Una citometría de flujo Simple basado en análisis para determinar In Vitro anticuerpo dependiente del realce del Virus del Dengue usando suero convaleciente Zika Virus

Se describe un protocolo simple y fácil para medir la mejora dependiente de anticuerpos de la infección por Zika virus suero convaleciente con partículas virales de Dengue virus reportero.

Mejora dependiente de anticuerpos de la infección se ha demostrado para desempeñar un papel importante en la patogenia viral de Dengue. Los análisis tradicionales que miden la capacidad de los anticuerpos o del suero para mejorar la infección en líneas celulares han confiado en usar salida viral en los medios de comunicación seguido por ensayos de placa para cuantificar la infección. Más recientemente, estos ensayos han examinado la infección del Dengue virus (DENV) en las líneas celulares usando los anticuerpos de fluorescencia marcados. Ambos estos métodos tienen limitaciones que restringen el uso generalizado de estas técnicas. Aquí, describimos un análisis simple en vitro con Dengue virus reportero partículas virales (RVPs) que expresan la proteína verde fluorescente y las células K562 a examinar mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección por DENV usando el suero que se obtiene de macaco de la India macacos 16 semanas después de la infección con el virus Zika (ZIKV). Esta técnica es confiable, implica la mínima manipulación de las células, no implica el uso de virus competentes de replicación directo y puede realizarse en un formato de alto rendimiento para obtener una lectura cuantitativa mediante citometría de flujo. Además, este análisis pueden ser adaptado fácilmente para examinar mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de otras infecciones de flavivirus como el virus de la fiebre amarilla (YFV), virus de la encefalitis equina (JEEV), virus del Nilo Occidental (VNO) etc. donde RVPs están disponibles. La facilidad de establecer el ensayo, análisis de los datos y la interpretación de los resultados hacen altamente susceptibles a más valores de laboratorio.

Mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección es un proceso por el que las respuestas de anticuerpos cruz-reactivos parcialmente inducidas por un serotipo de virus mejora la absorción de otro serotipo del virus, llevando a mayor replicación viral y viremia. ADE ha sido ampliamente documentado en las infecciones del virus (DENV) Dengue donde predominan cuatro serotipos principales. En un subgrupo de pacientes, ADE se asocia con la fiebre hemorrágica de Dengue (FHD). Recientemente hemos demostrado que la infección del virus (ZIKV) Zika inducido significativamente altos niveles de respuestas de anticuerpos cruz-reactivos de DENV que causaron ADE de DENV en vitro y probablemente contribuyeron a la mejora de la viremia DENV en vivo^{1 , 2}. ensayos de mejora dependiente de anticuerpo son una herramienta valiosa para evaluar la capacidad de anticuerpos para mejorar la infección secundaria con virus relacionados y proporcionar información valiosa en la patogenesia de infecciones por flavivirus e informar a la desarrollo de vacunas.

El descrito aquí emplea DENV RVPs junto con las células K562 que son normalmente inadmisibles a la infección. RVPs son estructuralmente intacto replicación incompetente DENV partículas virales que codifican un replicón de sub-genomic proteína verde fluorescente (GFP) que se expresa después de una sola ronda de replicación³. Así, las células que se infectan con RVPs fluorescencia verde y pueden ser fácilmente detectadas mediante citometría de flujo o microscopia. Los RVPs utilizados en este ensayo se obtuvieron de fuentes comerciales. Sin embargo, se pueden generar contra otros virus y utilizado en el ensayo se describe en este manuscrito. Mientras tanto, las células K562 son una línea de células de leucemia FcγIII-receptor-expresión que se unen a la región Fc de los anticuerpos y se infectan en la presencia de neutralizar las concentraciones de anticuerpo^4,5.

ADE los ensayos se han utilizado en estudios que investigaron los factores de riesgo para dengue grave y delinear los mecanismos de en vitro ADE^6,7,8. El ensayo de ADE descrito aquí puede ser rápidamente y fácilmente usado para determinar la capacidad del suero para mejorar en vitro infección usando RVPs y flujo cytometry, en comparación con otros ensayos utilizados en la actualidad, que requieren ya sea la determinación de la formación de placa unidades (pfu) en células Vero o tinción de anticuerpos de la infección las células^{6,7,8,9,10,11}, los cuales son desperdiciadores de tiempo y mano de obra intensivo.

