ラットの腹部大動脈の収縮を通じて心臓リモデリングのモデル

A rat model of abdominal aortic constriction that induces cardiac hypertrophy and remodeling is described. An efficient, highly-reproducible, and minimally-invasive method is used to provide a simple yet useful platform for research in myocardial hypertrophy and dysfunction.

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and fluid retention. Changes in myocardial structure, electrical conduction, and energy metabolism develop with heart failure, leading to contractile dysfunction, increased risk of arrhythmias, and sudden death. Hypertensive heart disease is one of the key contributing factors of cardiac remodeling associated with heart failure. The most commonly-used animal model mimicking hypertensive heart disease is created via surgical interventions, such as by narrowing the aorta. Abdominal aortic constriction is a useful experimental technique to induce a pressure overload, which leads to heart failure. The surgery can be easily performed, without the need for chest opening or mechanical ventilation. Abdominal aortic constriction-induced cardiac pathology progresses gradually, making this model relevant to clinical hypertensive heart failure. Cardiac injury and remodeling can be observed 10 weeks after the surgery. The method described here provides a simple and effective approach to produce a hypertensive heart disease animal model that is suitable for studying disease mechanisms and for testing novel therapeutics.

心不全は、複雑な臨床症候群、疲労、呼吸困難、運動不耐性を含むそれらの症状、および末梢組織における体液貯留です。これは、先進国¹における死亡の主な原因です。別にサルコメアタンパク質またはイオンチャネル²における突然変異によって引き起こされる継承心筋から、心筋機能障害は、高血圧、心臓弁膜症、肥満、および糖尿病^3を含む医学的状態、種々の方法により生じさせることができます。最終的には心不全^3,4につながる循環要求を満たすために不十分な心臓のポンプ能力、に心筋の構造、電気伝導、およびエネルギー代謝のリードの変化。心不全のメカニズムを調査し、したがって、心臓血管研究の分野において重要です。心不全の進行につながる分子メカニズムを識別することは、最終的に新規治療標的または有用なバイオマーカーの発見を助けることができます 1アップ。ヒト⁵に心不全とキー臨床的特徴を共有する心不全の動物モデルを開発することが重要です。

心臓肥大及びリモデリングが心不全の発症において重要な役割を果たしています。高血圧性心疾患は、心臓肥大およびヒト患者¹に見られる不適応リモデリングの主要な寄与因子です。これらの人間の条件を模倣するために、動物モデルは、多くの場合、外科的処置を介して確立されます。具体的には、横方向または腹部大動脈は、最終的に心臓内の圧負荷につながる左心室に対する抵抗力を高めるために狭窄することができます。この現象は通常、心臓血管系の機能的な要求を満たすために、心臓肥大、心筋細胞の生理学的補償をもたらします。しかし、機能的な需要は、心臓線維症およびcontracにつながる、通常の生理学的代償機構を無効にしますタイルの減損。横方向の大動脈狭窄（TAC）手術は、多くの場合、大動脈弓から開胸、機械換気、および胸腺の分離および脂肪組織を含む複雑な手順を伴います。これとは対照的に、腹部大動脈狭窄は、単純な実験手法^6-8を必要^とします 。腹部大動脈は、左右の腎動脈との間に、手術中の狭窄です。心肥大およびリモデリングは、数週間腹部大動脈狭窄手術^6-8後に観察することができます。彼らは、横大動脈狭窄手術^9,10によって生成されたものと同様の堅固な高血圧性心疾患を生じさせます。ここで、我々は、効率的な再現性の高い、かつ低侵襲性の方法を用いて、ラットで腹部大動脈狭窄を行うためのプロトコルを記述します。腎動脈に隣接し、腹部大動脈を4-0絹糸により形成さ0.72ミリメートルループによって絞られます。手術、心臓肥大およびremodelin後10週間gを観察することができます。腹部大動脈狭窄誘発性心肥大のラットモデルは、病気のメカニズムや病態生理学、ならびに潜在的な治療薬の開発を研究するためのプラットフォームを提供します。

全ての動物実験は、実験動物の管理と使用に関する指針に従って行わ米国国立衛生研究所によって公開（NIH公開番号85-23、1996年改訂）しました。このプロトコルはにより、国立台湾大学の施設内動物管理使用委員会によって定められたガイドラインに基づいて承認されました。

