MOG35 55 を受ける c57bl/6 マウスの矢状面運動歩行解析による実験的自己免疫性脳脊髄炎

矢状面における歩行の運動学的分析には、運動の実行方法に関する非常に正確な情報が得られます。マウスの自己免疫を介した脱髄を受けるため歩行障害を識別するためにこれらの技術の応用について述べる。これらのメソッドは、障害者の歩行の特徴他のマウス モデルの歩行障害の特徴に使用可能性があります。

矢状面における歩行の運動学的解析は、多発性硬化症 (MS) で運動障害の特徴によく使用されています。実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) として知られている MS のマウス モデルの歩行障害を識別するためにこれらの技法の応用について述べる。EAE マウスで麻痺およびモーター欠損は、通常臨床スコア スケールを使用して評価します。ただし、このスケールは、運動障害の正確な性質について少し情報を提供する序数データのみを生成します。EAE 病気の重症度が評価されたは一般的な運動の協調性の測定を提供する rotarod でも。対照的に、矢状面における下肢の運動学的歩行分析は高精度についてどのように運動が障害を生成します。この手順を実行するには、反射マーカーはマウスはトレッドミルで歩いている間に関節運動を検出する後肢に配置されます。運動解析ソフトウェアは、歩行時、マーカーの動きを測定する使用されます。運動歩行パラメーターが、結果のデータから派生しました。EAE のヒップ、膝および足首の関節の障害者運動を定量化するためのこれらの歩行パラメーターの使用方法を紹介します。これらの技法はより疾患のメカニズムを理解し、MS の機動性を損なう他の神経変性疾患治療の可能性を識別することがあります。

歩行は、歩行を達成するために使用される四肢の反復的な動きのシリーズです。歩行はステップのサイクルは、2 つのフェーズに分かれていますから成る: 立脚、足が体の進む; を推進するために地面に後方移動する場合であります。足が地面および移動転送オフが遊脚相。歩行の障害、脊髄損傷 (SCI)、多発性硬化症 (MS)、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、パーキンソン病 (PD)、ストロークなど、多くの神経変性疾患の認刻極印の特徴これらの疾患の齧歯動物モデルで臨床はしばしばそのそれぞれ歩行障害¹を要約します。マウスにおける歩行の基本的な制御機構は、集中的に調査^2,3をされています。また、多くの人間の神経疾患⁴のマウス ・ モデルがあります。マウスにおける歩行分析は、したがって解剖学的相関が知られているが運動障害のさまざまな側面を測定する魅力的なアプローチが必要です。マウス モデルにおける歩行の研究が赤字運動神経変性疾患の神経病理学的拠点に洞察力を提供して治療の可能性を識別します。

齧歯動物の歩行能力を測定するために使用されているいくつかのテクニックには、目視検査 (例えば、通奏低音マウス スケール⁵とオープン フィールド試験⁶) と腹側平面⁷から歩行の分析が含まれます。後肢の動きの矢状面運動を測定する方法が人気を集めている運動の実行の詳細についてを提供し、その結果が歩行^8,の微妙な変化に敏感ので最近では、^9,10,11. トレッドミル^9,12に歩きながら矢状面における後肢の動きを研究するために開発運動のテクニックは、SCI、ALS、脳外傷、脳卒中のコンテキストで広く研究されているとハンチントン病^{8,9,10、11,13,14,15,16}。対照的に、これらのテクニックは、多発性硬化症¹⁷のマウス ・ モデルの歩行障害の研究に限定的な使用を見てきました。