Las muestras de suero utilizadas para demostrar el protocolo descrito aquí se obtuvieron de macacos rhesus que fueron alojadas y atendidas según local, estatal y federales políticas en una asociación para la evaluación y acreditación de laboratorio Animal Care Internacional (AAALAC)-acreditado centro. Todos los experimentos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de uso y cuidado institucional del Animal y las muestras fueron adquiridas a través de un tejido de intercambio de protocolo.

1. día 1

Nota: Realice todos los pasos que se describen a continuación en un gabinete de bioseguridad de flujo laminar estéril utilizado para cultivo de tejidos en un laboratorio BSL-2.

1. Las muestras de suero a temperatura de descongelar y transferir 100 μl de cada muestra de suero a un tubo estéril. Inactive por calor durante 30 minutos a 56° C en un baño de agua o un Termomezcladores temperatura ajustable. Hacer 10 veces diluciones seriadas de la muestra de suero que van de 1:1 para 1:1,000 con RPMI-10 frío (RPMI con 10% suero bovino fetal).
2. Transferir 10 μl de la muestra de suero en serie diluido en cada pocillo de una placa de V-inferior de 96 pocillos estéril. Incluyen dos sistemas de control de pozos, RPMI-10 con RVPs sólo y sin muestra de suero y RPMI-10 sin RVPs y sin muestra de suero. Configurar cada muestra de suero y RPMI-10 controles en triplicado.
3. Retire el Dengue-1, 2, 3 y 4 RVPs del congelador de-80 ° C y descongelar en baño de agua de 37 ° C. La transferencia de los RVPs descongelados inmediatamente en hielo. Obtener RVPs aproximadamente 170 μl de cada muestra de suero (10 μl de los RVPs x 3 pozos para cada dilución de suero (1:1, 1:10, 1: 100, 1:1, 000) y 10 μl de los RVPs x 3 pozos para cada uno de los 10 de RPMI con RVP sólo control de pozos).
4. Pipetear 10 μl de RVPs en cada pozo de la placa de 96 pocillos V-parte inferior que contiene la muestra de suero y el RPMI-10 con pocillos de control RVPs (no suero). No añadir pozos de RVPs RPMI-10 solamente (ninguna muestra de suero y no RVP). Mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo 5 – 10 veces. Añadir 10 μl de frío RPMI-10 en lugar de RVPs cada RPMI-10 frío sólo (ninguna muestra de suero y no RVP) de control de pozos.
5. Transferir la placa de 96 pocillos fondo V a una incubadora e Incube la placa durante 1 hora a 37 ° C en presencia de 5% CO₂. Mientras está incubando la placa de 96 pocillos fondo V, limpie la superficie de la bioseguridad con etanol al 70% y ejecute la UV luz durante 15 minutos.
6. Retire un frasco de T75 completamente confluente de células K562 de la incubadora, mezclar las células bien utilizando una pipeta estéril 5 mL y transferir 5 mL de células a un tubo cónico de 15 mL estéril.
   Nota: Las células K562 son mantenidas en RPMI-10 y subcultivadas en 1 x 106/ml.
7. Contar el número de las células mediante la eliminación de 10 células μl del tubo cónico de 15 mL estéril y mezclar con azul de tryphan de 10 μl. Contar las células usando un hemocitómetro para determinar el número total de células en el tubo cónico de 15 mL.
8. Centrifugue el 15 mL cónico con células ~ 1.200 x g durante 10 minutos, decantar el sobrenadante y resuspender las células en RPMI-10 caliente en una concentración de 80.000 células/30 μl de medios (2,66 x 10⁶ células /mL).
9. Retire la placa de 96 pocillos V-fondo de la incubadora (criterio 1.6), transferir 30 μl de las células K562 a cada pocillo de la placa de 96 pocillos fondo V y homogeneizar mediante pipeteo arriba y abajo 5 – 10 veces. Transferir la placa de 96 pocillos fondo V a una incubadora e Incube la placa durante 1 hora a 37 ° C en presencia de 5% CO₂.
10. Después de incubar durante 1 h, retire la placa de 96 pocillos fondo V de la incubadora y centrifugar a 1.200 ~ x g durante 5 minutos. Después de la centrifugación, decantar los medios de comunicación de los pozos girando la placa boca abajo en un recipiente que contiene 10% de lejía.
11. Lavar las células en cada pozo a resuspender en 125 μl de RPMI-10 caliente, mezclar bien con una pipeta y centrifugar la placa a ~ 1.200 x g durante 5 min, decantar los medios girando la placa boca abajo en un recipiente que contiene 10% de lejía. Repetir este lavado dos veces.
12. Después del lavado, añada 100 μl de RPMI-10 para cada uno, de la mezcla hacia arriba y hacia abajo con la pipeta caliente e Incube la placa durante 48 h a 37 ° C en presencia de 5% CO₂.

