単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法

デング熱ウイルス記者ウイルス粒子を用いたジカ ウイルス回復期血清による抗体依存による感染症を測定するためのシンプルで簡単なプロトコルについて述べる。

感染症の抗体依存強化は、デング熱ウイルスの病因の主要な役割を果たすことに示されています。許容されない細胞の感染を強化する抗体や血清の容量を測定する伝統的なアッセイは、感染を定量化するプラクの試金に続いてメディアにウイルスの出力を使用してに頼ってきました。最近では、これらの試金は細胞を蛍光標識抗体を用いたデング ウイルス (DENV) 感染症を検討しています。これらの両方のアプローチには、これらの技術の広範な使用を制限する制限があります。ここでは、粒子を用いたデング ウイルス記者ウイルス (RVPs) 緑色蛍光蛋白質及び DENV 感染アカゲザルから得られた血清を用いた抗体依存強化 (ADE) を調べる K562 細胞を表す単純の in vitroアッセイについて述べるニホンザル ジカ (ZIKV) 感染後 16 週間。この手法は信頼性が高く、セルの最小の操作が含まれます、ライブ レプリケーション有能なウイルスの使用を含まない、フローサイトメトリーを用いた定量的な読み出しを取得する高スループット形式で実行することができます。さらに、このアッセイは、黄熱病ウイルス (YFV) 日本脳炎ウイルス (JEEV)、西ナイル ウイルス (WNV) など RVPs の利用など他のフラビ ウイルス感染症の抗体依存強化 (ADE) を調べる簡単に適合できます。アッセイのセットアップのしやすさ、データを分析し、結果の解釈になりますほとんどの実験室の設定に

感染症の抗体依存強化 (ADE) は、ウイルスの血清型による部分的に交差反応性抗体がウイルス、高められたウイルスの複製とウイルス血症につながる他の血清型の取り込みを強化するというプロセスです。ADE は、広く 4 つの主要な血清型が流行しているデング熱ウイルス (DENV) 感染症に記載されています。患者のサブセット、ADE はデング出血熱 (DHF) に関連付けられています。ジカ ウイルス (ZIKV) の感染誘導 DENV ADE体外を引き起こし、DENV生体内でウイルス血症¹の強化に貢献した DENV 交差反応性抗体の有意に高い値であることが最近分かった^,2抗体依存強化試金、関連ウイルスの二次感染を強化とフラビ ウイルス感染症の発症機序に貴重な洞察力を提供し、通知に対する抗体の能力を評価する貴重なツール、。ワクチンの開発。

説明アッセイは、ここが感染症に通常許容 K562 細胞と一緒に DENV RVPs を使用します。RVPs が構造的にそのまま複製無能 DENV ウイルス粒子レプリケーション³の単一のラウンドの後に表示されるサブ ゲノム緑色蛍光タンパク質 (GFP) レプリコンをエンコードします。など、RVPs に感染している細胞は緑色の蛍光を発する、フローサイトメトリーや顕微鏡を使用して容易に検出することができます。この試金で使用される RVPs は、商業ソースから得られました。あってもいい、しかし、他のウイルスに対して生成され、本稿に記載されている試金で使用されます。一方、K562 細胞、抗体の Fc 領域に結合し、サブ中和抗体^4、5の濃度の存在下で感染 FcγIII 受容体発現の白血病細胞株であります。

ADE の試金は体外ADE のメカニズムを記述する重症のデング熱の危険因子を調査し、研究で広く使用されている^6,7,8。ここで説明した ADE アッセイ迅速かつ簡単に使える RVPs を使用して生体外で感染を強化し、フローサイトメトリー、現在、使用していずれかを必要とする他の試金と比較してプラーク形成による血清の容量を決定するにはVero 細胞や抗体の汚損の単位 (pfu) 感染細胞^{6,7,8,9,10、11}、どちらも時間がかかり、労働集中的です。