1.動物の手術

1. ホーニング石の上に針の先端を鈍化により、22 G注射針を準備します。ペンチを使用して、直角に針をひだのあります。
2. 手術前に、必要な手術器具や材料、ならびに回復ケージを準備します。使用前にすべての機器および外科用品をオートクレーブ。
3. 200グラムの周りにラットを維持し、食物および水に自由にアクセス制御された温度（21±2℃）で12時間の明/暗サイクルの下でそれらを保ちます。各グループに少なくとも6匹のラットが含まれます。ペントバルビタールでラットを麻酔または別の適切な麻酔薬（0.5ミリリットル、腹腔内を75mg / kg）を。尾の反射をテストすることによって、麻酔の深さを確認してください。
   注：テール反射の欠如は、適切な麻酔の指標です。
4. 体温を維持するために加熱パッドで手術台に仰臥位にラットを置きます。外科的な汚染を避けるために、動物のバリカンヘアリムーバーローションでラットの腹部を剃ります。手術前にベタジンまたは別のクレンジング試薬ときれい-坊主腹部をスクラブ。
   注：これは、作業中は無菌領域を維持することが重要です。
5. メスで、腹部の正中線に沿って2cmの切開を行います。通常の生理食塩水を使用して、手術中に湿った腹部臓器を維持します。後部腹膜領域にある下大静脈を露出させるためにコットンボールを使用して、側に慎重に消化器官を置き換えます。並置され、通常は上にある腹部大動脈を、識別下大静脈の左。
   注：腹部大動脈は、心拍数に合わせて脈動する容器です。
6. 下の血管を明らかにピンセットで腹膜を貫通。静かに腎動脈に隣接する腹部大動脈を隔離し、右の起源と左腎動脈との間に腹部大動脈の下に8センチメートル長4-0絹縫合糸を渡します。
7. 縫合糸と緩い二重結び目を作ります。直径3mmのループを残して、ループ内の鈍化と曲がっ22 G針を配置します。大動脈と針の周りに結び目を締めて、直径0.7mmの収縮を達成するために、直ちに針を取り除きます。
8. 6-0吸収性縫合糸材料と腹腔を閉じます。単純結節縫合で筋肉や皮膚切開を縫合。感染を防ぐために、ヨードチンキで手術部位を洗浄。
9. それは十分な意識を取り戻すまで、自由な移動によって示されるように、慎重に動物を観察しますおよび食物摂取。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。術後の痛みを防ぐために、アセトアミノフェン（0.5ミリリットル中300ミリグラム/ kg、腹腔内）でラットを扱います。
   注：制度的政策によって承認されたように、ユーザは、鎮痛薬を投与すべきです。

2.組織および血液サンプル採取

1. 10週間後の手術では、ラットを計量し、ペントバルビタール（0.5ミリリットル、腹腔内を75mg / kg）で、それを麻酔。手術前に、その尾の反射をテストすることによって、麻酔の深さを確認します。金属製のトレイにラットを置きます。
2. メスを用いて首の正中線に沿って2cmの切開を行います。気管を露出するためにピンセットで慎重に筋肉を変位させます。気管に平行であり、心拍数と時間的に脈動頚動脈を識別するために慎重に観察します。
3. EDTAでコーティングされた採血管に頸動脈から血液を採取します。すぐに遠心分離機2,000×gで15分間、血液および血漿を収集します。必要になるまで-80℃で血漿を保管してください。
4. 剣状突起の正中線の周りに、胸部に5cmの切開を行います。鋭いピンセットでダイアフラムを突き刺します。ハサミを使用して、心臓を露出するために、両側の半ば鎖骨ラインに沿って肋骨を切断して除去します。心臓と血管の境界線に沿って慎重に心を切り出します。組織をつかんずに静かに心を削除します。
5. 灌流針に大動脈トランクを結びつけることによって修正されたランゲンドルフ灌流装置に心をマウントします。クレブス緩衝液で心臓灌流（110 mMの塩化ナトリウム、2.6のKClを含有する1.2mMのKH ₂ PO _4、1.2mMのMgSO ₄を、25mMのNaHCO ₃を、および11 mMグルコース[pHが7.4]）は、血液を洗い流します。心を計量し、心臓重量対体重比を算出します。氷上で4％パラホルムアルデヒドで心臓を修正しました。パラホルムアルデヒド蒸気はTOXであるため、マスクを着用することを忘れないでくださいIC。

