מודל של שיפוץ לב באמצעות התכווצות של אבי העורקים בבטן בחולדות

A rat model of abdominal aortic constriction that induces cardiac hypertrophy and remodeling is described. An efficient, highly-reproducible, and minimally-invasive method is used to provide a simple yet useful platform for research in myocardial hypertrophy and dysfunction.

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and fluid retention. Changes in myocardial structure, electrical conduction, and energy metabolism develop with heart failure, leading to contractile dysfunction, increased risk of arrhythmias, and sudden death. Hypertensive heart disease is one of the key contributing factors of cardiac remodeling associated with heart failure. The most commonly-used animal model mimicking hypertensive heart disease is created via surgical interventions, such as by narrowing the aorta. Abdominal aortic constriction is a useful experimental technique to induce a pressure overload, which leads to heart failure. The surgery can be easily performed, without the need for chest opening or mechanical ventilation. Abdominal aortic constriction-induced cardiac pathology progresses gradually, making this model relevant to clinical hypertensive heart failure. Cardiac injury and remodeling can be observed 10 weeks after the surgery. The method described here provides a simple and effective approach to produce a hypertensive heart disease animal model that is suitable for studying disease mechanisms and for testing novel therapeutics.

אי ספיקת לב היא תסמונת קלינית מורכבת, הסימפטומים מהם כוללים עייפות, קוצר נשימה, לממש סובלנות, והצטברות נוזלים ברקמות פריפריה. זה הוא הגורם המוביל למוות במדינות מפותחות ^1. מלבד קרדיומיופתיה בירושה נגרמת על ידי מוטציות בחלבונים sarcomere או יון ערוצי ^2, תפקוד שריר הלב יכולה להיגרם על ידי מגוון רחב של מצבים רפואיים, כולל יתר לחץ דם, מחלות לב מסתמית, השמנת יתר וסוכרת ^3. שינויים במבנה שריר הלב, הולכה חשמלית, ועופרת מטבוליזם האנרגיה עד אפס מקום השאיבה של הלב לא מספיק לענות על דרישות הדם, אשר בסופו של דבר התוצאות אי ספיקת לב ^3,4. חוקר את המנגנונים אי ספיקת לב, אם כן, הוא קריטי בתחום מחקר לב וכלי דם. זיהוי מנגנונים מולקולריים מה שמובילים להתפתחות אי ספיקת לב בסופו של דבר יכול לסייע לגילוי מטרות טיפוליות חדשניות או סמנים ביולוגיים שימושיים 1. לכן חשוב לפתח מודלים של בעלי חיים באי ספיקת לב חולקות מאפיינים קליניים מפתח עם אי ספיקת לב בבני האדם ^5.

היפרטרופיה שיפוץ לב מלא תפקיד קריטי בהתפתחות של אי ספיקת לב. מחלות לב יתר לחץ דם הוא גורם התורם המרכזי של היפרטרופיה לבבית ואת השיפוץ הסתגלותי לראות בחולים אנושיים ^1. כדי לחקות את התנאים האנושיים הללו, במודלים של בעלי חיים מבוססים לעתים קרובות באמצעות ניתוחים. בפרט, אב העורקים הרוחביים או בטן יכול להיות מכווץ כדי להגביר את ההתנגדות נגד החדר השמאלי, אשר מוביל בסופו של דבר עומס לחץ בלב. תופעה זו בדרך כלל תוצאה היא היפרטרופיה לבבית, פיצוי פיסיולוגי של cardiomyocytes כדי לענות על הביקוש התפקודי של מערכת הלב וכלי הדם. עם זאת, הביקוש הפונקציונלי עוקף את מנגנוני פיצוי הפיסיולוגיים, שמוביל סיסטיק לב contracליקוי אריח. התכווצות העורקים רוחבי (TAC) ניתוח כרוך לעתים קרובות הליכים מסובכים, כולל פתיחת בית החזה, הנשמה מלאכותית, והפרדה של התימוס ורקמות שומן מן קשת אבי העורקים. לעומת זאת, היצרות אבי העורקים בבטן דורש ניסיוני בטכניקות פשוטות ^6-8. אב העורקים בבטן, בין השמאל עורק כליות תקינות, הוא מכווץ במהלך הניתוח. היפרטרופיה שיפוץ הלב ניתן לצפות כמה שבועות לאחר הניתוח היצרות אאורטלית בטנית ^6-8; הם מייצרים מחלות לב יתר לחץ דם חזק דומות לזה שנוצר על ידי הניתוח הרוחבי אב העורקים היצרות ^9,10. כאן אנו מתארים פרוטוקול לנהל התכווצות אאורטלית בטנית בחולדות באמצעות שיטה יעילה, פערים לשחזור, מינימאלי פולשנית. אבי העורקים בבטן סמוך לעורקי הכליה הוא מוגבל בגלל לולאה 0.72 מ"מ נוצר על ידי חוט משי 4-0. עשרה שבועות לאחר הניתוח, היפרטרופיה לב remodelinניתן לצפות גרם. מודל החולדה של היפרטרופיה לבבית הנגרמת התכווצות אאורטלית בטנית מספק פלטפורמה ללימוד מנגנוני מחלה והפתופיזיולוגיה, כמו גם פיתוח תרופות פוטנציאליות.