ここで説明されたプロトコルを示すために使用する血清サンプルは評価・実験動物ケアの認定会で収容されたローカルの状態に従っての世話と連邦の方針であったアカゲザルから得られました。国際 (AAALAC)-施設を認定します。すべての動物実験したレビューし、機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され共有プロトコル組織のサンプルが買収されました。

1 日 1

注: 次の BSL 2 実験室での培養に使用される滅菌流バイオのキャビネットで説明すべての手順に従います。

1. 室温で血清サンプルを解凍し、各血清試料 100 μ L を生殖不能の管に転送します。水浴または温度調整可能な thermomixer で 56 ° C で 30 分間熱を不活性化します。冷たい RPMI 10 (10% 牛胎児血清を RPMI) を使用して縮尺を 1:1 に至る血清サンプルの 10 倍のシリアル希薄を作る。
2. 滅菌 96 ウェル V 底プレートの各ウェルに 10 μ L の血清を希釈したサンプルを転送します。だけと、血清サンプルと RPMI 10 のみ RVPs と血清サンプルなしなし制御井戸、RPMI-10 RVPs との 2 つのセットが含まれます。各血清サンプルとトリプリケートで RPMI 10 コントロールを設定します。
3. -80 ° C の冷凍庫と雪解けからデング熱 1、2、3、4 の RVPs を削除するそれらを 37 ° C の水浴。すぐに氷の融解の RVPs に転送します。各血清サンプルの約 170 μ L RVPs を取得 (各血清希釈用 RVPs x 3 井戸の 10 μ L (1:1、1:10, 1: 100, 1:1, 000) ごとに RVP を RPMI 10 RVPs x 3 井戸の 10 μ L は井戸を制御するだけと)。
4. 各血清サンプルを含む 96 ウェル V 底板のもと RVPs (血清ない) コントロール井戸を RPMI 10 に RVPs の 10 μ L をピペットします。RVPs RPMI 10 だけに (ない血清サンプルとない RVP) 井戸を追加しないでください。上下にピペッティングして徹底的にミックス 5-10 回。10 μ l 添加冷 (ない血清サンプルとない RVP) 制御井戸のみ各冷たい RPMI 10 に RVPs の代わりに RPMI 10。
5. 96 ウェル V 底プレートをインキュベーターに転送し、プレートを 5% CO₂の存在下で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。96 ウェル V 底プレートを培養すると、一方バイオ セーフティの 70% のエタノールでキャビネットの表面をきれいにし、15 分間紫外線を実行します。
6. インキュベーターから K562 細胞の完全に合流 T75 フラスコを削除、5 mL の滅菌ピペットを使用してセルをミックスし、セルの 5 mL を滅菌 15 mL の円錐管に転送します。
   注: K562 細胞を RPMI 10 で維持し、1 x 10⁶/mL で継代します。
7. 滅菌 15 mL の円錐管から 10 μ L のセルを削除することによって細胞の数を数えるし、10 μ L tryphan ブルー ミックスします。15 mL コニカル チューブ内のセルの合計数を決定するための診断を使用してセルをカウントします。
8. 10 分間 〜 1,200 x g で細胞と円錐形の 15 mL を遠心、上清をデカント、暖かい RPMI - 10 メディア (2.66 × 10⁶セル/mL) の 80,000 のセル/30 μ L の濃度で細胞を再懸濁します。
9. インキュベーター (ステップ 1.6) から 96 ウェル V 底板を削除、96 ウェル V 底プレートの各ウェルに K562 細胞の 30 μ L を転送し、上下にピペッティングして徹底的にミックス 5-10 回。96 ウェル V 底プレートをインキュベーターに転送し、プレートを 5% CO₂の存在下で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
10. 1 時間インキュベート後 5 分のインキュベーターと 〜 1,200 × g で遠心分離から 96 ウェル V 底プレートを削除します。遠心分離の後に、10% の漂白剤を含むコンテナーにプレートを逆さま回すことによって井戸からメディアをデカントします。
11. 暖かい RPMI 10 125 μ L でそれらを再各ウェルの細胞を洗い、ピペット、徹底的に混ぜて、10% 漂白剤を含むコンテナーにプレートを逆さま回すことによって ~ 1,200 x g で 5 分間デカント メディアでプレートを遠心します。この洗浄ステップを 2 回繰り返します。
12. 洗浄後、それぞれに RPMI 10、上下をピペットで移しなさい、ミックス暖かいの 100 μ L を追加し、5% CO₂の存在下で 37 ° C で 48 h 用プレートを孵化させなさい。