実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE)、MS¹⁸の最も一般的に使用されるマウス モデルです。EAE 誘導の 2 つの主な方法は、アクティブまたはパッシブの接種を介しています。アクティブな EAE でマウスはミエリン抗原の自己反応性 T 細胞を介した neuroinflammation、脊髄と小脳における脱髄の原因で免疫しました。一方、パッシブ EAE はアクティブ EAE マウスから自己反応性 T 細胞をナイーブなマウス¹⁹に転送することによって誘導されます。病気の経過と病理を中枢神経系 (CNS) 抗原による影響前述の他の場所、およびマウスひずみ^{20,21,22,23,24 ,25}。EAE 実験でマウスはフロイント完全アジュバント (CFA) ミエリン抗原なしで注入されます。EAE は、運動失調、麻痺²⁰昇順麻痺尻尾弱点で始まるし、前肢を含むことができる可能性があることが特徴です。ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 35-55 (モグ_35-55) を受ける c57bl/6 マウスの歩行変化を特徴付けた最近-EAE を誘発します。これらの研究は、歩行分析通常足首運動からの逸脱は EAE マウス²⁶の腰部脊髄白質の損失の程度と相関するので古典的な行動分析よりも優れていることを示しています。対照的に、白質の損失と 2 その他伝統的な行動の措置 (臨床得点と rotarod) の相関の強さは、多くの弱い²⁶だった。

我々 はここでトレッドミルの上を歩いて EAE マウスの矢状面における運動障害を検出するための運動学的歩行分析の使用について説明します。5 つの反射マーカーはヒップ、膝および高速ビデオ録画で足関節の動きを識別するために後肢に置かれました。運動解析ソフトウェアを使用して共同ツアーに関する運動学的データを抽出します。EAE のモグ_{35 55}モデルの運動障害を定量化するこれらの手法の有用性を説明します。これらの技術の神経変性疾患の他のマウス モデルの歩行障害の研究にも当てはまります。

このプロトコルは動物実験ガイドラインのカナダの評議会に従って、ダルハウジー大学動物実験委員会によって承認されました

1。 反射マーカーの構築:

1. 反射紙から小さな円の必要な数をパンチ手持ち穴パンチを使用しています。各動物は、一つの記録の 5 マーカーを必要と2 つの大きなと 3 つの小さなマーカー
。
2. 外周から円の中心に伸びるストレート カットを作る良いハサミを使用すると、します
。
3. は、テープの粘着面を明らかにするためのマーカーの裏紙を削除します。微細鉗子を使用して、マーカーをしっかりとグリップし、円錐形状を形成するあなたの指を使用して自体にカールします。小さなマーカーをするためには、円錐形をしっかりとカールします。大きなマーカーをするためには、円錐形を緩くカールします
。
4. 手持ちの接着剤銃を使用して、コーンの先端を鉗子で把持しながら接着剤で円錐形のマーカーの内側を埋めるし、段ボールの平らな部分にマーカーを付着します。接着剤は、折りたたみと光の最適な反射を確保するため、記録中に曲げからマーカーをできなくなります。ときは、接着剤乾燥 (約 10 分)、メス ( 図 1 a) の段ボールから、マーカーを削除します
。

2。動物を備える記録

1. 麻酔イソフルラン麻酔ガス (2.5%; 2 リットル/分 O ₂) 誘導チャンバーにマウスを置くことによってマウス。マウスが意識、毛布を加熱循環水の上に配置された鼻の円錐形に配置します。Anesthetization の目的はマーカーの配置のためのマウスを固定するには手順は、痛みはありません。したがって、麻酔の深さを評価する必要はありません
。
2. 両方の目に話題の目の潤滑剤を適用します
。
3. は電気バリカンを使用して目的の後肢を剃る。足首から始まり、背骨と肋骨の下部に拡張これがマーカーの接着性が損なわれると、毛皮が残っていないか確認します
   。 注: ここでは、右後肢を記録した;ただし、いずれかの後肢を使用できます
。
4. 腸骨稜と股関節の位置を示す永久的なマーカーを使用しています。腸骨稜、肋骨の下のすぐ下とマウスの下膝を一緒に持って来ることによって容易に触知は ' s ボディ
   。 注: 股関節を曲げると、骨盤と大腿骨の間の関節点を見つけるために足を拡張することによって見つけることができます
。
5. による微細鉗子は 小さな マーカーの先の尖った端をつかんで速効性接着剤でベースまたは同等の代替をディップします。4 桁の先端にマーカーを置き、乾燥して接着剤を許可する 2-3 秒の場所に保持します。中足指節関節と足首に同じ方法 ( 図 1 b) に他の 2 つの小さなマーカーを配置します
。
6. 腸骨稜と股関節 ( 図 1 b) に小さなマーカーと同じように 大きな マーカーを配置します
。
7. は鼻の円錐形からマウスを取り外して転送ケージを使用して録音の部屋にすぐに転送します。静止したトレッドミルの上にマウスを置くし、麻酔から完全に回復を可能にする
。