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, שפורסם על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות (NIH פרסום לא. 85-23, מתוקנת 1996). פרוטוקול זה אושר על ידי ובהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי הוועדה השתמשתי ב- National טייוואן האוניברסיטה.

1. ניתוח בעלי חיים

1. הכן מחט מזרק 22 G על ידי להקהות את קצה המחט על אבן השחזה. באמצעות צבת, plicate המחט לזווית ישרה.
2. לפני הניתוח, להכין את מכשירי ניתוח הנדרשים וחומרים, וכן בכלוב התאוששות. חיטוי כל המכשירים ואספקה ​​כירורגית לפני השימוש.
3. לשמור על החולדות סביב 200 גרמו ולשמור אותם תחת 12 שעות אור / מחזורים כהים בטמפרטורה מבוקרת (21 ± 2 ° C) עם גישה חופשית למזון ומים. לכלול לפחות 6 חולדות בכל קבוצה. להרדים את החולדות עם pentobarbital(75 מ"ג / ק"ג ב 0.5 מ"ל, IP) או סוכן אחר הרדמה המתאים. אשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הזנב.
   הערה: היעדר רפלקס הזנב מהווה אינדיקטור הרדמה נאותה.
4. מניח חולדה במצב שכיבה על פלטפורמת ניתוח עם כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. לגלח את אזור הבטן של חולדה עם גוזז שיער בעלי חיים ותחליב מסיר שיער כדי למנוע זיהומים כירורגית. שפשפו את הבטן-מגולח למשעי בבטאדין או אחר מגיב טיהור לפני הניתוח.
   הערה: חשוב לשמור על שדה סטרילי לאורך כל ההליך.
5. ביצוע חתך 2 ס"מ לאורך קו האמצע של הבטן עם אזמל. באמצעות מלח רגיל, לשמור על איברי הבטן לחות במהלך הניתוח. לעקור את אברי העיכול בזהירות לצד באמצעות כדורי צמר גפן כדי לחשוף את הווריד הנבוב הנח שנמצא באזור הצפק האחורי. זהה את אבי העורקים בבטן, השוכנת בצמוד ובדרך כלל עלהשמאלי של הווריד הנבוב הנח.
   הערה: אבי העורקים בבטן הוא כלי כי פועם בזמן עם קצב הלב.
6. פירס הצפק עם זוג מלקחיים כדי לחשוף את הכלי מתחת. בעדינות לבודד את אבי העורקים בבטן סמוך לעורקי הכליה ומעבירה 8 ס"מ באורך 4-0 תפר משי מתחת אבי העורקים בבטן בין מקורותיה של הזכות ועורקים כליות עזב.
7. הפוך קשר כפול רופף עם התפר; לעזוב לולאה בקוטר 3 מ"מ, ומניח את מחט 22 G הקהה והתכופפה בתוך הלולאה. הדקו את הקשר סביב האאורטה המחט, ולאחר מכן להוציא את המחט מיד כדי להשיג כיווץ בקוטר 0.7 מ"מ.
8. סגור את חלל הבטן עם 6-0 חומר תפר נספג. לתפור את החתכים השרירים או עור עם תפרי קטע פשוט. כדי למנוע הידבקות, לשפשף את האתר כירורגית עם תמיסת יוד.
9. שים החיה בזהירות עד שהוא חוזר להכרה מספקת, כפי שצוין על ידי תנועה חופשיתואת צריכת מזון. אל תשאירו חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. כדי למנוע את הכאב שלאחר הניתוח, לטפל החולדה עם פרצטמול (300 מ"ג / ק"ג ב 0.5 מ"ל, ip).
   הערה חשובה: משתמשים צריכים לנהל משככי כאבים כפי שאושרו על ידי מדיניות מוסדית.