2. día 3

1. Retire la placa de V-inferior de 96 pocillos con 100 μl de células y los medios de comunicación/de la incubadora y a un gabinete de bioseguridad. Utilizando una pipeta multicanal, mezclar el contenido de cada uno así y transferencia de las células y los medios de comunicación a un bien U-fondo 96 platean o a previamente etiquetado como tubos de polipropileno de 5 mL.
2. Lave cada pocillo de la placa V-inferior de 96 pocillos con 100 μl de 1% paraformaldehido (PFA) en 1 x fosfato tampón salino (PBS) y traslado a los respectivos pozos en la 96 bien U inferior placa o etiqueta 5 mL tubos de polipropileno en el paso 2.1 para rendir un final concentración de 0.5% PFA/pozo o tubo. Mezclar bien con una pipeta multicanal, cubra la placa con papel de aluminio y lo deje reposar en la incubadora durante 30 minutos para fijar las células.
3. Preparar el citómetro de flujo (véase Tabla de materiales por ejemplo) mediante la ejecución de las células K562 sin mancha para calibrar el lado y dispersión hacia adelante junto con los valores de fluorescencia. El canal de fluorescencia sólo requerido es FL1, como GFP es el único fluorescencia emitida por las células. Adquirir 30, 000-50.000 células de cada muestra.
   Nota: Cualquier citómetro de flujo capaz de leer una sola de la fluorescencia puede utilizarse para la adquisición de los datos, como las células infectadas con RVPs sólo emite fluorescencia verde debido a la presencia de GFP, y ningún otro canal de fluorescencia son necesarios.

3. Análisis de los datos

1. Analizar los datos adquiridos en el citómetro de flujo utilizando cualquier software de análisis de citometría de flujo (véase tabla de materiales).
   1. Conjunto de la primera puerta basado en FSC-A (avance dispersión – área) vs FSC-H (forward scatter – altura) son las células y excluir a auto-fluorescente dobletes de análisis¹². Entonces, la puerta cerrada camiseta células basadas en SSC-A (dispersión de lado – zona) vs FSC-A excluir cualquier escombro autofluorescent.
   2. Analizar vs SSC-A células cerradas FSC-A para la expresión de GFP en base a vs SSC-A GFP-A. Determinar el porcentaje de células GFP + para cada dilución de las muestras de suero y control estableciendo una puerta alrededor de las células GFP +.
2. Determinar el porcentaje de células GFP + para cada dilución de la muestra de suero y pocillos de control dividiendo el porcentaje total de células GFP + en los pozos por triplicado 3.
3. Calcular doble-mejora de la infección al dividir el porcentaje medio de células GFP + en las muestras de suero para cada dilución dividido por el porcentaje medio de células GFP + en el RPMI-10 con pocillos de control RVPs (ninguna muestra de suero).
4. Ver pliegue-mejora (eje y) versus dilución (eje x) y realizar análisis estadístico con ANOVA seguido de post-hoc de Tukey para comparaciones múltiples.

Sera de 4 rhesus macacos fueron recogidos 16 semanas después de la infección con ZIKV y probaron por su potencial para mejorar el DENV-1, 2, 3 y 4 la infección en células K562. Los animales tenían viremia pico de ~ 1 x 10⁵ copias de ZIKV ARN/mL de plasma por día 3 después de la infección que se negó a niveles por debajo del límite de detección por 7 días después de la infección. No hay viremia se detectó en el plasma en la infección después de 16 semanas. Luego, se realizó el ensayo RVP y los datos recogidos se analizaron como se describe en el protocolo anterior.

La estrategia bloquea utilizada para identificar células GFP + se muestran en la figura 1. La puerta inicial fue fijada para excluir autofluorescent dobletes y sólo incluyen las células basadas en vs de la FSC-A FSC-H. El diagrama siguiente muestra solamente las células de la puerta de la célula; allí, una puerta fue elaborado basado en vs de SSC-A FSC-A excluir cualquier escombro autofluorescent. Estas bloqueado células fueron exhibidas luego en una tercera parcela basada en SSC-A vs FL1-A identificar células GFP +. Células infectadas con RVPs expresan GFP, y se determinó el porcentaje de células GFP + poniendo una puerta alrededor de estas células. Aproximadamente el 12.2% de las células GFP + son detectable en la muestra de suero infectado ZIKV, en comparación con los no células GFP + en la muestra de control. Esta estrategia bloquea es seguida para cada muestra del suero control y dilución incluido en el ensayo.

