Un metodo computerizzato riproducibile per la quantificazione della densità capillare con letto ungueale Capillaroscopia

Capillaroscopy is a non-invasive, efficient, relatively inexpensive and easy-to-learn methodology for directly visualizing capillaries in the microcirculation. However, only one publication to date describes the reliability of a complex software program available for quantitating capillaroscopy data. Here, we present a simple, reliable protocol for quantitating capillaries using a standardized algorithm.

Capillaroscopia è una metodologia non invasiva, efficiente, relativamente economico e facile da imparare per visualizzare direttamente la microcircolazione. La tecnica capillaroscopia può fornire indicazioni in salute microvascolare di un paziente, che porta a una varietà di dermatologica potenzialmente prezioso, oftalmologico, applicazioni cliniche reumatologiche e cardiovascolari. Inoltre, la crescita del tumore può dipendere angiogenesi, che può essere quantificata misurando la densità dei microvasi all'interno del tumore. Tuttavia, vi è attualmente poco o nessun standardizzazione delle tecniche, e solo una pubblicazione aggiornata riporta l'affidabilità di un attualmente disponibili algoritmi computerizzati, complessi di quantificazione dei dati capillaroscopia. ¹ Questo articolo descrive un nuovo algoritmo, semplice, affidabile, capillare standardizzata conteggio per quantificazione dei dati capillaroscopia ungueale. Un algoritmo semplice, riproducibile computerizzato capillaroscopia come questo faciliterebbe moreuso diffuso della tecnica tra ricercatori e clinici. Molti ricercatori attualmente analizzano le immagini capillaroscopia a mano, promuovendo l'affaticamento utente e la soggettività dei risultati. Questo documento descrive un romanzo, facile da usare automatizzato algoritmo di elaborazione delle immagini in aggiunta a un algoritmo di conteggio riproducibile, semi-automatico. Questo algoritmo consente di analisi di immagini in pochi minuti riducendo soggettività; solo una minima quantità di tempo di formazione (secondo la nostra esperienza, meno di 1 ora) è necessario per imparare la tecnica.

Imaging microvascolare è un settore in rapida crescita, con molte potenziali applicazioni cliniche. ^2, ad esempio, oncologi utilizzano immagini dei microvasi per determinare l'entità di angiogenesi tumorale, ottenendo preziose informazioni sullo stato del tumore e comprensione possibili opzioni di trattamento. ^{3 4} Tuttavia, ungueale capillaroscopia è forse la forma più efficiente e ampiamente applicabile costo dell'imaging microvascolare. I ricercatori stanno utilizzando il video letto ungueale capillaroscopia per studiare i tassi di flusso di sangue e indagare la morfologia capillare. ^{5 6} Sia video e immagini fisse ungueale capillaroscopia sono aggiunte per la cura per diagnosticare e trattare fenomeno e di varie malattie del tessuto connettivo di Raynaud come la sclerosi sistemica. ²

Capillaroscopia ungueale ha varie potenziali applicazioni cardiovascolari pure. La ricerca attuale suggerisce usando letto ungueale capillaroscopiache diabete mellito di tipo 1 e di tipo 2 pazienti mostrano una elevata prevalenza di anomalie morfologiche dei capillari, ma hanno densità capillare invariati rispetto agli individui non diabetici. ^7-8 capillaroscopia è stato studiato anche sperimentalmente in ipertensione. Rarefazione capillare strutturale portando ad una densità capillare ridotta è stata dimostrata in soggetti ipertesi, rispetto ai soggetti non ipertesi. ^9-10 In contrasto con questi pazienti ipertesi anziani (età media 40 anni e sopra), che presentano rarefazione strutturale, la ricerca più recente ha dimostrato che pazienti ipertesi più giovani (età media sotto i 40 anni) hanno rarefazione funzionale senza rarefazione strutturale. ¹¹ Ciò suggerisce che rarefazione funzionale si verifica prima e può evolvere nel tempo per la rarefazione strutturale.

