プロトタイプ小型化フローサイトメーターおよびコンパニオンマイクロ流体混合技術の縮小重力環境ハードウェアデモンストレーション

宇宙飛行血液診断は、技術革新を必要としています。いくつかのデモは、機内縮小重力の健康診断技術を説明する公開されている。ここでは、コンポーネントと他のセットアップに適応準備戦略とプロトタイプのポイント·オブ·ケアフローサイトメトリー設計のための放物線飛行試験リグの建設と運​​営のための方法を提示する。

最近まで、宇宙飛行士の血液サンプルは、飛行中収集したスペースシャトルに地球に運ばれ、地上の実験室で分析した。人間は、低地球軌道を越えて移動する場合は、スペースで準備ができて、ポイント·オブ·ケア（POC）テストへの移行が必要である。このようなテストは、総合的な縮小重力環境で実行することが容易で、打ち上げや宇宙飛行のストレスによって影響を受けないことが必要である。無数のPOCデバイスは、実験室規模の対応を模倣するために開発されてきたが、ほとんどは狭い用途を有し、いくつかは、飛行中の、低減された重力環境で実証用途を有する。実際には、減少重力における生物医学診断のデモンストレーションは、コンポーネントの選択や新技術をテストしようとしているときにアプローチするのが難しい特定の物流の課題を作り、完全に制限されています。空虚さを埋める手助けするために、我々はプロトタイプの血液診断装置とそれに関連するPの構成及び動作のためのモジュラー方法を提示している放物線飛行、減重力航空機に搭載飛行テストのための基準を満たしていarabolic飛行試験リグ。方法は、最初に、飛行中の、低減された重力フローサイトメーターのテストとコンパニオンマイクロ流体混合チップ用リグアセンブリに焦点を当てています。コンポーネントは、他のデザインに適応され、そのような微量サンプルローダーとマイクロミキサーのようないくつかのカスタムコンポーネントは、特に重要であり得る。次いで、この方法は、ユーザートレーニング、標準業務手順書（SOP）の開発、およびその他の問題に関連して成功した飛行試験の準備のためのガイドラインや提案を提供することにより、飛行準備にフォーカスをシフトします。最後に、私たちのデモに特有のインフライト実験手順が記載されている。

現在のスペースに対応した健康診断の不足はより深い有人宇宙探査への制限要因を提示します。診断は、総合的な減少重力で使いやすく、そして打ち上げや宇宙飛行（ 例えば 、高g力、振動、放射線、温度変化、およびキャビン圧力変化）の応力の影響を比較的受けておく必要があります。ポイントオブケア試験（POCT）の開発は、より小さな患者検体（ 例えば 、指穿刺）を使用することにより効果的な宇宙飛行溶液に変換する単純で小さな流体工学（ すなわち 、マイクロフルイディクス）、および他の間で、電力要件を低減してもよい利点。 フローサイトメトリー細胞計数およびバイオマーカー定量化だけでなく、大幅な小型化の可能性に向かって含むため、技術の広範な有用性のインスペースPOCの1魅力的なアプローチです。前スペース関連のフローサイトメーターは「核の梱包efficを含むiency無重力^「5時のデータフローサイトメトリーのリアルタイムフローの最初の世代の「同時アーク灯誘起蛍光と電子ボリューム（コールターボリューム）測定^1-4、代表サイトメーター比較的小さなベンチトップ·フローを利用して（NPE）楽器'、 「サイトメーターsheathlessマイクロ'は4位および5部分の白血球（WBC）差分カウントすることができるが、5μlの全血サンプル^6-9を前処理し、そして使用して「光ファイバベースの「最近の国際にオンボードテストフローサイトメーター宇宙ステーション^10。

潜在的な宇宙用診断技術の評価は、一般的に無重力の選択されたレベル（ 例えば 、無重力、火星重力^）11をシミュレートするために、ほぼ放物線飛行軌道を使用し、減重力機内実行されます。フライトの機会が制限されているため、評価が困難である、REPET微小重力のitive短い窓が難しく、通常は20〜40秒よりも長い中断の期間を必要な方法論やプロセスを評価するために作ることができ、およびデモンストレーションを簡単に飛行^12-15利用されていない追加の機器を必要とするかもしれない。さらに、 インビトロ診断（IVD）技術の使用、または、減少重力のために設計され、以前のデモは限られており、多くの仕事は未発表のまま。上記のフローサイトメーターに加えて、文献に記載された他の宇宙関連IVD-技術は、自動化された¹²サイトメータカメラベースの免疫表現型アプリケーション¹⁶のための全血染色装置を使用して、統合された電位差、電流測定、及び導電率測定のためのハンドヘルド臨床分析を含む^12,17、診断プラットフォーム¹ 'CDに収録されているラボ「拡散ベースの混合および分離^18、および回転に依存している分析物定量のためのマイクロ流体「Tセンサーデバイス'9,20。デバイス評価を可能にしようとする（あるいは何ができるかを考え出す）とき減少し、重力テストの新規参入者はまた、 インビトロ診断薬とは無関係の放物線飛行のデモンストレーションに見えるかもしれません。よく文書飛行準備、飛行中の戦略、飛行試験機器と他の以前の医学的または生物学的実験からのデモンストレーションを、 表^{1〜15、21-35}に含まれています。これらは、飛行中のタスクの、特殊な装置を使用すること、および実験封じ込めマニュアルの包含に有益であり得る。

