱水シリーズを使用してパラフィン ブロックにアイレット ゲル ディスクのプロセス。このテクニックは、自動のプロセッサを使用して最適化されたが、手動処理が同様の結果を生成する必要があります。

1. 15 分の 85% のエタノールでカセットを浸します。
2. 95% エタノールでカセットを 15 分間浸します。
3. 100% エタノールでカセットを 15 分間浸します。3 つの洗浄の合計に 2 回繰り返します。
4. キシレンのカセットを 15 分間浸します。3 つの洗浄の合計に 2 回繰り返します。
5. 溶融パラフィン カセットを 10 分間浸します。
6. 10-30 分の新鮮な溶融パラフィンにカセットを転送します。
7. 慎重にカセットを開き、青い紙の包みを開けます。紙に反対した平らな面の追跡、ゲルのディスクを削除します。小さい金型でダウン、切削表面に平行な (膵含む) 面とディスクを埋め込みます。プラグインのため慎重にカセットからそれを削除し、切削表面に向かって指している先端の小さな金型内に埋め込みます。

5. パラフィン切片と染色

1. シリアル セクションが必要な場合は、スライドを順番にラベルします。
2. 経験豊富な histotechnologist カット 5 μ パラフィン セクションがあります。収量を最大にするには、物質を含むすべてのセクションを保存します。一般的には、20 のセクションを収集、材料のほとんどのキャプチャをことができます。
3. 室温でのセクションを格納します。セクションは、ルーチンの組織学的汚れ (例えば、 H & E) や蛍光抗体法 (例えば,インスリン, グルカゴンおよび DAPI) に適しています。必要な場合は、他の抗原の固定を最適化します。

ゲル ディスクを準備する手順の図解図を図 1に示します。このゲル ディスク メソッド結果結果の意味のある定量化できるように 1 つの平面に分布する島の十分な数を含むパラフィン セクションで。図 2は、島セクションごと捕獲数を示すために結果として得られるセクションの低倍率の画像を示しています。一般に、> 35 小島が各セクションで表示される 250 IEQ は、手順については、使用されたとき、> 小島を含む 10 のセクション (4-5 μ m) が各サンプルから得られました。島のプロシージャの使用数を増加すると、セクションの島の数。セクションの島の構造的に多様化され、サイズを変える、新しいコンセプトの興味深いデータは膵島間違いに盲目のテクニックではなく、セクションを使用して取得することがあります。メソッドは同じように働いていた研究室 (ラット、マウス)、出荷後、IIDP 受けた膵島を分離された齧歯動物の島のためによく。齧歯動物島はした後分離復旧丸みを帯びた表面が滑らかな、膵島の中で一晩、球面形状 (図 2A) をコンパクトに著しくよりそのままの形態。小島は既に出荷前に隔離ストレスから回復したので、一晩出荷後の回復後おそらく埋め込まれている場合や到着日の埋め込まれている場合、ヒトの膵島の形態が似ていた。チューブ法は、より小さい組織断面積は、各セクションが少ない島で得られたし、密集島とビーズ (図 2B)。図 2Bに示すようにマイクロ チューブ イメージだったこのメソッドで取得することができましたサンプルの 1 つはのセクションの最初のセットで小島が見つかりませんでしたのでより多くのセクションをカットに送信しなければならなかった。

この手法については高品質の島セクションを生成する組織と蛍光染色 (図 3)。インスリンとグルカゴンの染色は、多様な組成と膵島建築の不均一性を示した。セクションは、明確に知られているアーキテクチャの違いを締めくくっているマウスおよびラットの膵島 β 細胞のコアと同様のアーキテクチャを示したに対しの β 細胞とマウスおよびラット島、豊富な α 細胞から成る人間の小島とヒト、混在周囲のアルファ細胞。連続切片が得られる。図 3のパネルは、同じ染色 H 島 & E (左) と蛍光抗体法 (右) のシリアル セクションを表示します。

