Nailfold Capillaroscopyを使用して、毛細血管密度の定量のための再現性のコンピュータ化された方法

Capillaroscopy is a non-invasive, efficient, relatively inexpensive and easy-to-learn methodology for directly visualizing capillaries in the microcirculation. However, only one publication to date describes the reliability of a complex software program available for quantitating capillaroscopy data. Here, we present a simple, reliable protocol for quantitating capillaries using a standardized algorithm.

Capillaroscopyは、効率的で、直接微小循環を可視化するための方法論を学ぶために、比較的安価で容易な非侵襲的です。 capillaroscopy技術は、潜在的に価値のある皮膚科、眼科、リウマチおよび心血管臨床のさまざまなアプリケーションにつながる、患者の微小血管の健康への洞察を提供することができます。さらに、腫瘍増殖は、腫瘍内微小血管密度を測定することによって定量することができる血管形成に依存してもよいです。しかし、技術の無い標準化に現在ほとんどありませんし、現在まで唯一の出版物はcapillaroscopyデータを定量するための現在利用可能な、複雑なコンピュータベースのアルゴリズムの信頼性を報告します^。1本論文では、アルゴリズムをカウント新しい、より簡単な、信頼性の高い、標準化された毛細血管を説明nailfold capillaroscopyデータを定量します。このような単純な、再現性のあるコンピュータ化されたcapillaroscopyアルゴリズムは、より多くのを容易にするであろう研究者や臨床医の間で技術の普及。多くの研究者は、現在の結果のユーザ疲労や主観を促進し、手でcapillaroscopy画像を解析。本稿では、再現性、半自動計数アルゴリズムに加えて新たな、簡単に使用できる自動化された画像処理アルゴリズムを説明します。このアルゴリズムは、主観を削減しながら、数分で画像の解析を可能にします。トレーニング時間の最小量は、（我々の経験では、1時間未満）が技術を習得するために必要とされます。

微小血管イメージングは、多くの潜在的な臨床用途に急速に成長している分野である^。2例えば、癌専門医は、可能な治療の選択肢への腫瘍と洞察力の状態に関する貴重な情報が得られる、腫瘍血管新生の程度を決定するために微小血管イメージングを使用しています^{。3 4}しかし、 nailfoldのcapillaroscopyは、おそらく微小血管イメージングの最もコスト効率的で広く適用可能な形態です。研究者らは、血流量を研究し、毛細血管の形態を調査するために、ビデオnailfoldのcapillaroscopyを使用しています^{。5 6}両方のビデオと静止画nailfoldのcapillaroscopyをレイノー現象や、全身性硬化症などの様々な結合組織疾患の診断と治療の世話をするために補助剤です^。2

Nailfold capillaroscopyは、同様に、様々な潜在的な心血管系の用途を有します。 nailfold capillaroscopyを使用して現在の研究は示唆していますその糖尿病1型および2型の患者が異常な毛細管形態の有病率が高いを示し、まだ非糖尿病個体と比較して変わらない毛細血管密度を有する^。7-8 Capillaroscopyも高血圧で実験的に研究されてきました。減少毛細血管密度につながる構造毛細管希薄非高血圧個体と比較して、高血圧の個体において実証されている^。9-10これらの古い高血圧患者とは対照的に、構造的な希薄化を示し、より最近の研究はことを示した（40および上記の平均年齢）若い高血圧患者は（40歳未満の平均年齢）構造的希薄化することなく、機能的な希薄化を持っている^。11これは、機能的な希薄化を前に発生し、構造的な希薄化に時間をかけて進行し得ることを示唆しています。

興味深いことに、このようなペリンドプリル/インダパミドなどの特定の降圧薬で処置された高血圧患者はノルムを表示しましたアル毛細血管密度および治療 ​​後内皮機能、ACE（アンジオテンシン変換酵素）阻害剤または利尿剤で処置したものは、同程度の血圧制御にもかかわらず、低毛細血管密度を維持しながら¹²は、これは、いくつかの降圧薬は、毛細管を逆にすることによって毛細血管密度を正規化することを示唆しています高血圧によって生じる希薄化。また、他の研究者は、食塩摂取量の減少は高血圧の個体の両方の機能的および構造的な毛細管希薄の逆転につながることが示されている^。13