3。歩行記録

マウスを記録する前に
1. ' s 歩行、トレッドミルの知られている次元と校正用試験片の撮影
   。 注: これは、実際の測定値に変換するビデオのピクセルのようになります。カメラは、トレッドミルから約 120 cm 配置必要があります。
   1. トレッドミルとしてレベルと同じ高さでカメラ位置。校正画像録画同じカメラの位置を維持します
   。
2. マウスは完全に麻酔から回復、一度歩き始めるマウスをように低速 (5 cm/s) にトレッドミルをオンにします。トレッドミル ベルトの方向がそのマウスのマーカーにカメラに向かって直面していることを確認します
。
3. 増加トレッドミル速度まで徐々 に 20 cm/s; これは最も健康なマウスに一貫性のある歩行のための理想的な速度です
   。 注: すべてのマウスを同じ速度で歩くが理想的ですが、いくつかできないことがあります一貫してこの速度に達する。
   1. マウスが 20 cm/秒で、歩くことができる場合は、必要に応じて速度を低減し、これをメモしてください。一貫したステップ サイクルが達成されるまでトレッドミルの速度を低減します
      。 注: 後でデータ分析の速度の違いを調整できます
   。
4. 開始マウスは着実に歩いていったん録画 (すなわち、一貫したペースで歩いて、ない飼育または編む側に)。8 〜 12 の連続したステップのサイクルを記録されているまでは、記録を継続します。レコード、トレッドミル、マウスの側の速度記録すべての動画にします
。 録音が終了したら、
5. はトレッドミルを切りマウスをケージに戻ります。他のマウスが残した香りが着信マウスの動作を変更可能性があります、録音の間に徹底的にトレッドミルをきれい。ストレスを軽減し、皮膚の損傷、; マーカーを削除しないでください。自分でそれらを削除するマウスを許可します
。

4。解析

1. モーション解析ソフトウェアを使用してビデオを処理します
   。 注意: 我々 の実験を使用してカスタム スクリプト イメージングおよび統計ソフトウェアのために設計博士ニコラス Stifani によって書かれた (材料の表 を参照してください)。次の手順は、選択した運動解析ソフトウェアを使用して実行されます。
   1. ビデオからマーカーの座標を抽出し、校正ビデオを使用して、ピクセル値をセンチメートルに変換し各フレームの関節の角度を計算します
   。
   2. 開始とステップ継続時間と長さに関する情報を得るため、各ステップのサイクルの終わりを識別します
   。
   3. スイングやスタンスはそれぞれ 100 フレームによって表されますように 200 の正規化されたフレームにサイクル時間ステップを正規化します
   。
2. 正規化されたフレームを使用して表計算ソフトを用いたデータ解析のための運動学的パラメーターを計算 (材料の表 を参照してください)。 正規化されたフレーム内のすべての角度の平均、特定の関節の角度の平均値の確立、
   1. :
      
      注: x がここに角度の値を表す、正規化された与えられました。フレーム、および n は、正規化されたフレーム数を表します
   。 指定されたマウスの特定の関節の可動域を確立する
   2. 減算次のように正規化されたフレームのセットで最大の角から最小の角度:
      可動域角度 _最大 - _最小 角度 =.
      注: ここで _最大 角度し、角度の _最小値 は正規化ステップ サイクル内にそれぞれ達成の最大と最小の角度
   。 RMS の違いを確立する
   3. はまずベースライン記録から各実験の時間ポイントの角度の平均値を減算します。次に、正方形の各の違い、すべて乗値と平均値の平方根の意味を取る。方程式は次のように:
      
      注: ここで 記録; ベースラインから平均の角度を表します。y は各実験の時間ポイント; から角度の平均値を表しますn 正規化されたフレームの数を表します。ルートって (RMS) の平方差偏差ベースライン録音から歩行を評価するために使用される単位
   。
3. 科学的グラフや統計ソフトウェアを使用して分析し、データ (テーブルの材料 を参照してください).