図 1.アイレット ゲル ディスクを作るための重要なステップのイラスト。ゲル アイレット/ビーズ ペレット(B)を含む低結合および microfuge チューブに転送されます(A)熱ブロック 70 ° C に温めて。小島は温かいゲルで再停止される、ディスク形(C ・ D)で材料を広めるスライド ガラスに転送。追加のきれいなゲルがおよび microfuge の管に転送されますし、残りのすべての素材が削除され、 (E ・ F)スライド ガラスに初期島/ビーズを含むディスク周り円周方向に 。後氷のゲル化、ディスクが譲渡、フラット側停止した組織紙(G)、折り畳まれ、処理のカセット(H)内に配置します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2。ゲル ディスクのパラフィン切片を含む分散島の数が多い。(A)低倍率パネル (40 X、3 x 3 画像 15% のオーバー ラップを一緒にステッチ) マウス、ラットやヒトの膵島セクション H & E 染色を示す多くの小島が各セクションで表示されています。高倍率のくぼみ (200 X) を示す代表的な島。左パネルは分離 (マウス、ラット) または (人間); 出荷直後に埋め込まれた小島のセクションを表示します。右側のパネルは、一晩回復後の文化に埋め込まれた島を表示します。40 倍の画像に見られる淡い青色の円は、埋め込み、区分中の可視化のため含まれているビーズです。これらの特定のサンプル、C57BL/6 n マウス (1 歳)、BBDR のラット (4 週齢)、膵コラゲナーゼ注射および Ficoll の分離によって分離された島と、IIDP から受け取った人間 T2D 島です。(B)比較のための古いおよび microfuge の管手法ごとに埋め込まれた人間の小島の 250 IEQ。低倍率パネル (40 X; 単一 unstitched の映像はすべて素材) 高い等級のくぼみ (200 X) が代表的なセクションを示し。培地は 10 %fbs、ペニシリン/ストレプトマイシン、5.5 モル/L のグルコースと RPMI だった低倍率用スケール バー、1000 μ m;高倍率用スケール バーは、50 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。

図 3.代表組織化学的およびシリアルの島セクションに染色蛍光します。一晩かけて培養された H & E 染色し、明視野顕微鏡によるイメージング後にマウス、ラットおよびヒト膵島のセクションが埋め込まれた (200 X; 左)。DAPI を含むメディア (青) に搭載され、蛍光顕微鏡を用いたイメージング隣接するセクション (緑) (赤) インスリン、グルカゴンの染まっていました (200 X; 右)。スケール バー: 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

この修正のゲル ディスク ベースの埋め込み法は、単純な安価なとセクションごとの島の高収率を生成する効率的な方法を提供します。フラットなガラス面にゲル ディスクを構築する明確に定義された領域に均等に分布拡散小島が容易になります。平らなディスクの小島を広めるセクションの平面の多くの小島を配置、歩留まりの最適化および使用される少ない島の利点を提供しています。ディスクの厚さは、研究者のニーズに合わせて調整できます。複数のセクションを取得することができますので同じ島の連続切片を分析する同じ実験サンプルで測定することができます明確な成果の数を増やします。膵島にここに最適がテクニックは小片、砕けやすい性質、または処理することは困難になる粘性サンプルを含め、他の低豊富な材料に適用でした。このメソッドは、島の新鮮な固定に最適ですし、前に凍結された小島のような材料の他の種類のテストされていません。これらのセクションの DNA または RNA を検出するハイブリダイゼーションアッセイその場で役に立つ場合もあります。2 つの余分なゲル添加が目的: 膵島コレクションを最大にして処理/転送中に中断から膵島の豊富なディスク センターを守るために。薄いゲル ディスクすぐに立体化でき短縮脱水とキシレン浸潤の手順、パラフィン包埋です。セカンダリ コンテナー (および microfuge チューブまたは文化板も) ではなく、平らな面にディスクを形成することで、処理のカセットにディスクを物理的に転送する容易になります。チューブ技術いた小島収量の減少し、非平面組織配置可能性があります作成する膵島を含むのより高い数、膵島の分布を群生ディスク法の結果と比較すると、セクション。