この技術の様々な潜在的な臨床応用にもかかわらず、ほとんどの標準化は、毛細血管密度画像を定量するための技術であります^。2日に、研究者は毛細血管密度の結果のみが正確な場合、イントラオブザーバーと観察者間の両方の観点から、再現性があることを発見しました同じ領域が毎回カウントされている^{。1,14 15} 注目すべきは、以前の研究者は、主に遅く、主観的なプロセスである裸眼^{、9 16 17 18を}使用して手動でキャピラリーカウントを行いました。

毛細血管画像の定量のための標準化された、コンピュータベースのアルゴリズムは、理論的にcapillaroscopyの臨床応用を促進する、より少ない主観で、より効率的かつ再現可能なデータ分析を提供しています。一部の研究者は、確かにnailfold capillaroscopic写真からデータを定量するために、コンピュータベースのプログラムを使用していた^{。1,6 19 20}しかし、現在までの唯一の出版物は、capillaroscopyデータを定量化するために利用可能な複雑なソフトウェアプログラムの信頼性を説明し^1、このプログラムは次のように複雑です以前にまったく同じ視野をカウントするための要件によって上記の。ここでは、することが可能標準化されたアルゴリズムを使用して、毛細血管を定量するための簡単​​な、信頼性の高いプロトコルを提示複数の視覚的なフィールドの使用。複数の視野を使用すると、手続きを簡素化するだけでなく、毛細血管数の正常な生物学的変化の評価を可能にするだけでなく。

本研究の目的は、毛細管定量プロセスを標準化し、再現性、効率的なコンピュータベースのアルゴリズムを記述することです。これらの方法は完全に自動化されていないが、彼らは非常に少ないユーザー入力を必要とし、絵の迅速かつ信頼性の高い定量を提供します。

注：キャピラリーの画像を取得するための取得プロセスは、以前に公開されていると、対応する画像取得と解析コンピュータプログラムでデジタルスチルカメラを用いて達成される^{11 21}この実験室分析のために静止画像を利用していないビデオ、分析のための画像取得を単純化します。以下は、画像から毛細血管を定量するための新しい技術が記載されています。

1.画像強調処理

1. モノクロデジタルカメラとデジタル画像を取得します。このようなカメラで支配者として知られている長さの物体を撮影することにより、既知の大きさの物体に画像を調整します。このプロセスは、正確に測定し、処理後の毛細血管を計数するためのコンピュータプログラムを可能にします。理想的には最高の精度のために、レチクル（それにエッチング定規とガラスの科学的に製造された作品）を使用する必要があります。 1mm角の画素数を測定しますコンピュータプログラムを使用してボックス。
   注：このプロトコルの再現性と標準化の鍵となるのは、主にカウントさ1ミリメートル²ボックスの適切な配置に依存しています。
2. 毛細血管を暗くし、毛細血管の可視化を最大化する背景を、軽減するコントラスト強調ツールを使用してください。背景からの毛細血管の初期分化は、後工程での画像の適切なトリミングのために重要です。使用して画像を調整することでこれを行ってくださいにこのクリックを行うには「最適ヒストグラムを。」：キャプチャ、強度、画像ヒストグラム、ベストフィット。
3. 新しいイメージとしてキャピラリーカウント用の関心領域（ROI）をトリミング（、関心領域を選択します）。 1ミリメートルに等しい530ピクセルで画像を較正することによって決定された1ミリメートル²ボックスを使用してください。トリミングされた画像は、画像の一番上に毛細血管ループの頂点を配置していることを確認してください。
4. したがって、すべての将来像の調整が均等に適用される画像を平らに画像。で、この表示することができません：、プロセスタブ、2Dフィルタを平らに、「明るい、 "オブジェクトの幅のBG強度が「75」適用します。
5. 毛細血管を最大限に可視化されるように画像のコントラストを上げます。これを行うには、クリック：75にコントラストを上げ、タブ、ディスプレイを調整します。
6. プロセス]タブ、2Dフィルタ、スペックル除去、カーネルサイズ7×7をクリックすることにより毛細血管の縁を滑らかに画像をスペックル除去、適用されます。
7. 毛細血管が黒で、背景が白になるように画像のコントラストを確定。 「ベストフィット」モデルにヒストグラムを調整することによって、この手順を実行します。
   注：処理された画像は、次の手順を実行してどのように見えるかの例については、代表的な結果では、図2を参照してください。

キャピラリーカウント/定量毛細血管密度の実行2.