È interessante notare che i pazienti ipertesi trattati con specifici farmaci antipertensivi, come perindopril / indapamide visualizzata normaAl densità capillare e la funzione endoteliale dopo il trattamento, mentre quelli trattati con ACE (enzima di conversione-enzima) inibitori o diuretici mantenuto una bassa densità capillare, nonostante il controllo della pressione sanguigna comparabili. ^{12 Questo} suggerisce che alcuni farmaci antipertensivi possono normalizzare la densità capillare invertendo la capillare rarefazione causata da ipertensione. Inoltre, altri ricercatori hanno dimostrato che una riduzione dell'assunzione di sale porta ad inversione di funzionale e strutturale rarefazione capillare nei soggetti ipertesi. ¹³

Nonostante le varie potenziali applicazioni cliniche di questa tecnologia, c'è poco standardizzazione tecnica per la quantificazione immagini densità capillare. ² Ad oggi, i ricercatori hanno scoperto che i risultati di densità capillare sono riproducibili sia da un intra-osservatore e inter-osservatore prospettiva solo se l'esatto stessa area viene contato ogni volta. ^{1,14 15} Da segnalare, i ricercatori precedenti hanno in gran parte effettuato conta capillari manualmente utilizzando occhio nudo, ^{9 16 17 18,} che è un processo lento e soggettiva.

Standardizzati, basati su computer algoritmi per la quantificazione di immagini capillari teoricamente fornire analisi dei dati più efficiente e riproducibile con meno soggettività, facilitando applicazioni cliniche di capillaroscopia. Alcuni ricercatori hanno infatti utilizzato programmi computerizzati per quantificare i dati ungueale immagini capillaroscopiche. ^{1,6 19 20} Tuttavia, solo una pubblicazione ad oggi descrive l'affidabilità di un programma di software complesso disponibile per quantificazione dati capillaroscopia, ¹ e questo programma è complicato come precedentemente notato sopra dalla necessità di contare il campo visivo stessa identica. Qui, presentiamo un protocollo affidabile semplice per quantificazione capillari utilizzando un algoritmo standardizzato che consentel'uso di più campi visivi. L'uso di più campi visivi non solo semplifica la procedura, ma permette anche la valutazione della normale variazione biologica conteggio capillare.

Lo scopo di questo studio è quello di descrivere un algoritmo computerizzato riproducibili ed efficiente che standardizza il processo di quantificazione capillare. Anche se questi metodi non sono completamente automatizzate richiedono molto poco l'input dell'utente, e forniscono quantificazione rapida e sicura delle immagini.

Nota: Il processo di acquisizione per ottenere immagini capillari è stato pubblicato in precedenza ed è realizzato utilizzando una fotocamera digitale con un programma informatico di acquisizione e analisi delle immagini corrispondente ^{11 21} Questo laboratorio utilizza immagini fisse per l'analisi, non video, semplificando l'acquisizione di immagini per l'analisi.. Quanto segue descrive la nuova tecnica per quantificazione dei capillari dalle immagini.