Se determinó el porcentaje de células GFP + para cada dilución de la muestra y la muestra de control como se describe anteriormente (figura 1). Datos de un animal representativo utilizando RVPs DENV-1 se muestran en la figura 2. En comparación con el no control muestra de suero que tenía células GFP + 0.253%, el porcentaje de células GFP + fueron 2.58% de muestra sin diluir, 12,8% en el 1:10, 0.735% en el 1: 100 y 0.022% en dilución de 1:1,000. El porcentaje de células GFP + cambiará como el suero se diluye debido a las disminución concentraciones de anticuerpos en la muestra.

Como mejora de la infección está asociada con la concentración de anticuerpo que es ideal para aumentar la participación de virus, se observó un dramático aumento en el porcentaje de células GFP + en 1:10 dilución en comparación con o sin diluir las diluciones de la muestra u otras, lo que sugiere que la muestra sin diluir tenía altas concentraciones de anticuerpos, mientras que las diluciones 1: 100 y 1:1,000 tenían bajos niveles de anticuerpos que no era suficiente para inducir la ADE de la infección. Si las concentraciones de anticuerpo son significativamente altas, adicionales diluciones de suero deben ser incluidas para determinar la dilución en la que ADE se hace evidente. En las muestras de suero que examinamos, observamos a ADE a una dilución de 1:10. Por otro lado, ADE se puede observar en las diluciones más bajas si la concentración de anticuerpos en el suero es bastante alta.

A continuación, calculamos la doblez-mejora de la infección al dividir el porcentaje medio de células GFP + en los pozos por triplicado para cada dilución con el porcentaje medio de células GFP + en los pozos por triplicado para ningún suero control. La cinética de ADE contra DENV-1, 2, serotipos 3 y 4 se determinaron graficando fold-realce en la dilución de suero y el eje y en el eje x (figura 3). La muestra de datos que el suero recogido en 16 semanas post infección significativamente mayor infección de las células K562 de DENV-1, 2, 3 y 4 serotipos en una dilución de 1:10.

Figura 1: bloquear la estrategia de adquisición y análisis por citometría de flujo. Células K562 infectadas con DENV RVPs expresan GFP que se analizó utilizando un citómetro de flujo. (A) ningún suero control y (B) 16 semana post-ZIKV infectan suero. Las células primero fueron cerradas basada en el área de dispersión delantera altura de forward scatter (FSC-A) vs (FSH-H) para excluir dobletes seguidos por un lado scatter (SSC-A) vs FSC-A excluir a escombros. Las SSC-A vs células cerradas FSC-A entonces fueron cerrados basado en vs SSC-A GFP-A (fluorescencia proteína-área). Los rectángulos negros y óvalos representan las puertas, y los números por encima de las puertas son el porcentaje de células en esa puerta. La flecha negra entre las parcelas de FACS muestra la secuencia de puertas utilizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: parcelas representativas punto mostrando frecuencia de DENV RVP + células. Se determinó el porcentaje de células K562 que estaban infectados con DENV-1 RVPs por citometría de flujo. Suero recogido de un macaco Rhesus representante en 16 semanas post infección fue incubada con DENV-1 RVPs puro o en diluciones 1:1,000, un 1:10 y 1: 100 y en comparación con no sueros de control. Se muestra el porcentaje de células GFP + en cada concentración de suero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: realce significativo de Dengue-1, 2, 3 y 4 la infección se observa en el 1:10 dilución de suero. Mejora dependiente de anticuerpos de infección de Dengue fue examinado para los 4 serotipos DENV por trazar las diluciones de suero en el eje x y la mejora del pliegue (en relación con ningún control de la muestra de suero) en el eje y. Los sueros obtenidos 4 macacos rhesus inmune de ZIKV en 16 semanas después de la infección fue utilizada en este ensayo. Barras de error representan el error estándar y * representa p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Flaviviruses DENV como ZIKV compartir evidencia significativa de homología en ambos sus proteínas estructurales y no estructurales que generan anticuerpos que cruz-reaccionan con otros^13,14. Estas respuestas de anticuerpos cruz-reactivos se han demostrado para mejorar de la infección tanto en vivo como en vitro con un serotipo heterólogo u otros relacionados con flaviviruses^1,2. El potencial para mejorar la infección cruzada tiene importantes implicaciones para el manejo de la enfermedad y también para el desarrollo de una vacuna.