1. 各画像には、手動で「対象オブジェクト」featurを使用して、明確に定義された毛細血管の一部を選択eはプログラムによってカウントされるオブジェクトとして認識されます。そして、カウントアルゴリズムによって無視される必要がある領域を基準として、「バックグラウンド」機能を使用して、背景の小さな部分を選択します。
   注：これらのハイライトの組み合わせは、バックグラウンドノイズを無視して、すべての毛細血管が強調表示されます。定量（カウント）プロトコルは、色や形態学に基づいて画像の一部を区別するためにコンピュータ機能を利用します。
2. 瞬時に撮像装置を用いて画像内のすべての毛細血管をカウントするカウント機能を使用してください。キャピラリとしてバックグラウンドノイズをカウントしないようにするために5ピクセルのカウントオブジェクトの最小直径を設定します。
3. より信頼性の高い評価を得るために、4つの画像 - 各個人のために、3の平均を数えます。
   注：画像は、カウンティング手順の間にどのように見えるかの例については、代表的な結果では図3を参照してください。

3.作成して画像処理を自動化するマクロの使用

注：時間を節約するために、マクロを自動的に一つ又は多数の画像上のプロセスの特定のシーケンスを実行するために作成することができます。これらの配列は、画像の修正を迅速にするためにカスタマイズすることができます。本質的には、これらのマクロは、画像を処理する方法を覚えて、迅速かつユーザー入力ですべての手順を実行します。マクロのない絵あたり約8分とは対照的に、12キャピラリー画像にカウントを実行すると、マクロ（画像ごとに2〜3分）で20〜30分の間、このラボを取ります。したがって、マクロを使用すると、手動で各個々の画像を処理するよりも3〜5倍、より効率的です。

1. マクロを作成するためには、「マクロの記録」を選択し、一つの画像の上に、上記の手順1と2で説明したようにステップとプロセスは、希望する実行します。今後の参考のために実行された画像処理の手順に基づいて、マクロに名前を付けます。ときUSIを将来の絵のマクロngを、単に「実行マクロ」をクリックして、プログラムが自動的に所望の画像（複数可）に記録された拡張機能が適用されます。
   注：このラボでは、数秒のメソッドの第1のステップの一つが、すべてを実行するマクロを使用しています。ユーザー入力を必要とする唯一のステップは、どこで画像をトリミングするために、ステップ1.2を選んでいます。

この画像処理手順の目的は、それらが正確に定量することができるように、背景画像から毛細血管を区別することです。不完全な画像処理や過度の画像処理の両方が毛細血管を定量化するためのプログラムの機能に有害です。 図3に見られるように、不完全な画像処理は、バックグラウンドから区別する毛細血管を困難にします。これは、ユーザーが、上記のカウント方法が正確にいくつかの毛細血管を強調表示するユーザの能力に依存するため容易に毛細血管の境界を区別することができることが重要です。一方、 図3に見られるように、不要な画像処理手順の適用は、毛細血管のボケとしたがって、定量化プロセスに有害であり得るにつながる可能性があります。

最適に処理された画像は、30秒以内にカウントされ、明確ような背景から、毛細血管を区別することができます互いにだけでなく、個々のキャピラリー。処理された画像の例を図3に示すカウント画像と、 図2パートDに見られます。

毛細血管密度はカウントさnailbedの場所によって異なります。 表1は、毛細血管密度がnailbedで毛細血管の一番上の行からの距離に応じて増加することを示します。 ROIの配置の標準化は、再現性をカウントすることが重要です。画像は別のROIの配置を変更することができる方法を図1に示す図 。