さて記載されている方法/実験表1.パラボリック飛行実証例

前の例を拡張し、成功した飛行中のデモへのより深い洞察を提​​供するために、我々は、放物線飛行試験リグの一部として、関連するマイクロ流体混合技術とフローサイトメータープロトタイプの建設と運​​営のためのモジュールおよび適応手順を提示している。リグは、サンプルローディング、マイクロ流体混合、蛍光粒子検出のデモンストレーションを可能にし、宇宙環境への2010 NASAのファシリテアクセス（FAST）放物線fligオンボードテストされました9月29日から10月1日に流すHTS、2010これらのデモは、それぞれ、指先サイズの血液サンプルを、光を介して、ロードされた希釈または試薬と混合され、そして分析される可能性のあるデバイスのワークフローの初め、中間、最後から引く検出。コンパクトなユニットにフローサイトメーターをスケーリング技術革新と慎重な部品選択が必要です。カスタムおよび既製のコンポーネントは、最終的な部品の選択の最良の初期の近似値として選択され、ここで使用され、他の革新の設計に適応することができる。プロトタイプの部品の選択の概要に続いて、セットアップがリグアセンブリのための骨格としての支持構造上に記載されている。プロトタイプのコンポーネントは、場所が割り当て固定され、成功した実験のために必要な追加の構成要素を伴う。注目はその後、標準的な操作手順（SOP）の開発、トレーニング、および他の物流を含むより抽象的な手続きに移行する。最後に、デモ固有の手順があります記載され。特定のプロトタイプのためにここで実装がここで説明する戦略とリグ成分（ 例えば 、顕微鏡、アクリルボックスなど ） をサポートする選択肢は、縮小重力環境内の任意の血液診断装置の試験に関連する一般的な問題や課題に話す。

2010便では、2月の重力（約1/6地球の重力を達成）、最終的に、これらは、3日を越え再スケジュールされたものの2つのマイクロ重力便、4日間全体で予定されていた。デモンストレーションは、修正された民営、ナローボディジェット旅客機³⁶オンボードで行った。各フライトは、それぞれ、高重力減少重力条件の20~25秒続く（約1.8グラム）の約20秒を得30-40放物線を提供した。放物線の半分が実行された後、飛行機は振り向くとPEながら着陸地点に向かって引き返すように飛行機を可能にするために水平飛行で約5〜10分の時間のために一時停止放物線の残りをrforming。