プロトコルの重要なステップには、ティッシュの固定、ゲル ディスク、パラフィン、埋め込み、区分の形成が含まれます。固定に関して H & E とインスリンとグルカゴン、蛍光抗体法によってテストとして有意差 PFA とホルマリン固定時間 10-30 分 (表示されていません) に至るのです。ただし、固定強度と持続時間は、エンドユーザーのニーズに最適化する必要があります。このプロトコルに含まれている主革新はゲル島ディスクの準備図 1は、重要な手順をまとめたものです。重要なステップはゲルの少量を使用して小さな領域に組織を集中するなど区分のため単一の平面に組織を配置する平面上にディスクを形成します。低結合の microfuge の管とヒントとすべてのスピンのスイング バケツの遠心分離機の使用改善組織収量;小島固定後プラスチックに固執します。簡単に目に見えるビーズの追加は、ディスク形成、埋め込み、区分を支援します。ゲルの agarose を希釈することを避けるために重要ですを追加する前に、できるだけ多くの PBS を取り外し、貧しい凝固や紙にディスクを転送する難しさに します。挑戦することができますスライド ガラスから紙にそれをスライドさせながら薄い円盤をそのまま維持します。ディスクにしわがある場合は、元の位置に戻りより多くのゲルを追加、再スライドを寒さのことができます。パラフィン包埋、に関しては、ダウン フラット側および切断の平面に平行にディスクが埋め込まれることが重要です。パラフィン切片の切断を経験した histotechnologist は、材料は、ブロックのリーディング エッジに集中しているのでこのプロシージャの成功に不可欠です。ブロックから過剰な向きは、サンプルの損失につながる可能性があります。青いビーズが表示されますすぐにセクションの収集を開始することをお勧めします。

固定強度と持続時間は、エンドユーザーの特定の組織のニーズ最適化必要があります。サンプルごとに使用される島の数は、必要に応じて変更できます。ただし、出発物質を減らすことが少ない島のセクションを生成します。このテクニックを使って厚くまたはより大きいディスクを生成できます。脱水とキシレン浸潤手順は長く必要があり、最適化する必要があります。結果セクションには、部分的なディスク形だけが含まれている、ディスクはなかった可能性埋め込まれた切断面に平行にすることを検討してください。場合はあまりにもいくつかのセクションを取得すると、技術者から材料の最初のブロックの準備中に失った可能性が。

このメソッドは、固定の膵島組織を含むセクションを生成しなど、組織学的転帰のためのみ使用できます。セクションでは、200-250 IEQ 島の大規模な番号を取得するには、開始材料、挑戦を生成に使用された実験の種類によって。高品質のセクションは、経験豊富な histotechnologist を持っていることに依存しています。

10 + 1 つの実験条件から多くの小島を含むセクションを生成する機能は、実験の効率を向上させる、同じ素材に複数の結果の定量化が許可されます。そのまま島のルーチン分析について少しが現在理解される組織の不均一性、細胞レベルでだけでなく膵島レベルでの理解の進歩につながる可能性があります。他限定豊富な組織サンプルにこの手法を適用する他のフィールドと同様に利点をもたらすかもしれません。

著者の利害の衝突を宣言するあります。

役に立つアドバイスや議論の優秀の UMass 糖尿病センターで β 細胞生物学グループより感謝します。ヒトの膵島は、によって、NIDDK 資金統合島配布プログラム (IIDP) 希望の都市で提供されていました。この作品 NIDDK/NIH によって資金が供給された: R01 DK114686 (LCA)、R01 DK105837 (CY)、2UC4DK098085 (IIDP) し、アメリカ糖尿病協会、アマランサスの順序とのコラボレーションで #1-15-BS-003 (LCA) を付与します。