2. אוסף דוגמאות רקמות ודם

1. בשעה 10 שבועות לאחר הניתוח, לשקול את העכברוש להרדים אותו עם pentobarbital (75 מ"ג / ק"ג ב 0.5 מ"ל, ip). לפני הניתוח, לאשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס זנב. מניחים את החולדה על מגש מתכת.
2. ביצוע חתך 2 ס"מ לאורך קו האמצע של הצוואר באמצעות אזמל. לעקור את השרירים בזהירות עם מלקחיים כדי לחשוף את קנה הנשימה. שימו לב בזהירות לזהות את העורק הראשי, אשר במקביל קנה הנשימה לפעום בזמן עם קצב הלב.
3. אסוף את הדם בעורק התרדמה לתוך צינור איסוף דם מצופה EDTA. צנטריפוגות מידהדם במשך 15 דקות XG ב 2000 ולאסוף הפלזמה. אחסן את הפלזמה בדם ב -80 ° C עד הצורך.
4. ביצוע חתך 5 ס"מ באזור החזה, סביב קו האמצע של תהליך xyphoid. פירס את הסרעפת עם מלקחיים חדים. בעזרת זוג מספריים, לחתוך ולהסיר כלוב הצלעות לאורך קווי אמצע clavicular משני הצדדים כדי לחשוף את הלב. ובלו הלב בזהירות לאורך גבולות לב וכלי דם. הסר את הלב בעדינות מבלי תופס את הרקמה.
5. הר לב על מנגנון זלוף Langendorff שונה על ידי קשירת המטען אבי העורקים אל המחט זלוף. Perfuse הלב עם חיץ קרבס (המכיל 110 mM NaCl, KCl 2.6 מ"מ, 1.2 מ"מ KH _{2 4} PO, 1.2 ₄ מ"מ MgSO, 25 מ"מ NaHCO _3, ו -11 גלוקוז מ"מ [pH 7.4]) כדי לשטוף את הדם. לשקול את הלב ואת לחשב את יחס לב-משקל ל-משקל גוף. תקן את הלב עם paraformaldehyde 4% על הקרח. זכור ללבוש מסכה, מאז אדי paraformaldehyde הוא toxic.

3. רקמות פיברוזיס כימות

1. הנח את רקמת הלב קבוע paraformaldehyde במכשיר חתך רקמות לחתוך 2 מ"מ חלקים עבים. מניח את סעיפי רקמות קלטת הטבעה. מייבש את רקמת דרך סדרה של אמבטיות אלכוהול מדורגים (50%, 75%, 95%, ו -100% עבור שעה 1 כל אחד).
2. לחדור את הרקמה עם קסילן במשך שעה 1 ולבסוף בשעווה במשך שעה 1. הנח את הרקמה הסתננה קלטת הטבעה ולהטביע עם שעוות פרפין. אחסן את הרקמות המוטבעות בבלוקי פרפין בטמפרטורת חדר עד microtoming.
3. פורס את הרקמה מוטבעת לתוך 4 חלקים עבים מיקרומטר. מניחים את הסעיפים באמבט מים 45 ºC. טובלים שקופיות זכוכית לאמבטיה מים בזווית ובהדרגה להתקרב קצוות בסעיף פרפין כדי לאפשר התקשרות חלקית לשקופית.
4. להעביר את השקף פנימה וחוצה של האמבטיה כדי להסיר כיסי אוויר פוטנציאל תחת סעיף הרקמות כדי להקל מצורף טוב יותר. t יבשהוא מחליק על 37 ºC עבור שעה 1 ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר למשך מכתים היסטולוגית.
5. שים את השקופית לתוך טנק. Deparaffinize השקופית עם קסילן במשך 30 דקות ולאחר רעננותם זה באלכוהול מדולל ברצף (95%, 75%, ו -50% עבור 3 דקות כל אחד) ולבסוף במים מזוקקים. השתמש פתרון picrosirius אדום מספיק לכיסוי סעיפי רקמות לחלוטין עבור שעה 1. יש לשטוף את שקופיות פתרון חומצה אצטית 0.5% עבור שני שינויים, ולאחר מכן לבצע שתי שטיפות באלכוהול מוחלט.
6. האוויר יבש שקופיות ואת הר שקופית שרף סינטטי עם coverslip. צלם את השקופית בשדה האור הנראה.
   הערה: האזור האדום בתצלום מראה אזור חיובי אדום picrosirius במיקרוסקופ בהגדלת 200X. חישוב האחוזים באזור החיובי האדום picrosirius מעל השטח הכולל, אשר מצביע על מידת סיסטיק ^11.