Ensayos de cultura tradicional basado en utilizan células no permisivas que se infectan con infecciosa DENV vivo en presencia de suero. Mejora de la infección se mide cuantificando la cantidad de virus en el sobrenadante mediante ensayos de placa estándar¹¹. Este ensayo requiere cultivo de virus en dos líneas celulares y requiere significativamente largos períodos de tiempo para llevar a cabo. Además, no todos lo DENV serotipos placa del mismo modo, agregando otro nivel de complejidad a estos ensayos.

Otros ensayos han modificado el protocolo de ensayo de placa base para medir la infección de líneas celulares combinando tinción intracelular para DENV utilizando anticuerpos fluorescente etiquetados y flujo cytometry^9,10,14. Aunque esto reduce el tiempo necesario para determinar el nivel de infección en comparación con la placa base de análisis allí son un número de pasos de optimización necesarios para que estos ensayos trabajar constantemente. Protocolos de tinción intracelulares son lentos, ya que requieren fijación y permeabilizing de células seguida de tinción intracelular y requieren bien valorada DENV los anticuerpos específicos que pueden discriminar claramente cada serotipo. Además, estos ensayos no son fácilmente susceptibles a un formato de alto rendimiento y sufren de altos niveles de variabilidad intraensayo.

En contraste con los ensayos descritos anteriormente, el ensayo de DENV RVPs base es fácil de configurar, no utiliza virus infeccioso y es altamente sensible al alto rendimiento que se puede usar para medir el potencial de suero para mejorar la infección. Además, este ensayo no es tan laborioso como otros ensayos y se puede completar en 2-3 días, que ofrece una gran ventaja sobre los actuales protocolos de ensayo de ADE. Aunque el ensayo descrito en el manuscrito examina la capacidad del suero ZIKV infectado para mejorar la infección por DENV-1, 2, serotipos 3 y 4, el ensayo puede ser fácilmente adaptado para examinar el suero de ambos experimental y las muestras clínicas obtienen de otros infecciones por flavivirus como el virus de la fiebre amarilla (YFV), virus de la encefalitis equina (JEEV) y virus del Nilo Occidental (VNO) si RVPs están disponibles y con otras líneas celulares. Sin embargo, es fundamental para optimizar el análisis al valorar el volumen de RVP, número de células/pozo y la duración de la incubación para permitir una óptima coloración de células sin tinción de fondo.

Valoraciones deben realizarse por un número determinado de células diana (por ejemplo, las células K562 80.000 o una línea celular probando) de incubación con volúmenes variables de RVPs (por ejemplo, 2,5 μl, 5 μl, 7.5 μl, 10 μl, 20 μl, etc.). Una vez obtenido el título correcto para cada RVPs, la duración de la incubación puede ser determinada usando el título obtenido junto con el número definido de las células y les como se describe en el Protocolo por períodos variables de tiempo (por ejemplo, 24 h, 48 h de incubación 72 h, etc.).

Observamos a ADE de la infección por los 4 serotipos de DENV en una dilución de 1:10, lo que sugiere que una niveles de anticuerpos en el suero necesitan para diluir 10 veces para detectar aumento de la infección. Por otro lado, otros estudios han reportado mejora en diluciones más bajas, lo que indicaría que las concentraciones de anticuerpos en la muestra de suero eran probablemente demasiado alto, que necesitan diluciones inferiores para detectar ADE en vitro. Como ADE depende de la concentración adecuada de anticuerpos en la muestra de suero, mayoría de las muestras suelen mostrar a ADE en diluciones más bajo que el suero no diluido.

En conclusión, el protocolo descrito en este manuscrito es simple y fácil de adoptar y permite el escalado para detección de alto rendimiento de un gran número de muestras en un corto período de tiempo para producir datos de alta calidad que fácilmente pueden ser analizados y interpretado.

Los autores no tienen nada que revelar.

El proyecto descrito fue apoyado por fondos de la Universidad de servicios uniformados de Ciencias de la salud a JJM. Las opiniones o afirmaciones contenidas en este documento son los privados de los autores y no son ser interpretados como oficiales o refleja las opiniones del Departamento de defensa, la Universidad de servicios uniformados de Ciencias de la salud o cualquier otra agencia de los Estados Unidos Gobierno.

VGP realizó todos los experimentos y analiza los datos; JJM diseñado y supervisado el estudio; WGW y JJM escribieron el libro.