図 1は、運動学的歩行分析の手順の概略です。最初、反射マーカーは作られた、5 解剖学的ポイントにマウスを配置しました。マウスはトレッドミルで歩いている間、歩行が記録されます。運動解析ソフトウェアを使用して、その後の分析のための運動学的データを抽出します。

図 2A-Cは、間隔を 1 週間離れて 3 つの連続記録セッションで記録されたヒップ、膝および足首の関節角度のコントロール CFA マウスのステップ サイクルを表します。波形間の重複は、セッション 1-3 からステップ サイクルの最小偏差を示しています。図 2 d-Fは、表示セッション 1-3 の記録から大きい歩行変動第 2 コントロール CFA マウスのステップ サイクルを表します。ステップ サイクルは y 軸に沿って移動中の波形の形状は録音の間の一貫性。このレベルの変動はマウスが歩行のために典型的です。

図 3A-Cは 3 つの連続した録音セッションに記録された EAE とマウスのステップ サイクルを表します。最初から歩行に最小限の変更がある歩行が深く変えられたすべての 3 つの関節をされている 2 番目の録音セッションに、第 3 セッションでは。ヒップのステップ サイクル全体にわたって重要な平坦化が発生しましたが、運動の実質的な損失を示します。膝より屈曲と拡張し、動物の体をサポートすることが少ない重量となっています。足首の関節での動きも大幅に変わった。足の背屈と底屈がそれぞれスイング (ホワイト パネル) と姿勢 (緑パネル) フェーズ中に遅延されます。これらの赤字は、動物が遊脚相の中にその足を上げるし、立脚期に前方の体を推進する能力に障害は、この関節の筋力低下を示しています。

図 4で示した次のデータは、Fianderらから再発行いた(2017)²⁶権限を持つ。データは、ベースライン²⁶へのすべての時間ポイントを比較する、ホルム Sidak 複数の比較テストを一方向の反復測定 ANOVA を使用して分析しました。(図 4 bと図 4E) 運動と RMS の違い (図 4および図 4 階) の平均角度 (図 4 a 図 4) 範囲が歩行を定量化するために各時点で計算されました。赤字 (n = グループあたり 8)。今回の EAE 実験における臨床スコアの発症は記録の第 2 週後である DPI 14 だったCFA マウス平均膝角度 (図 4 a) または膝 RMS 違い (図 4)、変化が認められなかったが、膝可動域のわずかな増加を展示した [F(2,7) = 5.871, p = 0.0083]、DPI 16 で (のベースラインを基準として 30図 4B)。この小さな変更は、CFA 注射から生じる痛みを反映可能性があります。CFA 動物と対照をなしてあった大きな変化膝で平均角度の EAE 動物のための共同 [F(6,7) 11.08、 p = < 0.0001] (図 4)、動きの範囲 [F(6,7) 14.42、p = < 0.0001] (図 4E) と RMS違い (図 4 階)。角度の平均値において有意、EAE マウスが歩行時より屈曲膝を持っていたことを示します。動物は自分の体重をサポートするため、膝継手を拡張することができませんでした、これは筋力低下を示すものかもしれません。可動域も減少し、再び動物の膝継手を拡張することができない可能性があります。膝 RMS 違いの大幅な増加は、EAE マウス膝関節の動きが彼らのベースラインの録音から大幅に異なることを示します。