このプロトコルで使用されるヒト血液サンプルを、低侵襲プロトコルを使用して、IRBの承認を得て収集した（謝辞を参照）。

1.リグ組み立て

1. 減少した重力条件で使用される単純なフローサイトメトリーシステムのためのプロトタイプ·コンポーネント（流体工学、光学、制御/データ収集エレクトロニクス）を組み立てる
   1. システム流体工学を駆動するために、最小限の重量とパワーニーズに圧力システムを準備します
      1. 差圧センサに小型化された空気ポンプを接続します。
      2. 、一定の駆動圧力を維持するパルス幅変調し、カスタムコントロールソフトウェアの比例積分微分コントローラ（ステップ1.1.7）を用いて調節デューティサイクルを使用して、ポンプ出力を制御する。
   2. 空気をトラップせずにロードすることができ、流体源容器を組み立てる（ステップ3.4参照）
      1. ラテックスdiaphraと硬質プラスチックバイアル（ 図1A）を取り付けGM、バイアル基部にしっかりと固定可能なキャップと、入口空気管は、（光学接着剤を使用して接続を密封し）。
      2. ポンプがキ​​ャップ出口配管からの流体の流れを駆動するために、振動板を圧縮空気または流体の漏れなしでバイアルを加圧することを確認してください。
   3. 流れが損なわれます背圧を構築せずに廃棄物を収集するために、流体廃棄物容器を設計
      1. 二重封じ込めのためのバイアル接着-内-バイアル設計（ 図1B）を使用します。
      2. フローティング廃棄物をトラップが、キャビン環境に空気圧等化を可能にするセキュリティで保護されたフォームスポンジウィンドウでバイアルをキャップ。
   4. 減少した重力で使用するためのサンプルローダーを作る
      1. マシン、それが確実に流体ライン内の2つのOリングとの間のシース嵌合毛細管をクランプするように、ガイドレール（ 図1C）とバネ付きクランプ設計を組み立てる。システムpを収容し、ロードするときには試料体積を保持確保試料が挿入され、誤った気泡導入を回避していないときに雲粒捕捉。
      2. 毛細血管が存在しない場合に、ばねが流体ラインを完了し、（左図1Dを 、）漏れることなくプライミングを可能にするために一緒にOリングを押していることを確認してください。
   5. 機能するためにパワード機械的サブコンポーネントに依存していないマイクロミキサーを設計
      1. マイクロ流体チャネル内の層流を克服するために必要なカオス的移流を実現二入口螺旋渦マイクロミキサー（ 図1E）を想像する。一つのサンプルの実行が次の影響を与えないように、この設計では、下流のすべて入る流体を提供します。
      2. 便宜上、ラピッドプロトタイプのポリジメチルシロキサン（PDMS）方式（ 図1F）を使用して、選択されたデザインを製作する。クリーンルーム施設³⁷に必要なSU-8の金型を製作するために2万dpiで印刷された二次元コンピュータ支援設計されたフォトマスクを利用している。
         注：MODIを使用してください針を向ける手助けする入口、渦検出入口、および検出器出口スポットハンドルーペで穴を開ける垂直掘削ミルに23ゲージのフィットをfied。カミソリの刃を使用してPDMSからのチップを切り出し、チップの裏面非成形側から突き出0.5「中空スチールピンと穴にフィット。マイクロボアチューブを用いて検出チャネルの入り口ピンに中央スパイラル出口ピンを接続してください。
      3. マットスコッチテープでエタノールとドライ成形面で徹底的にきれいなチップ。ピンからエタノールを吹くように空のシリンジを使用してください。 PDMSチップおよびプラズマクリーナー内の自然のままのカバーガラスを治療し、軽い圧力を適用するチップが完全にチャネルの開存性を損なうことなく押された光学顕微鏡で直ちに確認することによって10秒以内にそれらを結合。
   6. 個々の流動性の粒子を検出する手のひらサイズのミニチュア光学ブロックをマウントする
      1. 図2AB設計は、2色の電子に適していpifluorescenceレーザー照明および検出し、PDMSストレートチャンネル（200μmで120）の便宜のためにフローセルを利用しています。
      2. マウントブロック（ 図2C）は、市販の光学機械部品を使用し、ファイバ結合された単一光子計数モジュールを整列させる。
   7. 装置制御およびデータ収集のための電子機器およびソフトウェアを設計
      1. 初期のプロトタイプの便宜上、データ集録（DAQ）カード（ 図2D）に接続され、手はんだ付けの部分を利用する。
      2. コードやプログラムリグ機器を操作し、すべてのデータを同期するためのカスタム·ソフトウェア（ 図2Eの例）。
2. 追加コンポーネント（正式にはいないプロトタイプの一部）
   1. 3次元加速度計（ 図2D、左）と、流量計（図示せず）を内蔵しています。加速度計は、航空機に搭載存在するが、（おそらく）を直接Oに同期することができませんTHERは、データを記録した。
3. 電力スキーム
   1. （還元重力フライトで安全上の理由のために必要）の迅速かつ完全なエレクトロニクスシャットダウンするためのメカニズム
      1. 航空機の配電パネル（120 VAC 60 Hz）のへの（単一のI / Oボタン付き）シングル電源タップを接続します。
      2. ノートパソコンのバッテリーを取り外し、単独の電源ケーブルを介して動作するようにラップトップを設定します。
   2. すべての機器の電源
      1. 直接ラップトップ（バッテリが取り外さ）、光学顕微鏡、および電源タップを使用して2つの光子検出器に電力を供給する。
      2. ラップトップまたは用いた電池に接続されたUSB DAQカードを介して電力、残りのデバイス。
4. 飛行準備リグのレイアウト
   1. 成功した飛行中のパフォーマンスに関する考慮事項
      1. 利用可能な総容量は、地面（ 図3A）で同様のデモのために提供されるよりも小さな領域に制限されています。利用可能な総容量を検討し、それがどのようにねペースは実験的な（プロトタイプのものを正式一部を越えて部品を含め）リグ空間とリグを取り巻くユーザ空間の間で分割されます。実験的なリグは前方または後方の位置の点で異なりますが、これは主に利用可能な操作空間（あるいは飛行中の物理学）には影響しません。