表1：キャピラリーの変化が爪ベッドにディファレンシャル測位でカウント ROIボックスを可変上部に配置されている場合、このテーブルには、（A、B、C）は、3つの異なる患者に対して得られた数を示しています（T1カウント- T4）を、ミドル。 （M1 - M4）、および下側の領域（L1 - L4）爪床の。平均数が異なる研究室から得られた数を比較するために、ROIボックスの配置の標準化の必要性を実証し、領域を下げるために上から増加します。

表1に見られるように、ステップ1.2に記載の領域でカウントを行い、ベースラインの数は、これらのD、静脈閉塞の数が50から100までの任意の範囲とすることができる/ ^mm 2としながら30〜60の範囲であるべきであるキャピラリensitiesは、他の文献とは異なります。このラボは、密度が最も低い毛細血管の最初の行、でカウントを開始しますので、著者らの研究室で得られた毛細血管密度数は、おそらく低いです。アントニオら ⁹とDebbabi らによって以前に得られた値に向かってカウントを増加nailbedの下の領域でカウントを行い、 表1に見られるように¹⁶この不一致は、最初の（最もをカウントすることによってnailbed capillaroscopyの定量における標準化の必要性を示しています毛細血管の近位）行。毛細血管は最も明確かつ完全に最初の行に可視化し、徐々に後続の行で見えにくくなっているため、毛細血管の最初の行からカウントしても最適です。

N = 10の被験者と2人の独立した観察者を使用して、盲検の再現実験を行いました。信頼性の結果は、AVによって得られた平均値A、B、およびCの数を指しそれぞれに4つの画像全体の結果をeraging。 A、B、およびCの数は、ここで簡単に要約し、微小血管の健康を評価するために使用されるのと同じ個体内の異なる生理学的状態を表します。詳細は、以前に^21を公開されています。毛細血管密度は、指nailfold皮膚の平方ミリメートル当たりの毛細血管数（ ^平方ミリメートル）として定義されます。ステージAは、毛細血管が連続的に^16を灌流する休息ベースライン段階です。ステージBはpostocclusive反応性充血時に発生します。これらのカウントは継続的に灌流し、断続的に灌流（予備能）毛細血管の合計を表しています。この段階は、毛細管機能¹⁶の尺度として使用されます。

ステージCは、したがって、両方の（アクティブな赤血球（RBC）の動きで）灌流し、かん流されない（停滞、非移動赤血球で満たされた）毛細血管を含む最大の毛細血管密度を示す、静脈閉塞中に発生します^。22

クロップ場所を標準化1.図。この図は、ROIボックスの変数配置が目に見えてトリミングした画像を変更する方法を示しています。左側には、ボックスには、毛細血管の最初の行をカット、低すぎる配置されます。中央のボックスは、毛細血管の最初の行の上に空白を引き起こして、あまりにも高く配置されています。右側のボックスが最適に配置されます。そのトリミングされた画像は、cの最初の行を示しています画像の最上部にapillaries。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図画像処理の2段階（A）段階Aはモノクロカメラで被験者のnailbedから採取した初期画像を示し、（B）段階Bは、第1のコントラスト強調後の原画像を示しています。緑色のボックスは、カメラのための1×1ミリメートルボックスに相当します530 X 530ピクセルのボックスを示し、（D）ステージDは適用した後に強調された画像を示し、（C）ステージCは、1mmのボックスは画像Bからクロップ表し上述の機能強化。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3.最終カウントイメージ。強化、カウントイメージ。この画像に対して決定総数は54毛細管/ ^mm 2であった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4.不適切な画像処理。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

左の写真は、十分に処理されていない写真を示しています。毛細血管は、背景と区別するのが困難であり、定量プロセスは負affecになりますテッド。右の写真は、誤った画像処理後の同じ画像を表示します。個々の毛細血管が彼らの隣人と区別することは困難であり、従って、定量プロセスにマイナスの影響があります。