2 日目 3

1. 細胞とメディア/ウェル インキュベーターから 100 μ L を含む 96 ウェル V 底板を削除し、バイオ セーフティ キャビネットに移動します。ミックス、マルチ チャンネル ピペットを使用してそれぞれの内容もセルを転送し、96 ウェル U 底面にメディア プレート済みラベル付き 5 mL ポリプロピレン チューブ。
2. 1% の 100 μ L で 96 ウェル V 底プレートの各ウェルを洗浄パラホルムアルデヒド (PFA) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) そして最終をもたらすステップ 2.1 から 96 ウェル U 底プレートまたはラベル付き 5 mL ポリプロピレン チューブにそれぞれの井戸に転送 × 1濃度 0.5 %pfa/ウェルまたは管。マルチ チャンネル ピペットを使用して徹底的にミックス、カバー プレート、アルミ箔を 30 分セルを修正するためのインキュベーター内に座らせてください。
3. 準備流れの cytometer (例えば材料のテーブルを見なさい) 無染色の K562 細胞側と前方散乱と蛍光設定のキャリブレーションを実行することによって。必要なだけ蛍光チャネルは、GFP は、細胞から放出される唯一の蛍光 FL1、です。取得 ~ 30, 000-50,000 各サンプルからの細胞します。
   メモ: 単一蛍光を読み取ることができる任意の流れの cytometer は、RVPs 感染細胞が GFP の存在のために緑の蛍光を放出するのみ、他の蛍光チャネルを必要としない、データの集録に使用できます。

3. データ分析

1. 流れフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して流れの cytometer で取得したデータを分析 (材料の表を参照してください)。
   1. セット最初のゲートは対 FSC H (前方散乱-高さ) を単一細胞分析¹²から自動蛍光ダブレットを含めたり除外する FSC A (前方散乱-エリア) に基づいています。その後、SSC A に基づいて一重項ゲート セルをゲート (側方散乱-エリア) vs される破片を除外する FSC の。
   2. SSC A 対 FSC A ゲート細胞を分析する SSC の対に基づく GFP の表現 GFP A.GFP 陽性細胞の周りにゲートを設定することによって各希釈血清とコントロール サンプルの GFP 陽性細胞の割合を決定します。
2. 帳票の井戸の GFP 陽性細胞の割合の合計を 3 で除して各血清サンプルの希釈やコントロール井戸の GFP 陽性細胞の割合の平均値を決定します。
3. RVPs (血清サンプルはない) コントロール井戸を RPMI 10 の GFP 陽性細胞の割合の平均値で割った各希釈血清サンプルで GFP 陽性細胞の割合の平均値を割ることによって感染の倍充実を計算します。
4. 希釈 (x 軸)、対倍強化 (y 軸) をグラフし、多重比較のためのテューキー事後テスト続いて ANOVA を使用して統計分析を実行します。

4 リーサス macaques、マカク属 ZIKV 感染後収集した 16 週間をされ、その潜在的な DENV 1 を強化するテストの血清、K562 細胞における感染の 2、3、4。動物では、感染後 7 日で検出限界以下であったレベルに低下した感染後 3 日目に 〜 10⁵枚 ZIKV RNA/mL プラズマの x 1 のピーク血を持っていた。16 週間感染後の血漿中ウイルス血症が見つかりませんでした。RVP アッセイを行ったし、収集したデータを解析していた上記のプロトコルで説明するようします。