      2. より適切に立ち、膝間付、または床面の高さでアクセスされる部品と同様に、支持構造以内に達成保護から最も利益を得るであろうコンポーネントを考慮。
   2. リグの支持構造
      1. 入手または構築物とみなさレイアウトニーズを満たす垂直装置ラックを、すべてのコンポーネントが含まれ、組織のために異なる垂直レベルを可能にし、飛行加速度に耐え、しっかりと意図された航空機の客室の床に付着する。
      2. ラップトップ、C半ばラックレベルを配置するトップレベル：装置ラック（ 図3B）内のレベルにコンポーネントを割り当てるontainプロトタイプサブコンポーネントと床レベルが余分なワイプ、手袋、およびその他の廃棄物容器を収容するための用意。
      3. 異なる所望のレベルに対応するために、ラック内の追加の構造を想像する。リグコンポーネントをネジ留めするため2フィートによって。2フィートを保持するために「mid'-高さに顕微鏡ブレッドプレートを支持梁を実装し、高い支持梁約2フィート、飛行が承認したノートパソコンのトラフをサポートする。
      4. 垂直レベル内により他の成分の存在に起因するだけでなく、飛行（ 例えばオンボードリグ自体の潜在的な位置/方向に発生したアカウントのアクセシビリティの制限を考慮して、最適な部品配置を決定する、正方形のリグの4 ^番目の側かもしれない）のみアクセス可能3辺を残して、航空機の壁に近くなる。
         注：テスト演算子を確保するレッグストラップはリグから一定の距離にあり、四方を利用できない場合があります。
      5. これらの決定に基づいて、ジ航空機の壁に向かって電子機器や光学ブロックのための専用の場所に置く、4象限（ 図3C）にブレッドボード板を見よ、サンプルローダーと室内空間に向かってマイクロ流体チップ。
5. プロトタイプの確保、封じ込め、および視覚化のセットアップ
   1. システム·エレクトロニクス
      1. デザイン、レーザーカット、およびDAQカード（ダウン苦しい）と（ボックス壁にネジ止め）手はんだ付けのボードが含まれているために、カスタムアクリルボックス（ 図2D）を組み立てる。
      2. USBケーブルやワイヤのための容易なアクセス（ファブリック面ファスナーで飛行中に確保）とexitの穴のためのスイングドアを利用している。
   2. サンプルローダー
      1. フライトキャビンの汚染を危険にさらすことなく、ローダのデモンストレーション（ 図4C）を実行するために立方の空間を提供するために、腕のアクセスホールを持つカスタムアクリル「グローブ」ボックス（ 図4A）を作製。
      2. 箱の側面に小さな円形の貫通孔ローダーにしてからチューブを通します。
   3. マイクロミキサー
      1. 地上で使用される機器を適応させる。ボルトブレッドプレートに実体顕微鏡（ 図4B）と、プレートにボルトで固定、カスタムアクリルチップホルダーとそれにフィットする。
      2. 顕微鏡の接眼レンズにUSB CCDカメラを取り付け、他のデータと同期した映像保存するノートパソコン（ 図4D）に接続して（重力、駆動圧、および流量）。
   4. 光学ブロック
      1. 、ブロックをカバーする周囲の光からそれを遮断し、レーザーの危険を制御する（右図4A）カスタム不透明なアクリルボックスを製作。
      2. 安全にレーザー機能をチェックするために、光学フィルタ]ウィンドウ」を利用する。
   5. ノートパソコン
      1. 支持構造内の支持梁行きの航空券が承認したラップトップトレイをボルトで固定。
      2. HOOを使用してくださいラックアーキテクチャに沿ってUSBケーブルを固定するためのk·アンド·ループファスナー。
6. 飛行中のデモンストレーション実装
   1. デモを進行するための簡単​​な介入
      1. 飛行中に必要な手動チュービング調整や大幅な器用さを必要とするか、キャビン環境に流体を漏洩する危険性が可能性が他のアクションを排除する追加コンポーネントを組み込む。
         1. カスタムマシンとアルミシリンダ掘削と圧力入口として機能する針スクリューオンルアーアダプターに合わせてタップからなる圧力マニホールド（ 図5A）を統合する。 Oリングやコンセントなどのマイクロボアチューブにフィットするように周囲に小さい穴を開けます。同時に複数のソースバイアルに圧力をかけるために使用します。
         2. DAQカードに配線タンデムMOSFETスイッチ（ 図5C）によって制御される三方向ソレノイドバルブのパネル（ 図5B）を組み立てる。フィットするマイクロボアチューブを適応させるバルブポート。異なるバイアルからの流体の流れを制御するために使用します。
      2. プログラムソフトウェアのデモンストレーションを通じて進行するシングルボタン介入（ラップトップ上で例えば 、シングルクリック）を使用します（ 図6）。
   2. バックアップの手動制御
      1. 予想外に配管が切断され、飛行中に再接続する必要があるかもしれません場合には、流体工学上のいくつかの手動制御を可能にするためにリグにスライドクランプを追加します。
      2. 飛行中の漏れの場合のフロアラック部に十分なクリーンアップワイプが含まれる。
7. 飛行外乱の準備：可能な突然の揺れの力、振動、または飛行中の乗客の衝突のための準備のシステム。
   1. アライメントの安定化
      1. 簡単に誤調整されて整列成分、特に光学部品に速乾性エポキシを適用します。
      2. 速乾性エポキシにわたって工業用グレードのエポキシを適用するだけでなく、他のcomponenを確保する顕微鏡の接眼レンズにCCDカメラアタッチメントを含む、必要に応じて、tsは。
   2. 物理的な外乱テスト
      1. 場所にすべてのコンポーネントを持つリグ支持構造を振る。
      2. 乱れ、特に整列光学部品にリグを施した後、個々のコンポーネントの機能を確認してください。
   3. 旅客リスクマネジメント
      1. 偶然リグ（ 図4C）にノック飛行乗客に害を及ぼす可能性の垂直装置ラック構造の領域（コーナー、エッジ）にフォームパッドを適用します。
      2. 黒いダクトテープを使った安全なパディング。