1. Miglioramento immagine di processo

1. Ottenere immagini digitali con una macchina fotografica digitale in bianco e nero. Calibrare le immagini a un oggetto di dimensioni note per scattare una foto di un oggetto di lunghezza nota, come un righello con la fotocamera. Questo processo permette il programma informatico per misurare e contare capillari accuratamente dopo l'elaborazione. L'ideale per la massima precisione, dovrebbe essere utilizzato un reticolo (brano scientificamente fabbricato di vetro con un righello inciso in esso). Misurare il numero di pixel in una piazza 1 mmbox utilizzando un programma per computer.
   Nota: La chiave per la riproducibilità e la standardizzazione di questo protocollo dipende in gran parte il corretto posizionamento della scatola 1 ^mm 2 che viene conteggiato.
2. Utilizzare strumenti di miglioramento di contrasto per scurire i capillari e schiarire lo sfondo, che ci permetterà di ottimizzare la visualizzazione dei capillari. Differenziazione iniziale dei capillari di sfondo è importante per il corretto ritaglio dell'immagine nei passaggi successivi. A tale scopo, regolando l'immagine con un Per fare ciò cliccate su "miglior istogramma in forma.": La cattura, l'intensità, l'immagine istogramma, meglio si adattano.
3. Ritagliare una regione di interesse (ROI) per il conteggio capillare come nuova immagine (selezionate, regioni di interesse). Utilizzare una scatola 1 mm ^2, che è stata determinata calibrando le immagini a 530 pixel eguagliando 1 mm. verificare che l'immagine ritagliata pone l'apice delle anse capillari in cima dell'immagine.
4. Appiattire l'immagine in modo che tutti i futuri regolazioni dell'immagine saranno applicate in modo uniformel'immagine. Per fare ciò cliccate su: scheda processo, filtri 2D, appiattire, intensità BG di "brillante", object width a "75," si applicano.
5. Aumentare il contrasto dell'immagine in modo capillari vengono visualizzate al massimo. Per fare ciò cliccate su: scheda, visualizzazione regolare, aumentare il contrasto a 75.
6. Despeckle l'immagine per smussare i bordi dei capillari cliccando su scheda processo, filtri 2D, smacchiatura, la dimensione del kernel 7 x 7, si applicano.
7. Finalizzare il contrasto dell'immagine in modo capillari sono neri e lo sfondo è bianco. Eseguire questo passaggio regolando l'istogramma per il modello "best fit".
   Nota: Si prega di fare riferimento alla figura 2 a Rappresentante dei risultati per un esempio di ciò che l'immagine elaborata dovrebbe essere simile seguendo questi passaggi.

2. Esecuzione Conti capillari / quantificazione capillare Densità

1. Su ogni immagine, selezionare manualmente una parte di un capillare ben definito utilizzando il featur "target oggetto"e di essere riconosciuti come oggetti da contare dal programma. Quindi, selezionare una piccola parte del fondo, utilizzando la funzione "background", come riferimento per aree che devono essere prese in considerazione dall'algoritmo conteggio.
   Nota: La combinazione di questi punti salienti fa sì che tutti i capillari da evidenziare, trascurando il rumore di fondo. Il protocollo di quantificazione (conteggio) utilizza le funzioni del computer di differenziare le parti dell'immagine in base al colore e morfologia.
2. Utilizzare la funzione di conteggio per contare istantaneamente tutti i capillari nell'immagine con il apparecchiature di imaging. Impostare il diametro minimo di oggetti contati a 5 pixel in modo da evitare di contare il rumore di fondo come capillari.
3. Per ogni individuo, contare il media di 3 - 4 immagini in modo da ottenere una valutazione più affidabile.
   Nota: Si prega di fare riferimento alla Figura 3 a Rappresentante dei risultati per un esempio di ciò che l'immagine dovrebbe essere simile nel corso della procedura di conteggio.

3. Creazione e utilizzo di macro per automatizzare Image Processing

Nota: Per risparmiare tempo, macro possono essere create per eseguire automaticamente una sequenza specifica di processi su uno o più immagini. Queste sequenze possono essere personalizzati al fine di apportare le modifiche di immagine più veloce. In sostanza, queste macro ricordano come le immagini vengono elaborate, ed eseguire tutti i passaggi in modo rapido e senza l'input dell'utente. Esecuzione conta su 12 immagini capillari prende questo laboratorio tra i 20 ei 30 minuti con le macro (da 2 a 3 min per immagine), a differenza di circa 8 minuti per foto senza le macro. Pertanto, utilizzando le macro è da 3 a 5 volte più efficiente di elaborazione manualmente ogni singola immagine.