4. דם Troponin כימות

1. לכמת רמות טרופונין פלזמהבאמצעות assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA). Assay כל דגימה בשני עותקים. טען 50 μl של פלזמת דם 50 μl של קוקטייל נוגדנים לתוך הבארות המתאימות. חותם את הצלחת דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר על שייקר צלחת ב 400 סל"ד.
   הערה: טרופונין לב בפלסמה מהווה סמן בגין נזקי לב.
2. לשאוב את הנוזל ולשטוף היטב עם כל 250 μl של חיץ לשטוף שלוש פעמים. לאחר לשטוף האחרון, להפוך את הצלחת ואת הכתם זה נגד מגבות נייר נקיות כדי להסיר את הנוזל מוגזם.
3. הוספת 100 μl של המצע tetramethylbenzidine היטב כל דגירה במשך 10 דקות בחושך על שייקר צלחת ב 400 סל"ד. הוספת 100 μl של פתרון להפסיק היטב כל אחד. לנער את הצלחת על שייקר צלחת דקות 1 לערבב. רשום את הצפיפות האופטית (OD) ב -450 nm.
   הערה: ריכוז טרופונין הוא מידתי לערך OD.

10 שבועות לאחר הניתוח היצרות אאורטלית בטנית, הפתולוגיה לב וכתוצאה מכך נותחה. היסטולוגיה הלב נמדדה על ידי חישוב היחס בין משקל לב למשקל הגוף על ידי גילוי כמות הקולגן בלב. פציעת לב אושרה על ידי מדידת ריכוז טרופונין לבבי פלזמה.

כפי שניתן לראות בתרשים 1 א ', את גודל הלב הורחב לאחר הניתוח היצרות אאורטלית בטנית, כפי שהוכח על ידי גבוה לב-משקל אל הגוף יחס משקל (איור 1B), אינדיקטור של היפרטרופיה לבבית. באמצעות מכתים אדום picrosirius, שריר לב fibrotic מוכתם תוכן קולגן מוגבר (אדום) ניתן להבחין בין אזורים רגילים (צהוב, איור 2). סיסטיק לב הוגדל לאחר הניתוח היצרות אאורטלית בטנית (תרשים 2B) לעומת ג ontrols (איור 2 א). התוצאות לתאם עם ריכוזי טרופונין פלזמה (איור 3). ריכוז טרופונין מוגבר עולה כי שיפוץ לבבי פגיעה במהלך עומס לחץ אירע. יחדיו, תוצאות היצרות אאורטלית בטנית לפציעת לב ניכרת, מסומן היפרטרופיה לבבית, שיפוץ רקמות.

איור 1:. היפרטרופיה לב במהלך עומס לחץ (א) נציג לב (B) לב-משקל ל-משקל גוף יחסים מוצגים 10 שבועות לאחר ניתוח היצרות אאורטלית בטנית. הנתונים מייצגים את ממוצע ± SEM של שישה ניסויים עצמאיים שבוצעו. הבדלים בין הקבוצות הוערכו על ידי מבחן t. * P <0.05 לעומת שליטה. 8fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: פיברוזיס לב במהלך עומס לחץ.
מכתים אדום Picrosirius גילה ביטוי קולגן מוגבר. (א) נציג picrosirius מכתים אדום (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר) ו- (ב) אחוז שטח fibrotic 10 שבועות לאחר הניתוח היצרות אאורטלית בטנית. הנתונים מייצגים את ממוצע ± SEM של שישה ניסויים עצמאיים שבוצעו. הבדלים בין הקבוצות הוערכו על ידי מבחן t. * p <0.05 לעומת שליטה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