2.デモンストレーション準備と物流

1. 機内と地上チームの役割の割り当て
   1. リグのセットアップおよびすべてのハンズオン機内操作の両方を実行するためにリグ演算子（複数可）を割り当てます。リグのセットアップが完了すると、ハンズオン事業者は、最高の視覚化することができます。
   2. は声を出してトレーニング中や飛行中のSOPを読むためのSOPリーダーを割り当てます。トレーニング中のSOP読書のプロセスは、厄介またはタイミングの悪いステージングを識別することができる。
   3. サンプル調製および直接リグオペレータの時間負担を最小限に抑え、リグを含まない他の準備作業を行うために地上支持体を割り当てる。
2. 初期の標準作業手順（SOP）の開発
   1. 飛行中、飛行前（前前日朝）を組み込むためにすべてのステップを記述し、飛行の場所で利用できるようになります唯一の機器や材料を活用飛行後の手続き。飛行機が回るように放物線を開始または中間点の前に水平面飛行の5から10分のブロックが直前のセットアップ手順で使用可能な場合があります。
   2. 放物線はおそらく飛行機が振り向くと着陸に引き返すことができるように途中で分離されることを指摘し、放物線の専用番号に飛行中の実験手順を割り当てるサイト、および別のグループは放物線が予想より流すことも半ば実験や少数を平準化する平面を要求することができること。
   3. 可能な場合は、実際の生物標本を避け、効果的な封じ込めを超えて生物学的なハザードリスクを最小限に抑えるための実証手続きを思い付く。青い食用色素を利用したサンプルローダデモ中に血の代替として蛍光計数ビーズ（ 図1D）でスパイク。
3. デモンストレーション·トレーニング
   1. 完全にSOPを改訂し、リファインするために十分なトレーニングスケジュールを設定するだけでなく、飛行データと比較するために徹底した地上制御データを生成する。
   2. 飛行前のSOPを実行した後、ツールまたは粉砕物へのアクセスを切断し、飛行中の経験をシミュレートするために、部屋の中にリグを「ロックする」。さらに厳しいトレーニングのため、飛行中³²利用できるようになります割り当てられた寸法を満たし、床の部分をオフにマークします。
   3. トレーニング中に、SOP eをたどるxactlyは、入口と減少し、重力の出口だけでなく、半ば飛行放物線ブレークを示し、20〜30秒の放物線を発表するストップウォッチを使用しています。
   4. 一日の飛行と日·ビフォア·飛行の間「飛行前の活動を分割し、実際の飛行の日のスケジュールにファイナライズのSOPを組み込む。
   5. 突然のリグを打つ力又は突然実験の途中でレベリング面を含む予期せぬ飛行中の出現のための列車。
   6. サンプルおよび試薬の試験安定性は、活動飛行前の手続きの間と、飛行中の拡張されたブレーク（時間以上）にさらされたとき。温度が飛行の場所でかなり高い可能性があることにも注意してください。
   7. 主要事業者が巧妙に飛行中のデバイスを動作させるように、複数の個人を訓練する。それは、放物線の間に病気になり、特定のユーザーが1つのフライトに影響を受けていてもよく、別の上の病気になる人予測不可能である。
4. 地上設備とサポート材料
   1. ハンドツール、はんだ付け装置、および他の多くの項目の中のり/エポキシなどの修理のために必要なバックアップコンポーネントや機器を含むようにツールボックスを組み立てます。
   2. サンプルや試薬が既に飛行のために準備された後に予期しない飛行延期が発生した場合の定期便時に使うことを意図している以上、検体と試薬量を収集します。
5. 出荷
   1. リグを輸送するのに必要なセットアップ出荷、地上設備（ツール、遠心分離、ピペット、ボルテックスミキサー、その他）、および生鮮食品（血液細胞、試薬）。フライトキャンペーンのために、受信、検査、組み立て、およびテストハードウェアに十分な時間を確保する。
   2. プチプチを用いたボトムを除くすべての側面に包み込むリグ。フォームパッド衝撃材を内嵌カスタム木枠箱を使用して、船リグ。
   3. 船は硬質容器や胸に地上設備/ツールをサポートしている。
   4. 1における船舶生鮮食品。絶縁厚い4℃の保管が必要な項目について、-20℃の保管とフリーザークールパックを必要とする項目のドライアイスを含む泡箱、。
6. 飛行前のテスト
   数日間のフライト前にすべてのコンポーネントの機能を確認するために、飛行位置で飛行前のテストを実行します。
   飛行リグを秤量され、クレーンは、航空機上にロードされ、飛行週の期間中、航空機にとどまる可能性が高い。