3.組織線維症の定量化

1. 組織切片デバイス上でパラホルムアルデヒド固定心臓組織を置き、2ミリメートルの厚さの切片を切りました。包埋カセットに組織切片を置きます。段階的なアルコール浴一連の組織を脱水（50％、75％、95％、1時間毎、100％）。
2. 1時間ワックスに最終的に1時間キシレンで組織に浸潤し。包埋カセットに浸透組織を置き、パラフィンワックスに埋め込むことができます。ミクロトームまで室温でパラフィンブロック中に包埋組織を保管してください。
3. 厚さ4μmの切片に埋め込まれた組織をスライス。 45ºCの水浴中でセクションを配置します。角度で水浴中にスライドガラスを浸し、徐々にスライドへの部分的な付着を可能にするためにパラフィン切片のエッジに近づきます。
4. 組織切片の下で潜在的なエアポケットを除去するために、より良い取り付けを容易にするために、お風呂の中と外にスライドを移動します。ドライトン彼は1時間37ºCでスライドし、組織染色、室温で保管してください。
5. タンクにスライドを置きます。 30分間キシレンでスライドを脱パラフィン化し、最後に蒸留水で（3分間それぞれ95％、75％、50％）を順次希釈アルコールでそれを再水和します。完全に1時間組織切片をカバーするために十分なピクロシリウス赤色の溶液を使用してください。 2変更のための0.5％酢酸溶液中でスライドを洗浄し、その後無水アルコールで2回のすすぎを行います。
6. スライドを空気乾燥し、カバースリップで合成樹脂でスライドをマウントします。可視光フィールドでスライドを撮影。
   注：写真の中の赤い部分は、200Xの倍率で顕微鏡下ピクロシリウス赤のプラスゾーンを示しています。線維症¹¹の程度を示す総面積、オーバーピクロシリウス赤のプラスゾーンの割合を計算します。

4.ブラッドトロポニン定量

1. 血漿トロポニンレベルを定量酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を使用。重複の各サンプルをアッセイ。負荷血漿50μlの、適切なウェルに抗体カクテル50μlの。プレートを密封し、400rpmでプレートシェーカー上で室温で1時間インキュベートします。
   注：血漿中の心臓トロポニンは、心臓傷害のマーカーです。
2. 液体を吸引し、洗浄緩衝液250μlの3回各ウェルを洗浄します。最後の洗浄後、プレートを反転し、過剰な液体を除去するために清潔なペーパータオルに対してそれをブロット。
3. 各ウェルにテトラメチルベンジジン基質100μlを加え、400rpmでプレートシェーカー上で暗所で10分間インキュベートします。各ウェルに停止液100μLを加えます。混合するために1分間プレートシェーカー上でプレートを振ります。 450nmでの光学密度（OD）を記録します。
   注：トロポニン濃度がOD値に比例します。

10週間の腹部大動脈狭窄、手術後、得られた心臓の病状を分析しました。心臓の組織学は、体重に対する心臓重量の比を計算することによって、心臓におけるコラーゲンの量を検出することによって測定しました。心臓の損傷は、プラズマ心筋トロポニンの濃度を測定することにより確認しました。

図1Aに示すように、より高い心臓重量対体重比（ 図1B）、心肥大の指標によって示されるように、心臓の大きさは、腹部大動脈狭窄、手術後に拡大しました。ピクロシリウス赤染色を使用して、増加したコラーゲン含有量（赤）で染色された線維性心筋は、通常領域（イエロー、 図2）から区別することができます。心臓線維症は、Cと比較して、腹部大動脈狭窄手術（ 図2B）の後に増加しました ontrols（ 図2A）。結果は、血漿トロポニン濃度（ 図3）と相関します。増加したトロポニン濃度は圧力の過負荷時の心臓リモデリングと傷害が発生したことを示します。まとめると、明らかに心臓損傷における腹部大動脈狭窄の結果は、心臓肥大、および組織リモデリングをマーク。

図1： 圧負荷時の心肥大 （A）代表心臓と（B）は、心臓重量対体重比は、10週間の腹部大動脈狭窄の手術後に示されています。データが行わ6つの独立した実験の平均±SEMを表します。群間の差は、スチューデントのt検定によって評価しました。 * P <コントロール対0.05。 8fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2： 圧負荷時の心臓線維症。
ピクロシリウス赤染色は増加コラーゲン発現を明らかにしました。 （A）代表ピクロシリウスレッド染色（スケールバー= 200μm）とし、10週間の腹部大動脈狭窄手術後の線維化面積の（B）の割合。データが行わ6つの独立した実験の平均±SEMを表します。群間の差は、スチューデントのt検定によって評価しました。 * P <0.05対対照。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