1. Per creare una macro, selezionare "macro record" e un'immagine eseguire le fasi ei processi desiderati, come descritto ai punti 1 e 2 di cui sopra. Nome della macro in base alla quale l'elaborazione delle immagini fasi sono state eseguite per riferimento futuro. Quando using la macro sulle immagini future, è sufficiente cliccare su "macro run" e il programma applicherà automaticamente i miglioramenti registrati all'immagine desiderato (s).
   Nota: Questo laboratorio utilizza una macro per eseguire tutti, ma uno dei passi nella Sezione 1 dei metodi in pochi secondi. L'unico passo che richiede l'input dell'utente è scegliere dove tagliare l'immagine, Step 1.2.

L'obiettivo di questa procedura di elaborazione delle immagini è quello di differenziare i capillari dall'immagine di sfondo in modo che possano essere quantificati con precisione. Entrambi elaborazione delle immagini incompleta e l'elaborazione di immagini eccessive sono dannose per la capacità del programma di quantificare i capillari. Come si vede nella figura 3, l'elaborazione delle immagini incompleta rende i capillari difficile distinguere dallo sfondo. E 'fondamentale che l'utente sia in grado di distinguere facilmente il bordo di un capillare in quanto il metodo di conteggio descritto sopra dipende dalla capacità dell'utente di evidenziare con precisione alcuni capillari. D'altra parte, come mostrato nella figura 3, l'applicazione della procedura di elaborazione delle immagini inutili può portare a sfocatura dei capillari e quindi può anche essere dannoso per il processo di quantificazione.

Un'immagine ottimale elaborato può essere conteggiato in 30 secondi e distingue capillari da sfondo nel modo più chiarocosì come capillari singoli uno dall'altro. Un esempio di una immagine elaborata è visibile nella figura 2 parte D, con l'immagine contato illustrato nella figura 3.

Densità capillare varia a seconda della posizione del nailbed essere contato. La tabella 1 mostra che la densità capillare aumenta con la distanza dalla prima riga dei capillari al nailbed. Standardizzazione del collocamento ROI è fondamentale per contare riproducibilità. Figura 1 mostra come le immagini possono essere modificati con differenti posizionamenti ROI.

. Tabella 1: Variazione nella capillare Conta con posizionamento differenziale nel Unghia letto Questa tabella mostra i conteggi ottenuti per tre diversi pazienti (A, B, C) ​​quando la casella ROI è variabile posizionato in alto (conta T1 - T4), mezzo (M1 - M4), e regioni inferiori (L1 - L4) del letto unghia. I conteggi medi aumentano dalla parte superiore per abbassare le regioni, a dimostrazione della necessità di una standardizzazione di stage box ROI confrontare conteggi ottenuti da laboratori diversi.

Esecuzione conteggi nella zona descritta al punto 1.2, la conta basale dovrebbero variare da 30 a 60 capillari / mm ^2, mentre i conteggi occlusione venosa può variare da 50 a 100. Come si vede nella tabella 1, si tratta densities differiscono da altre pubblicazioni. Conteggi densità capillare ottenuti in laboratorio degli autori sono molto probabilmente inferiore perché questo laboratorio inizia conteggi alla prima fila di capillari, dove la densità è più bassa. Come si vede nella Tabella 1, conteggi performing nelle regioni inferiori della nailbed aumentano i conteggi verso valori ottenuti in precedenza da Antonios et al ⁹ e Debbabi et al. ¹⁶ Questa discrepanza dimostra la necessità di standardizzazione quantificazione nailbed capillaroscopia contando la prima (più prossimale) fila dei capillari. Contando alla prima fila di capillari è ottimale perché i capillari sono più chiaramente e completamente visualizzati nella prima riga e progressivamente diventano meno visibili con righe successive.