Nailfold capillaroscopyは、様々な腫瘍学、心臓血管、およびリウマチ疾患の用途のために、将来的に臨床的に有用なツールとして有望です。画像取得プロセスは、研究者の間でかなり一貫性のある、まだ画像処理及び分析のための多数の方法が現在存在します。メソッドは、現在のコンピュータと手動キャピラリー数が含まれています。彼らは時間がかかり、ユーザの主観と疲労にさらされるように手動カウントが問題です。現在のコンピュータベースの方法では、画像強調処理および定量プロセスの両方において、ユーザー入力の高レベルを必要とします。画像強調ステップが完全に自動化されているとしてここで説明する新しい方法は、比較的少ないユーザーのトレーニングや関与を必要とします。ユーザ入力のみが処理された画像内の背景からキャピラリを区別するために、最初に計数処理のために必要とされます。ここで説明するように自動化されたマクロを使用すると、マヌーよりも3倍から5倍より効率的です各個別の画像を処理味方。

capillaroscopyデータを定量する信頼性の高い標準化されたコンピュータベースのアルゴリズムが不足しています。

信頼性のある標準化されたコンピュータベースの方法は、主観性を低減し、効率を促進するために、毛細管の定量のために必要とされます。ここに記載された技術は、イントラと0.98から0.93のクラス内相関と観察者間の再現性の両方のために良い結果と優れた信頼性を示しています。我々は以前に手動カウントのゴールドスタンダードに比べ、コンピュータ化された毛細血管密度の評価を経て得られた結果の相関関係を報告している。ベースライン、虚血後、およびソフトウェアで行わ静脈うっ血数と対応するマニュアルカウント間²¹ピアソン相関を10人の被験者にありました0.78、0.78、および0.71は、それぞれ（すべてのP <0.05）が、2つの方法の間の合理的な合意を示します。

このラボの画像操作手順は、コンピュータ処理ツールの数を利用します。ステップ1.3、画像は「平坦化」各画像内に存在するさまざまな「層」を削除します。これは、将来のすべての画像処理手順は、画像のすべての部分に均等に適用されますので、最初に実行する必要があります。コントラスト調整は、毛細血管を暗くし、したがって、毛細血管がより見えるように、背景を見劣り両方。それらのサイズおよび形状を維持しながら、「スペックル除去」プロセスは、毛細血管のエッジを滑らかにします。肉眼に斑点除去画像に差がないように見えるが、これは複数の毛細血管がカウント処理時に一緒にブレンドしていないを確認する重要なプロセスです。 「ベストフィットヒストグラム」を使用して画像をファイナライズすると、ヒストグラムのいずれかの極端ですべてのピクセルを除外します。これにより、毛細管と背景のコントラストを向上させながら、毛細血管の境界を定義するのに役立ちます。全体的にあります3コントラスト強調ステップと、すべての3つの毛管の計数のための最終的な画像の鮮明度を最大化するために必要です。

時折、プログラムが多すぎるか少なすぎる毛細血管をカウントします。この問題を解決するための最初のステップは、強調表示を元に戻すともう一度強調プロセスを試してみることです。毛細血管が誤って強調表示されている場合、最小の毛管直径を調整する必要があるかもしれません。著者らは、5ピクセルのデフォルトの最小の直径をお勧めします。プログラムがあまりにも多くの毛細血管を数えたり、複数のキャピラリのような1つの毛細管をカウントしている場合、ユーザーは、1または2画素の最小直径を大きくする必要があります。プログラムは毛細管である暗画素群をカウントしていない一方、ユーザは、1画素分の最小直径を減少させることができます。

nailbed内のこれらのカウントのための位置を標準化する必要もあります。表に見られるように、同じ個体における数は非常にされています位置に依存するが、大幅nailbedの一部がカウントされているなどにより異なります。

プロトコルの重要なステップは、毛細血管の適切かつ最適な可視化が含まれます。このプロトコルで毛細血管の最適な可視化を可能にするステップは、完全に迅速かつ正確な画像操作を可能にする、自動化されています。これらのメソッドは、処理の信頼性と使いやすさで大きな進歩を表し、capillaroscopic画像をカウントしながら、技術の主な限界は、半自動化されたカウント処理です。理想的には、完全に自動化されたプロセスは、近い将来に作成されます。研究者は、患者のnailfoldの毛細血管密度の急速な定量化を可能にする完全に自動化された臨床的に有用な技術を開発するために、この論文に記載された方法論に基づいて構築することをお勧め感じるはず。

The authors have no conflicts of interest.

This project was supported by Grant Numbers HL96593 from NIH and D56HP20783 from HRSA/ HHS. Its contents are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH or HRSA / HHS.