S / ftp_upload / 54818 / 54818fig3.jpg "/>
図3： 圧負荷時の心臓損傷。
血漿トロポニン濃度は10週間腹部大動脈狭窄、手術後に測定しました。データが行わ6つの独立した実験の平均±SEMを表します。群間の差は、スチューデントのt検定によって評価しました。 * P <0.05対対照。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Hypertensive heart disease, a major health problem that contributes greatly to morbidity and mortality, can lead to cardiac hypertrophy and heart failure⁵. The pathogenesis and progression of hypertensive heart disease in humans is complex, so an appropriate animal model is critical to investigate the underlying mechanisms and to test novel therapeutics that aim to improve cardiac structure and function⁵. The abdominal aortic constriction model, which simulates chronic heart disease, is an effective method for cardiovascular research. The abdominal aorta adjacent to the renal arteries is constricted to induce cardiac remodeling, which eventually leads to cardiac injury. The extent of cardiac remodeling is evaluated by calculating the ratio of heart weight to body weight, performing picrosirius staining for the measurement of collagen expression, and conducting an ELISA-based method for the detection of plasma cardiac troponin levels. The abdominal aortic constriction method allows more reproducible results simulating cardiac remodeling in rat models.

Surgical models of heart disease are advantageous for closely mimicking the pathophysiology of hypertension and aortic stenosis¹. Most of the currently-available surgical techniques to induce cardiac hypertrophy are conducted through transverse aortic constriction^12,13, which is a common experimental procedure used to create a pressure overload. The sudden onset of hypertension that is achieved causes an approximately 50% increase in left ventricle mass within 2 weeks⁵, making the model an excellent choice to examine the molecular mechanisms leading to cardiac hypertrophy. However, transverse aortic constriction requires complex procedures and a high level of surgical skill. The stress associated with open-chest surgery and mechanical ventilation results in high surgical mortality. Moreover, the acute onset of severe hypertension, characteristic of this model, lacks direct clinical relevance⁵. In contrast, abdominal aortic constriction is less technically demanding. The onset and progression of cardiac hypertrophy is gradual, making this model clinically relevant to hypertensive cardiac diseases^1,3. In addition, renal hypoperfusion by abdominal aortic constriction consequently activates the renin-angiotensin system, and therefore, the same surgical technique can be used as an animal model of kidney hypoperfusion injury¹⁵.

After surgery, cardiac pathology, including the appearance of fibrosis in the heart and changes in cardiac function, develops. In the early stages of hypertensive heart disease, myocardial contractility is enhanced by cardiac hypertrophy to compensate for the pressure overload¹⁰. In the later stages of hypertensive heart disease, cardiac function decompensates with fibrosis, which leads to heart failure¹⁰. We did not elaborate on the functional measurements of the heart, including pressure-volume loop analysis¹⁶ and echocardiography¹¹. These approaches are invasive or non-invasive methods that are useful for understanding the changes in cardiac function. The time period after surgery can be varied to produce different degrees of cardiac remodeling. The longer the aorta is constricted, the greater the extent of cardiac dysfunction as a result of remodeling. The picrosirius red staining to measure fibrotic area and the ELISA measurements of plasma troponin levels are useful for the assessment of the degree of cardiac remodeling in order to set the endpoints after the surgery.

A key aspect of the surgery to induce cardiac hypertrophy is the clear identification and constriction of the abdominal aorta. Precision in the placement of the constriction site improves consistency of hypertrophy induction time, since variation in constriction placement may affect the length of time required for hypertrophy induction. The closer the stricture is to the heart, the shorter the induction time needed, although the harder it is to isolate the aorta. The abdominal aorta, between the origins of the right and left renal arteries, is a suitable site for performing constriction. The use of a rat model for the abdominal aortic constriction method has great advantages for the study of cardiac hypertrophy and heart failure. A limitation of this approach is that the surgical incision leads to tissue damage and to the secretion of inflammatory cytokines, which are different from the human cardiac hypertrophy and heart failure resulting from hypertension. Furthermore, the use of anesthetics and analgesics should be cautious, since some of these agents are reported to offer cardioprotective effects¹⁷.

The method described here provides a simple and effective approach to produce cardiac remodeling and injury in rats. Our technique is easy to perform, and the results are robust and reproducible. Once our surgical approach is mastered, this procedure will prove to be a useful platform for the investigation of disease mechanisms and the development of therapeutics in cardiac hypertrophy and remodeling.

The authors have nothing to disclose.

The authors' work was supported by a grant from Ministry of Science and Technology (MOST 103-2320-B-002-068-MY2), the National Health Research Institute (NHRI-EX104-10418SC), and National Taiwan University (NTU 104R4000).