s / ftp_upload / 54,818 / 54818fig3.jpg "/>
איור 3: פגיעת לב במהלך עומס לחץ.
ריכוזי דם טרופונין פלזמה נמדדו 10 שבועות לאחר הניתוח היצרות אאורטלית בטנית. הנתונים מייצגים את ממוצע ± SEM של שישה ניסויים עצמאיים שבוצעו. הבדלים בין הקבוצות הוערכו על ידי מבחן t. * p <0.05 לעומת שליטה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Hypertensive heart disease, a major health problem that contributes greatly to morbidity and mortality, can lead to cardiac hypertrophy and heart failure⁵. The pathogenesis and progression of hypertensive heart disease in humans is complex, so an appropriate animal model is critical to investigate the underlying mechanisms and to test novel therapeutics that aim to improve cardiac structure and function⁵. The abdominal aortic constriction model, which simulates chronic heart disease, is an effective method for cardiovascular research. The abdominal aorta adjacent to the renal arteries is constricted to induce cardiac remodeling, which eventually leads to cardiac injury. The extent of cardiac remodeling is evaluated by calculating the ratio of heart weight to body weight, performing picrosirius staining for the measurement of collagen expression, and conducting an ELISA-based method for the detection of plasma cardiac troponin levels. The abdominal aortic constriction method allows more reproducible results simulating cardiac remodeling in rat models.

Surgical models of heart disease are advantageous for closely mimicking the pathophysiology of hypertension and aortic stenosis¹. Most of the currently-available surgical techniques to induce cardiac hypertrophy are conducted through transverse aortic constriction^12,13, which is a common experimental procedure used to create a pressure overload. The sudden onset of hypertension that is achieved causes an approximately 50% increase in left ventricle mass within 2 weeks⁵, making the model an excellent choice to examine the molecular mechanisms leading to cardiac hypertrophy. However, transverse aortic constriction requires complex procedures and a high level of surgical skill. The stress associated with open-chest surgery and mechanical ventilation results in high surgical mortality. Moreover, the acute onset of severe hypertension, characteristic of this model, lacks direct clinical relevance⁵. In contrast, abdominal aortic constriction is less technically demanding. The onset and progression of cardiac hypertrophy is gradual, making this model clinically relevant to hypertensive cardiac diseases^1,3. In addition, renal hypoperfusion by abdominal aortic constriction consequently activates the renin-angiotensin system, and therefore, the same surgical technique can be used as an animal model of kidney hypoperfusion injury¹⁵.

After surgery, cardiac pathology, including the appearance of fibrosis in the heart and changes in cardiac function, develops. In the early stages of hypertensive heart disease, myocardial contractility is enhanced by cardiac hypertrophy to compensate for the pressure overload¹⁰. In the later stages of hypertensive heart disease, cardiac function decompensates with fibrosis, which leads to heart failure¹⁰. We did not elaborate on the functional measurements of the heart, including pressure-volume loop analysis¹⁶ and echocardiography¹¹. These approaches are invasive or non-invasive methods that are useful for understanding the changes in cardiac function. The time period after surgery can be varied to produce different degrees of cardiac remodeling. The longer the aorta is constricted, the greater the extent of cardiac dysfunction as a result of remodeling. The picrosirius red staining to measure fibrotic area and the ELISA measurements of plasma troponin levels are useful for the assessment of the degree of cardiac remodeling in order to set the endpoints after the surgery.

A key aspect of the surgery to induce cardiac hypertrophy is the clear identification and constriction of the abdominal aorta. Precision in the placement of the constriction site improves consistency of hypertrophy induction time, since variation in constriction placement may affect the length of time required for hypertrophy induction. The closer the stricture is to the heart, the shorter the induction time needed, although the harder it is to isolate the aorta. The abdominal aorta, between the origins of the right and left renal arteries, is a suitable site for performing constriction. The use of a rat model for the abdominal aortic constriction method has great advantages for the study of cardiac hypertrophy and heart failure. A limitation of this approach is that the surgical incision leads to tissue damage and to the secretion of inflammatory cytokines, which are different from the human cardiac hypertrophy and heart failure resulting from hypertension. Furthermore, the use of anesthetics and analgesics should be cautious, since some of these agents are reported to offer cardioprotective effects¹⁷.

The method described here provides a simple and effective approach to produce cardiac remodeling and injury in rats. Our technique is easy to perform, and the results are robust and reproducible. Once our surgical approach is mastered, this procedure will prove to be a useful platform for the investigation of disease mechanisms and the development of therapeutics in cardiac hypertrophy and remodeling.

The authors have nothing to disclose.

The authors' work was supported by a grant from Ministry of Science and Technology (MOST 103-2320-B-002-068-MY2), the National Health Research Institute (NHRI-EX104-10418SC), and National Taiwan University (NTU 104R4000).