3.機内デモンストレーション

デモンストレーション/実験は2日間の名称（下記の「デイA」と「デイB」）の間で分割されている。デイAはミクロのデモ用に指定され、デイBは粒子の検出およびサンプルロードのデモ用に指定されている。

1. マイクロミキサーのデモンストレーション用のグラウンド試料調製（デイAのみ）
   1. 12ミリリットル1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に3ミリリットルの青色食用色素を希釈する。
   2. 3ミリリットルを希釈黄色の食用色素iのNtoのPBS 1×12ミリリットル。
   3. 歪み市販精製赤血球15mlの。
      注意 ：何の試験方法は、100％確実に感染性物質が存在しないことを保証することはできないため、人間の派生製品は、常に、生物学的な危険として扱われるべきである。
   4. ロード·サンプル各サンプルのバイアル（ステップ3.3を参照）に加え、生理食塩水のみを含む追加のバイアル。
2. 光学ブロックのデモンストレーション用のグラウンドサンプル調製
   1. 1％Tweenで14ミリリットル1×PBS（4.3ビーズ/μl）を60μlの蛍光カウントビーズを組み合わせています。サンプルバイアル内にロードします。
      注意 ：注意と個人用保護具（PPE）を使用して、すべての化学物質を取り扱ってください。
   2. 1X PBSで50μlの指スティック全血サンプル100倍に希釈し、[決勝] = 5μMのためSYTO 83染料を追加します。軽くボルテックス混合する。室温で> 5分間インキュベートする。
      注意 ：SYTO 83色素がdimethylsulfoxiに溶解させ、デド（DMSO）、容易に皮膚から吸収されている。眼、呼吸器系および皮膚を刺激することもできる。 PPEを使用して処理します。
   3. （4分間2300×gで）遠心分離細胞サンプル、上清をピペット。
   4. 上清オフ4分間ピペッティング用2300×gで遠心分離し、PBS 1X 1ミリリットルを追加することによって染色された細胞試料を洗ってください。さらに2回繰り返します。
   5. オリジナルの商業株式の500倍希釈液：最終1に達するようにするための1×PBSで15ミリリットルにボリュームを返します。サンプルバイアルにひずみ細胞および負荷。
3. サンプルローダデモ用のグラウンド試料調製（デイBのみ）
   1. かみそりの刃で15ミリメートルのセグメントにマイクロヘマトクリット毛細管を切断することにより、サンプルローダデモンストレーション用キャピラリー消耗品を準備します。
   2. ローダデモ用のサンプルを準備します。250μlの希釈されていない青色の食用色素で250μlの株式蛍光ビーズ（500ビーズ/μl）を混ぜる。 2 1ミリリットルシリンジに250μlのサンプルを描く、それぞれが丸い先端ね装備電気テープで閉鎖されているテーピングedle。
4. 流体源バイアルをロード
   1. （許容できる手袋から指を切っ）バイアルに新鮮な、パウダーフリーのラテックスダイヤフラムを適用します。振動板は、バイアル、床から延び、トップ外側リムの上に折り畳むのに十分な長さを確認してください。折り畳まれた部分の上にバイアルのリングをスライドさせます。
   2. キャップ挿入中に流体が排除を防ぐことができますキャップ出口チューブの上に一時的なスライドクランプを置きます。
   3. バイアルを充填する前に、否定的にダイヤフラムを拡大するため注射器でバイアルを加圧する。バイアルの上部に流体注ぎ、空気が（一部の流体がこぼれます）キャップ配置中にキャップの下に閉じ込められていないような角度でキャップを挿入します。簡単に言うと、ダイヤフラムによって及ぼさプライムアウトレットチューブとリリース崩壊圧力にスライドクランプを取り外します。
5. リグのデモを準備
   1. 接続し、すべてのチューブ接続を確認
   2. システムにソースバイアルを引っ掛けます。カスタムアクリに収まるバイアルlicのバイアルホルダーで固定し、面ファスナー。
   3. バイアルまたはビン内の任意の含まれている廃棄物を空にします。
   4. ハードドライブの空き容量とスタートアップのカスタムデモンストレーション·ソフトウェアを確認してください。
   5. 各デモへの具体的な手順をプライミングシステム流体工学を実行します。
   6. あらゆるバッテリ駆動デバイス（ 例えば 、加速度計）に新しい電池に交換します。
   7. 手動で蛍光粒子のサンプルを振る。
   8. 短時間の飛行前のテスト実験を実行します。
6. 飛行中の乗り物酔いを避ける
   1. （機内乗り物酔いを防止するための安全で効果的なの両方スコポラミンおよびデキストロ、）提供薬を服用
   2. 留意（ 例えば 、ストレートボディと、増加した重力中に背中に平らにし、頭が前方に傾け、そして体が減少し、重力への移行時に自力で浮上することができます）機内ボディポジショニング戦略をお勧めします。可能であれば、重力変化に適応するためにいくつかの初期の放物線を使用しています。
   3. フロントポケット内に簡単にアクセスビニール嘔吐袋を保持している。嘔吐は突然吐き気を先行することなく、発生する可能性があります。
7. 専用のパラボラ空域に近づい一度機内位置リグオペレータ、。リグ事業者が高重力間隔の間に横になると脚ストラップへのアクセスを可能にすることを可能にするのに十分なスペースを提供する。放物線が開始すると、これはアップが早すぎると、やや危険なボディを送ることができるように、減少重力中に身体に強い力を加えないでください。
8. マイクロ流体ミキサーデモを行います（デイAのみ）
   1. 手動でテスト実行前に、血液バイアルを振る。
   2. 他の測定値に同期した映像データを記録する、少なくとも2つの放物線それぞれについて、1.5、2、3、4、5、および6 psiで1：1の比率で血液と生理食塩水を混ぜる。
   3. チャネルアーキテクチャ意志トラップするかどうかの最適な混合を防止できた泡をテストするために生理食塩水注入口に空気を注入します。
   4. 少なくとも2 1.5、2、3、4、5、および6 psiで青と黄色の食用色素を混ぜ放物線は、それぞれ、再び同期データを記録する。
   5. さらに廃棄物の発生を防止するために終了したら、システムの流体工学へのスライドクランプを適用します。
   6. デモ繰り返しが必要な場合に、電子機器をシャットダウンする前に、データの整合性を確認してください。
9. 光学ブロックとサンプルローダーのデモンストレーションを行います（デイBのみ）
   1. 手動で実行する前にサンプルを振る。
   2. 3放物線ための光学ブロックを通して蛍光計数ビーズをドライブ。サンプルタイプの間に少なくとも1放物線のための生理食塩水でシステムを洗浄。
   3. 蛍光ハイドロゲル粒子と白血球のための3.9.2を繰り返します。
   4. サンプルローダデモに移る前に繰り返される必要が欠落しているエンティティのデータを確認してください。
   5. HDビデオレコーダーを使用してサンプルローダデモの記録を開始。
   6. 平面が減少重力に入ると、指穿刺サンプルをシミュレートするために指先に計数ビーズ染料混合物の液滴を配置する試料シリンジを使用。使用減少した重力の際に指に指プリックサンプルを維持するの限界をテストするために非現実的に大きく低下します（ 図1D）。
   7. キャピラリーローダーに指や負荷オフのサンプル（約10μl）をピックアップして、毛細管消耗品を使用してください。
   8. ボックスに含まれてワイプを使って指から残ったサンプルを拭いてください。
   9. 検出のための光学系内に試料を駆動します。
   10. 別の演算子を用いた試験を数回繰り返します。
   11. エレクトロニクスをシャットダウンする前に繰り返される必要が欠落しているエンティティのデータを確認してください。
10. 飛行後のシャットダウン
    1. 空であり、必要に応じて、バイオハザードラベル封じ込めコンセントを使用して適切に廃棄物を処分する。有害廃棄物は、航空機、施設の外に出荷が必要な場合があります。
    2. 強力な洗浄を提供するために水を装填した5mlシリンジを使用して徹底的にフラッシュシステム。 ·フラッシュバルブ前後にすべての3ポートを介して。
    3. アルコールワイプを使用して、任意の混乱を拭う。
    4. 次のデモのための吸い込まシステム。

実体顕微鏡に取り付けられたCCDカメラで見たマイクロミキサのデモンストレーションのための代表的な結果を図7に表示される。血液/食塩水および青/黄色染料：混合目視ならびに流体の二組を含む実験用の出口チャネルにおいて、螺旋に沿った任意の点で評価することができる。他の刊行物^38-40に示すように、2次元画像の定量分析は、異なる領域に、チャネル幅にわたってシェードの均一性を決定することを含むことができる。詳細については、 補足図1を参照してください。マイクロ流体チップによるバブル処理のデモンストレーションのための補足図2を参照してください。

光学ブロックとサンプルローダデモにおける粒子検出のための結果を、それぞれ、 図7CおよびDに表示されます。蛍光標識された白血球の光学ブロック検出（Fiのグレ7C） ほぼ無重力約1.5グラムからの遷移によって比較的非摂動表示され、バック1.5グラムへの移行時に継続します。サンプルローダデータはサンプルが正常にロードされ（ここでは、月の重力条件下での）と検出（図7D）用の光学ブロックに達したことを示している。データ読み出しの定量分析は、通常、高重力条件に対して減少にカウントし、信号対雑音比を比較するために、カスタムのピーク計数アルゴリズムを利用する。拡張されたトレースおよびサンプル分析のための補足図3を参照してください。