GFP 陽性細胞を識別するために使用されるゲートの戦略は、図 1のとおりです。初期のゲートが除外されるダブレットと FSC A 対 FSC H. に基づいて単一のセルのみを含めるに設定されました次のプロットは、単一セルの門からセルのみを示しています、ゲートがあった描画に基づいて SSC A 対 FSC のされる破片を除外します。ゲートこれら細胞が SSC の対に基づく第 3 のプロットに表示されます FL1 の GFP 陽性細胞を識別します。RVPs 感染細胞が GFP を表現し、GFP 陽性細胞の割合がこれらの細胞の周りのゲートの設定によって決定されました。GFP 陽性細胞の約 12.2% はない GFP 陽性細胞がコントロールのサンプルと比較して、ZIKV 感染血清サンプルで検出されます。このゲートの戦略はアッセイに含まれている各血清希釈とコントロール サンプルの後が続きます。

各サンプルの希釈およびコントロールのサンプル (図 1) 上記 GFP 陽性細胞の割合を測定しました。DENV 1 RVPs を用いた代表的な動物からのデータは、図 2のとおりです。ない血清サンプル 0.253 %gfp 陽性細胞を持っていたと比較して GFP 陽性細胞の割合が縮尺希釈で 0.022%、0.735% で 1: 100、1:10 で 12.8% 2.58% 原液のサンプル。サンプルの抗体濃度の減少により血清を希釈と GFP 陽性細胞の割合が変わります。

1:10 と比較していずれかの希釈原液サンプルやその他の希釈で GFP 陽性細胞率の劇的な増加を見ました感染によるウイルスの取り込みを高めるため最適な抗体濃度に関連付けられています、縮尺、1: 100 希釈抗体の感染の ADE を誘発するのに十分ではなかったことの低レベルがあったに対し、原液のサンプルが抗体の高い濃度を持っていたことを示唆しています。抗体濃度が著しく高い場合、血清の希釈を追加は、ADE が明らかになる希釈を決定するために含まれてになります。血清を調べた、1:10 の希釈で ADE を観察します。その一方で、ADE は、血清中の抗体濃度が非常に高い場合も低い希釈で観察します。

次に、血清・ コントロールなしの帳票の井戸の GFP 陽性細胞の割合の平均値と各希釈用帳票の井戸の GFP 陽性細胞の平均の割合で割って感染による倍を計算しました。動態 ade のに対して DENV-1、2、3 と 4 の血清型グラフ (図 3) x 軸 y 軸および血清の希釈に倍強化によって定められました。血清が 16 週間後感染症でかなり収集できるデータを示して強化 DENV 1 による K562 細胞、1:10 の希釈で 2、3、4 血清型の感染です。

図 1: フローサイトメトリーによる取得と分析のための戦略をゲーティングします。DENV RVPs 感染 K562 細胞流れの cytometer を用いて解析した GFP を表現します。(A)血清コントロールと(B) 16 週のポスト ZIKV 感染ない血清。セルされたによる前方散乱領域 (FSC A) vs 前方散乱高さ (FSH H) 後のダブレットを除外する側散布 (SSC-A) の対をゲート最初 FSC の破片を除外します。SSC A 対 FSC A ゲート細胞はあった SSC A 対 GFP A (緑の蛍光蛋白質-エリア) に基づく、ゲート。黒の四角形と楕円を表す、門と門の上の数字は、そのゲートの中に落ちる細胞の割合。FACS プロット間黒の矢印は、使用されているゲートのシーケンスを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 周波数 DENV RVP + の細胞を示す代表的なドット プロットします。DENV 1 RVPs に感染していた K562 細胞の割合は、フローサイトメトリーによって決定されました。16 週間後感染症で代表的なアカゲザルから収集した血清は DENV 1 RVPs 原液または、1:10、1: 100、および縮尺希薄で孵化され、ないコントロール血清と比較しています。各血清濃度で GFP 陽性細胞の割合が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: デング熱-1、2 の大幅な強化 3 と 4 の感染は 1:10 で観測された血清の希釈します。X 軸と y 軸に (ない血清サンプル コントロール) を基準にして倍強化にプロットの血清希釈 4 DENV 血清型のデング感染症の抗体依存強化調べた。4 ZIKV 免疫アカゲザルから 16 週間後に感染症は、この試金で使用された血清で収集。誤差範囲を表す標準誤差、* p を表す < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