図 5のデータは、ホルム Sidak が臨床スコア 0 で検出されるものに 3.5 0.5 - 臨床スコアに歩行パラメーター値を比較して複数の比較テストである一方向の反復測定 ANOVA を使用して分析しました。相関分析もスピアマン rho (ρ) を使用して行った。平均膝関節角度 (図 5 a)、モーション (図 5 b)、および RMS の違い (図 5) の範囲は強く臨床スコアと有意 (p < 0.001)。これらの関節の動きと古典的な臨床スコアの相関は、EAE マウスの運動障害を評価するために運動学的歩行分析の妥当性を立証します。膝運動 (図 5 a) と RMS の違い (図 5) の範囲は 2.0 の臨床スコアから始まる激減しました (p< 0.05)。障害者の膝の動きが運動障害の臨床スコア 2.0 より低いによって検出に寄与しないことが示唆されました。しかし、膝関節の平均角度 (図 5 b) は 1.0 の臨床スコアから始まる減少した (p< 0.05)。これは、膝の動き、平均角度は、3 つの対策の中で最も敏感な示唆しています。

図 1: マウス記録運動歩行のスケマティック。反射マーカーを行ったら、腸骨稜、股関節、足首、中足指節関節、および 4 桁の先端に配置されます。歩行は、マウスはトレッドミルで歩いている間高速カメラによって記録されます。運動解析ソフトウェアを使用して、その後の分析のための歩行パラメーターを抽出します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: CFA を受け取ったコントロール マウスの 2 つのステップ周期波形の例
白と緑の背景は、スイングやスタンスの位相をそれぞれ表しています。マウス 1、ヒップ (A)、(B)、膝と足首 (C) ステップ サイクル波形は 3 連続記録セッション間隔を離れて 1 週間にわたって互い重なり合います。マウス 2、ヒップ (D)、(E)、膝および足首 (F) ステップ サイクル波形逸脱少し互いから歩行動作の自然な可変性のため。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: EAE マウスにおけるステップ サイクル波形。白と緑の背景は、間隔を離れて一週間連続記録セッションを 3 つのそれぞれ、スイングやスタンスのフェーズを表します。3^rd記録セッション、ヒップ (A)、(B)、膝、足首によって (C) 波形大きく EAE 病気の進行により変更されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 平均角度、モーション、および二乗根の意味の範囲を運動学的データを分析に使用します。EAE マウスの運動障害を定量化する平均角度、動き、および RMS の相違の範囲を求めた。(A) 平均膝角度 CFA マウスの動き (B) と (C) の RMS の範囲は比較的一定。EAE マウス障害膝関節平均角度 (D)、(E) 運動と RMS (F) の範囲を示した。データは、平均 ± 標準偏差で表されますp< 0.05 * * p< 0.01 * * * p< 0.001 差 (DPI)-2; ポスト接種日から# p < 0.05、違い赤字ピークから。参照 26 から元の出版社から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5.平均膝関節角度、運動と誤差の範囲に関連付ける臨床スコア
膝の動きの 3 つの運動学的対策と 2 つの方法を比較する臨床スコアの相関分析を行った。平均膝関節角度 (A)、(B) 運動と RMS の違い (C) の範囲に臨床スコアの相関関係。運動と RMS 違いの膝範囲低下し 2.0 の臨床スコアから始まる平均膝角度は 1.0 の臨床スコアに以前に減少しました。データは、平均 ± 標準偏差で表されますp< 0.05 違う臨床スコア 0.0。スピアマン ・ ロー (ρ) の * * * p< 0.001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

EAE とマウスの運動障害を測定する 2 つの最も一般的な方法臨床得点、rotarod^27,28から待ち時間を落ちる。これらのテクニックには、いくつか制限があります。便利な広く使用されているが、臨床スコアの違いの大きさが知られていないことを意味だけ順序のレベルのデータを生成することによって制限されます臨床得点します。運動障害の性質について正確な情報を提供することができないから苦しむ臨床得点も。Rotarod テスト臨床スコアのいくつかの制限の改善、のみ一般的な運動の協調性を測定し、ウォーキングの特定の側面を測定しません。