Sono stati condotti studi di riproducibilità in cieco con N = 10 soggetti e due osservatori indipendenti. Risultati Affidabilità riferiscono alla media conteggi A, B, e C, ottenuta av eraging risultati attraverso 4 immagini per ogni. I conteggi A, B, e C rappresentano diversi stati fisiologici all'interno dello stesso individuo che vengono utilizzati per valutare la salute microvascolare, brevemente riassunte qui. I particolari sono stati pubblicati in precedenza ^21. Capillare densità è definita come il numero di capillari per millimetro quadrato (mm ²⁾ di pelle barretta ungueale. Fase A è una fase basale di riposo in cui i capillari sono continuamente perfuse ^16. Fase B si verifica durante postocclusive iperemia reattiva. Questi conteggi rappresentano la somma delle continuamente perfuso e intermittente perfusi (riserva funzionale) capillari. Questa fase viene usato come misura della funzione capillare ^16.

Fase C si verifica durante l'occlusione venosa, quindi mostrando densità capillare massima inclusi sia perfuso (con globuli rossi attiva (RBC), movimento) e nonperfused (riempiti di stagnanti globuli rossi, non in movimento) capillari. ²²

Figura 1. La standardizzazione Crop Posizione. Questa figura illustra come il posizionamento variabile della scatola ROI altera visibilmente l'immagine ritagliata. A sinistra, la scatola è posizionato troppo bassa, tagliando la prima fila di capillari. La casella centrale è posizionato troppo alto, provocando uno spazio vuoto sopra la prima fila di capillari. La casella a destra è ottimamente posizionato. La sua immagine ritagliata mostra la prima fila di capillaries al molto superiore dell'immagine. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Fasi di Image Processing (A) Fase A mostra l'immagine iniziale tratta dal nailbed del soggetto con una macchina fotografica in bianco e nero;. (B) Fase B mostra l'immagine originale dopo il primo aumento del contrasto. La scatola verde mostra una scatola di pixel 530 x 530, che equivale a 1 x 1 mm scatola per la macchina fotografica, (C) Stadio C rappresenta la casella 1 millimetro ritagliata dall'immagine B; (D) Fase D mostra l'immagine migliorata dopo l'applicazione i miglioramenti di cui sopra. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Finale immagine contato. L'immagine contato migliorata. Il conteggio totale determinato per questa immagine era di 54 capillari / mm ^2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. improprio Image Processing. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

La foto a sinistra mostra una foto che non è abbastanza elaborato. I capillari sono difficili da distinguere dallo sfondo e il processo di quantificazione sarà negativamente affetto,ted. La foto a destra mostra la stessa immagine dopo l'elaborazione delle immagini non corretta. Capillari individuali sono difficili da distinguere dai loro vicini e quindi il processo di quantificazione sarà influenzato negativamente.

Capillaroscopia ungueale mostra la promessa come uno strumento clinicamente utile in futuro per vari oncologia, cardiovascolare, e le applicazioni di malattie reumatologiche. Il processo di acquisizione delle immagini è abbastanza coerente tra i ricercatori, ma attualmente ci sono diversi metodi per l'elaborazione delle immagini e di analisi. I metodi attualmente includono i conteggi capillari informatiche e manuali. Conteggi manuali sono problematici in quanto sono in termini di tempo, e soggetto alla soggettività utente e la fatica. Metodi basati attuale computer richiedono un alto livello di input dell'utente, sia nel processo di miglioramento delle immagini e il processo di quantificazione. Il nuovo metodo qui descritto richiede relativamente poca formazione degli utenti o la partecipazione, come le fasi di ottimizzazione delle immagini sono interamente automatizzate. L'input dell'utente è necessaria solo per il processo di conteggio inizialmente distinguere capillare da sfondo le immagini elaborate. Utilizzando le macro automatizzati come descritto qui è da tre a cinque volte più efficiente di manuelaborazione alleato ogni singola immagine.

Algoritmi informatici basato standardizzate affidabili per quantificare i dati capillaroscopia sono carenti.