DENV や ZIKV などの発現は、両方の構造および非構造タンパク質^13,14お互いと交差反応する抗体を生成する相同性の重要な証拠を共有します。これらの交差反応性抗体応答を高めるために示されている感染症の両方との in vitro異種血清または他関連発現^1,2。クロスの感染を高める可能性のある病気を管理するため、ワクチンの開発に重大な意味があります。

基づく従来の培養の試金は血清の存在下で感染ライブ DENV と感染している非感受性細胞を使用します。感染症の強化は、標準的なプラクの試金¹¹を使用して上清中のウイルスの量を定量化することで測定されます。この試金は 2 つのセルラインのウイルスの培養を必要とし、実行に大幅に長い期間が必要です。さらに、いないすべての DENV 血清型プラーク同様に、これらの試金に複雑さの別のレベルを追加します。

他のアッセイは、DENV 蛍光に分類された抗体を用いた細胞内染色を用いてセルラインの伝染を測定し、フローサイトメトリー^9,10,14の流れによるプラークの試金のプロトコルを変更しました。基づくプラークと比べて感染のレベルを決定するために必要な時間を短縮このアッセイそこが一貫して動作するようにこれらのアッセイに必要な最適化ステップ数。細胞内のプロトコルを汚すは、固定し、細胞の構造の違いが細胞内染色続いて必要とよく滴定された DENV 特異的抗体血清型を判定することが明らかに時間がかかる。また、これらの試金はハイスループット フォーマットに簡単に従順ではない、測定内変動の高レベルに苦しみます。

上記説明アッセイとは対照的基づく DENV RVPs 試金は簡単にセットアップ、感染ウイルスを使用しない、血清の感染を高める可能性を測定するため容易に使用することができます高スループットに。また、この試金は労働集約的他のアッセイでは、現在の ADE の試金のプロトコル上の大きな利点を提供する 2-3 日以内完了することができます。原稿に記載されている分析検討 DENV-1、2 の感染を強化する ZIKV 感染血清の容量も 3 と 4 の血清型アッセイは実験の両方から血清を調べるに容易に適応することができから得られる臨床サンプルフラビ ウイルス感染症の他の細胞株と黄熱病ウイルス (YFV)、日本脳炎ウイルス (JEEV)、西ナイル ウイルス (WNV) RVPs がある場合など。ただし、背景を汚すことがなく細胞の最適な染色を許可する RVP、細胞/ウェル数と孵化の持続期間の量を滴定によって分析を最適化するために重要です。

滴定は、RVPs (たとえば、2.5 μ L、5 μ L、7.5 μ、10 μ、20 μ L 等)の可変ボリュームとターゲット セル (たとえば、80,000 K562 細胞またはテストされている細胞株) の定義された数の孵化によって実行する必要があります。定義されたセル数と得られた抗体を使用して、可変期間 (たとえば、24 時間、48 時間にわたってプロトコルで説明されているようにそれらをインキュベート、孵化の持続期間を定めることが各 RVPs の正しい力価を取得した後、 72 h 等)。

DENV 1:10 の希釈血清抗体による感染を検出する 10 倍希釈する必要があることを示唆しているすべて 4 血清型による感染の ADE を見ました。その一方で、他の研究は血清中の抗体の濃度が可能性が高すぎると体外ADE を検出する低希釈を必要とするを示す低い希釈で強化を報告しています。ADE 右血清サンプル中の抗体濃度に依存している、ほとんどのサンプルは原液血清よりも低い希釈で ADE を表示する可能性があります。

結論としては、この原稿で説明されたプロトコルは単純かつ簡単に導入、簡単に分析することができます高品質のデータを生成するためのスケール アップ高スループット スクリーニング期間短期間でサンプルの数が多いを有効にすることができ、解釈されます。

著者が明らかに何もありません。

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WGV すべての実験を行いデータを分析JJM 設計し、試験を監督ニシコククジラ、JJM 紙を書いた。