図1：流体工学サブコンポーネント（A）は 、候補ソースバイアルは、で、InSeに沿って2つのOリングを装着したカスタム加工されたアルミキャップを使用してRTED部分。しっかりと上部のバイアルリムに対してキャップを保持するバイアル」リング、 'へのダウンキャップスクリュー（B）候補廃棄バイアルキャップは上部のカット開口部を通過する空気ではなく、流体ができます。（C）候補サンプルローダーは、個別に2ガイドレールに適合機械加工ヘッド、中央、足の部分を含む。ガイドレールの間隔は、毛細管の位置決めを容易にする。指先から（D）A収集されたサンプル液滴が流体ラインにロードされる。（E）候補スパイラル渦マイクロミキサーは、3回転を介して2つの溶液を混合する（ '1'、 '2'、 「3」）のスパイラル（1.9〜0.9ミリメートル内側の半径）と渦ドレイン（​​「V」、直径320ミクロン）。次に、流体は、出口チャネル（「E」）にマイクロボアチューブを経由して渡されます。チャンネルは、高さ120μm、幅200μmである。渦ドレイン（V）の高さは、1〜2 mmピンを満たす前である。（F）は、チップのフットプリントであるダイムよりも比較的小さい。

図2：光·電子サブコンポーネント。 （A）候補光学ブロック部品の設計は、2つのレーザ（「緑」および「赤」）に加えて、いくつかのビームスプリッタ（「BS」）、レンズ、及び光子検出器（「PD」）、（B）は 、固体モデル化された設計（挿入図）が含まれ、機械加工アルマイト処理、および組み立てられる。段階（S）、セルの配置部位（青い矢印）、赤色レーザー（赤色矢印）フローが標識されている。（C）飛行中の試験のために、ブロックはまた、光子に供給する光ファイバを保持するクランプ位置合わせ器具を使用して固定されている。モジュールを数える。（D）大DAQボードや手半田付け電子機器は制御/取得エレクトロニクス前に現実的な解決策であるが、マイクロエレクトロニクスequivaleにすることができる NTS。 （左への標識されていないカスタム黒のアクリルボックス、でカバー）光学ブロックは、加速度計との写真に見える（ 'Accの。'）の上に固定された。マイクロミキサーのデモンストレーションのための（E）の例カスタムソフトウェアは、同時デバイス制御を可能にし、読み出し、およびデータストレージ。

図3：テストリグレイアウト（A）飛行環境が同時に飛行中の実験を実行しているどのように多くの基に応じて混雑することができる、（B）リグコンポーネントは3つのレベルの間で分割垂直機器ラックに組み立てられている。レッグストラップ（赤と黄色）ラックの周囲に円弧状に表示されている。（C）は 、顕微鏡ブレッドボード板はデモやエレクトロニクスボックスを配置するための4象限に分割されている。

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図5：その他のコンポーネントは、Simple介入を介して機能するためにデモンストレーションを有効にする。 （A）空気圧スプリッタが部分的に中空で構成され、針に適合されたシリンダをタップ。圧力出口は、選択的に、出口ポートの数を減らすためにクランプすることができる。（B）12の三方電磁弁のパネル（C）において、タンデムMOSFET回路を介して制御される。

図6：機内デモンストレーション三方ソレノイドバルブは、共通ポート（白矢印の先端）を持って、常にデフォルトOFF PORのいずれかに接続されている。T（赤）またはポートのON（緑）。 ON状態にスイッチが5ボルトI / O信号にトリガされる。（A）サンプルローダデモサンプルをロードし、検出のための光学ブロック（OB）にサンプルを駆動含まれる。セットアップは2バルブ、前のものとローダ次々に利用しています。ロード時に、両方の弁は、ローダが利用されるように、流体移動を防止する、OFFに設定されている。 ONにバルブを回すと、生理食塩水（S）から延びる流体工学経路はポ ​​ンプは、分析のためのサンプルをドライブすることができ、廃棄物（W）のバイアルにバイアルが開きます。（B）は 「手動」から「1ボタン」の介入への移行光学ブロックデモ3つの異なるサンプルタイプの連続的試験を可能 - 蛍光計数ビーズ（CB）、独自の蛍光ヒドロゲル微粒子（NS）を、および蛍光標識された白血球 - チューブ接続を再設定する必要なし。生理食塩水は、サンプル間のシステムを洗浄することができる。 SPL。 =航空圧力スプリッタ。

図7：代表的な結果。 （A）マイクロ重力条件下で混合青黄色染料（B）月の重力条件下での血液、生理食塩水混合。重力飛行中の（C）、WBC検出。フローサイトメトリーデータのための重要なパフォーマンス·メトリックは、ピーク強度、信号対雑音比、ピーク計数率、および検出効率の変動係数が含まれる。（D）蛍光計数ビーズが装填されたサンプルにスパイクの実証後に検出され月の重力でローダ。

補足図1：ミキシング分析（血液生理食塩水）。 （A）の画像をミキシングはグレースケールに変換され、指定された領域（入口は、1-3スパイラル、そして出口）で分析されているあたり式σ= <（I - ^{）2> 1/2σ0}と1との混合、I =グレースケール強度の程度を反映し、<>は 、サンプル全体の平均である。この方法は、公開された文献^38-40で同様の判断を反映している。完全に混合試料の場合、σはゼロに等しい。混合されていないサンプルについて、σは 0.5〜0.4に等しい。シグマ値が0.1未満である。実際には、完全に混合。混合は、3次元のプロセスであり、したがって、完全に混合度を記述するために（共焦点顕微鏡または他の手段を介して）、3次元的評価を必要とするため、この方法は、デモンストレーション目的のために十分であるが、限られている。（B）血液、生理食塩水の混合結果飛行で得られた、異なる重力条件の下に表示されます。 「高」重力グラフは、マイクロ重力飛行中に得られた。ポンプ駆動圧力自体から準が増加各グラフの左から右へ。