Sono necessari metodi basati informatici standard affidabile per la quantificazione capillare al fine di ridurre la soggettività e promuovere l'efficienza. La tecnica qui descritta dimostra un'eccellente affidabilità con buoni risultati sia intra e inter-osservatore riproducibilità con correlazioni intraclasse di 0,93 a 0,98. Abbiamo già riferito la correlazione dei risultati ottenuti attraverso la valutazione computerizzata densità capillare rispetto al gold standard del conteggio manuale. ²¹ Pearson correlazioni tra basale, post-ischemica, e conta congestione venosa fatte con il software e relativi conteggi manuali in 10 soggetti rimasti 0.78, 0.78, e 0.71, rispettivamente (tutti p <0.05), indicando ragionevole accordo tra i due metodi.

L'immagine di questo laboratoriofasi di manipolazione utilizzano una serie di strumenti di elaborazione del computer. Fase 1.3, immagine "appiattimento," rimuove i vari "strati" che sono presenti in ciascuna immagine. Questo deve essere fatto prima così sarà applicato in modo uniforme tutte le future procedure di elaborazione delle immagini a tutte le parti dell'immagine. Regolazione del contrasto sia scurisce i capillari e impallidisce lo sfondo, rendendo quindi i capillari più visibili. Il processo di "despeckle" attenua i bordi capillari pur mantenendo la loro forma e dimensione. Anche se sembra che vi siano differenze di un'immagine despeckled ad occhio nudo, questo è un processo importante per contribuire a garantire più capillari non si fondono insieme durante il processo di conteggio. Finalizzazione l'immagine utilizzando un "best fit istogramma" esclude tutti i pixel a entrambi gli estremi dell'istogramma. Questo aiuta a definire i confini dei capillari, migliorando ulteriormente il contrasto tra i capillari e lo sfondo. Nel complesso ci sonotre fasi di aumento del contrasto, e tutti e tre sono necessari per massimizzare la nitidezza dell'immagine finale per il conteggio capillare.

Di tanto in tanto, il programma conterà troppi o troppo pochi capillari. Il primo passo per risolvere questo problema è quello di annullare l'evidenziazione e semplicemente riprovare il processo di evidenziazione. Se i capillari vengono evidenziati in modo errato, regolando il diametro minimo capillare può essere necessario. Gli autori raccomandano un diametro minimo di default di 5 pixel. Se il programma sta contando troppi capillari o contando un capillare più capillari l'utente dovrebbe aumentare il diametro minimo da uno o due pixel. D'altra parte, se il programma non conta gruppi di pixel scuri che sono capillari, l'utente può ridurre il diametro minimo di un pixel.

Vi è anche una necessità di standardizzare la posizione per questi conteggi all'interno nailbed. Come si vede nella tabella, conta nello stesso individuo sono moltoposizione dipendente, che variano notevolmente a seconda di quale parte del nailbed viene contato.

Passaggi critici del protocollo comprendono la visualizzazione corretta ed ottimale dei capillari. I passaggi che permettono la visualizzazione ottimale dei capillari in questo protocollo sono completamente automatizzate, consentendo una rapida ed accurata manipolazione delle immagini. Mentre questi metodi rappresentano un importante progresso nel affidabilità e facilità di lavorazione e contando immagine capillaroscopico, la principale limitazione della tecnica è il processo di conteggio semiautomatica. Idealmente, verrà creato un processo completamente automatizzato in un prossimo futuro. I ricercatori dovrebbero sentirsi incoraggiati a sviluppare la metodologia descritta nel presente documento al fine di sviluppare una completamente automatizzata tecnologia clinicamente utile che permette la rapida quantificazione della densità ungueale capillare di un paziente.

The authors have no conflicts of interest.

This project was supported by Grant Numbers HL96593 from NIH and D56HP20783 from HRSA/ HHS. Its contents are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH or HRSA / HHS.