比較では、運動学的歩行分析は様々 な関節運動と平均角度の範囲を含む、運動の特定の側面に関する機密対策を提供します。モグ_{35 55} EAE マウスの股関節と膝関節の関節の動きに微妙な赤字は、DPI9、rotarod 赤字²⁶臨床症状の発症前に約 5-9 日で検出されています。これらの赤字は臨床症状の寛解にもかかわらず保持され、rotarod 赤字²⁶の不在で観察されました。重要なは、障害者の足首の動き²⁶脊髄白質の損失と非常によく相関した RMS の違いによって測定されます。

特定の言及に値するいくつかの方法論的点: 1) 共同マーカーの正確さと一貫性の配置は非常に重要です - 股関節と腸骨稜を動悸; によって慎重に識別する必要があります2) 8-12 ステップ サイクルから録音を取得する必要は。これらのステップのサイクル アベレージングによりさらに分析することができる代表的な平均ステップ サイクル3) 最適な照明条件を確立して、マーカーが録音で明確に表示されていることを確認せねばなりません。マーカーが正しく点灯しない場合使用する運動解析プログラムの多くはマニュアルトラッ キングを施行したマーカーを追跡できない、骨の折れるプロセス ビデオをデジタル化します。

この手法の 1 つの追加の制限は、労働集約的であることです。たとえばを記録し 10 マウスのグループからのデータを分析するには、推定約 7.0 9.0 時間 (h) を合計にかかります。作る 50 マーカー (マウスあたり 5) は約 2.0 h. 単独またはペアで記録マウス歩行動作が実行できます。仕事だけでかかるマウスあたり約 25 分かかりますマウスあたり約 10 分をペアでの作業したがって、10 匹のマウスの記録からかかります 1.5 h (ペア) 4.0 h (ソロ)。最後に、データ分析とグラフ作成は、約 3.5 時間を取る。この手法は労働集約的、潜在的な疾患のメカニズムの運動学的歩行分析によって提供される洞察がこの投資を正当化することと思います。病の良い行動相関を持っていることは、シリアル計測は非侵襲的ライブ マウスから取ることができると便利です。足首運動と腰椎脊髄白質の損失²⁶の近く完全な相関関係を考えると、このメソッドは、実験の過程での脱髄と EAE マウスにおける検査時のプロフィールを確認するために使用することができます評価する回復。

歩行分析は、後肢の動きを制限する重度の麻痺で複雑です。ただし、マウスを麻痺も厳しく (臨床スコア > 3.0) ある程度に及ぶことが多い。これらのケースで前肢前方に動物をプルする使用され、いくつかの後肢の運動発生運動学的歩行分析を測定できます。これらの重症でも時間をかけて後肢の機能の回復を測定することも可能です。非常に深刻なケースでのみ (臨床スコアを持つ動物の 20% > ピーク病、DPI 16 23 3.5) を持って行ってない後肢運動の有用な記録を取得することができます。それにもかかわらず、これらの動物は、通常 DPI 30、その時点で得られる意味のある録音を可能にいくつかの後肢の機能を取り戻します。

この技術の将来のアプリケーションは、歩行中、後肢を同時筋電図学的記録と運動学的データを結合です。この技術は、ALS は、SCI のマウス ・ モデルで行われている、歩行、神経、筋活動との関係を明らかにする使用することができます。この方法がより多くの結合もできる MS と焦点 EAE モデル^29,30 cuprizone 誘起脱髄³¹など以上の離散歩行赤字が生じる髄のモデルを対象としました。

については EAE マウスにおける関節運動の計測技術は、歩行を損なう他の疾患にも適用できます。歩行の明確な変化は、PD、SCI、ALS、およびストローク^{8,9,10、11,13,14}のマウス ・ モデルで報告されています。たとえば、PD の齧歯動物モデルは、削減の歩幅と歩行速度³²を維持するために高ケイデンスで速度によって特徴付けられます。運動学的歩行分析したがって、疾患のメカニズムを解明し、これらのモデルを使用して潜在的な治療行動の強力なツールを提供します。

著者は、開示するものがあることを宣言します。

撮影技術的な援助の Sid Chedrawe を認識したいと思います。この作品は、カナダ (EGID 2983) MS 協会からの資金によって支えられました。