補足図2：バブル処理のデモンストレーション 。一つの高重力と微小重力で注入1に注入された二つの気泡が、ビデオ観察経由時間をかけてトレースされます。各バブルは、効果的にマイクロ流体チップをクリアします。性能トラップ気泡大きい傾向が他の地上テスト混合ジオメトリのそれとは対照的である（データは示さず）。白い矢印は、静止画像に生理食塩水から区別することは困難であるチップを通る空気の移動を示している。

補足図3：トレースサイトメトリ拡張フロー蛍光計数ビーズ（A）及び図3放物線上に記録された白血球（B）検出トレースが示されている。検出率（ピーク/秒）は、カスタム·ソフトウェアを経由して決定されるようなハイとローの重力期間中（白いテキスト）が表示されます。他の重要なメトリック（ 例えば 、coeffiピーク強度、信号対雑音比）の変化のcientは流体工学及び光検出アーキテクチャ上で重力の影響を洞察するために測定することができる。

ここで説明する方法は、地上試験に匹敵する結果が得られ、2010 FAST放物線飛行中に主要な技術要素（サンプルローディング、マイクロ流体混合、および光学的検出）の有効デモンストレーションを可能にした。ここで説明するトレーニングとSOPの方法が特に有効であった、とツールを照らすために貢献し、他の「松葉杖」はパラボリックフライトオンボード利用できないでしょう練習のデモンストレーションのために依拠している。

改善のための領域が封じ込めとレイアウトが含まれています。カスタムアクリルコンポーネントは、封じ込めの目的のために十分に強固でないかもしれない。 「グローブ」ボックスが重力遷移時に飛行中の乗客に打たれ、その後ラフ飛行機着陸時にばらばらになったし。マイクロ流体チップに接続されたチューブは簡単にキャビン環境に食用色素をリークし、青 - 黄染料混合デモ中に外されるようになった。これは、中に固定される必要マイクロボアチューブを再接続すると、器用さと、ユーザの安定性を必要とするため、特に困難だった高G区間、。レイアウトの点では、起立高さでノートパソコンの配置が難しく、高gの間隔中に動作させる。高Gの段階で立つしようとしたときにユーザーが光の頭になることがあります。中間レベルのコンピュータは、より良い代替であってもよいが、ここではプロトタイプのサブコンポーネントの変位を必要とした。これは放物線のフライトで不足している追加のスペースを、必要とするが、他の研究者は、テスト演算子²⁶の安定化のために彼らの放物線飛行セットアップで座席が含まれている。

パラボリックフライトの前のデモに比べ準備とセットアップに関するより詳細なレベルを提供することに加え、フローサイトメトリーでは、この作品は潜在的に重要な「仲間」の技術を含めること（ すなわち 、試薬混合およびサンプルdのマイクロ流体チップを記述するサイトメーターと並んilution）。サンプルの前処理（ 例えば 、蛍光染色、混合、インキュベーション）、地面に実行されるように、順番に減少し、重力で同じ機能を達成するために必要なこのようなミキシングチップなどのコンパニオン技術を、作る空間に困難または危険である可能性。本研究とは対照的に、潜在的に空間に値するフローサイトメーターの前のデモは、サンプル前処理のギャップを埋めるために、示された戦略なし（地上で前処理されたサンプルを使用して）、フローサイトメトリーの性能にほとんど完全に焦点を当てている。記載「光ファイバベースの 'がフローサイトメーター、例えば、免疫表現型、およびマイクロビーズに基づくサイトカインアッセイのために地面にロードされたサンプルカートリッジを使用して、システムが実際の機内診断に適合させることができるかは明らかではない。いくつかの努力が部分的に最近の改善^41を見ている全血染色デバイスの開発を含め、問題に対処してきた。 NASA-全血染色装置⁵と、潜在的に使用可能な予備染色法を利用したフローサイトメーターを試験した。それでも、必要なスペース対応のコンパニオン技術を開発するための努力は、近い将来にスペースやその他の資源が限られた環境では、診断目的のために非現実的なフローサイトメトリーを維持するために、フローサイトメーターを開発するためにそれらの背後に十分に遅れているようだ。より一般的には、宇宙空間のための任意たIVDの開発​​者は、技術のための完全なワークフロー適応を考慮する必要があり、常に限ら縮小重力飛行の機会を最大限に活用するために、潜在的に必要なコンパニオン技術のテストを考慮する必要があります。

記載プロトタイプフローサイトメーターは、より高度な流体工学、光学、電子工学を利用して、より洗練されたデザインのための出発点である。流体力学的流動焦点と追加の検出チャネル（ 例えば、光散乱、吸収が）のようなアプリケーションのための粒子差別を改善するであろう白血球示差。一部のコンポーネントは、彼らがリグベースの設計では便利であるが、実際のハンドヘルドデバイス（ 例えば、廃棄物バイアル、制御/集録エレクトロニクス）における非現実的であるというだけの理由で交換する必要があります。マイクロエレクト​​ロニクスが含まれるであろう、より高度な電子機器は、ラップトップおよび関連DAQカードを排除するためにミニチュアスクリーンインターフェイスや組み込みマイクロプロセッサを使用して操作。

ユージンY.チャン、キャンディスペ、とジュリアZのシャープは、DNA医学研究所、商業実体を通じて提出し、関連技術の特許について発明者である。

ハードウェア開発は、NASA SBIR契約のNNX09CA44CとNNX1​​0CA97Cによってサポートされていました。光学ブロックとサンプルローダーデモンストレーションのためのデータ分析は、米航空宇宙局（NASA）の第III相契約NNC11CA04Cによってサポートされていました。ヒトの血液採取は、NASA IRBプロトコール＃SA-10から008を用いて行った。ナショナルインスツルメンツの医療機器助成プログラムを通じて提供される制御/集録ソフトウェア。マイクロチップのための金型はジョンズ·ホプキンス大学の微細加工施設、ナノスケールシステムのためのハーバードセンターで行われた。夏は2010年、NASAの飛行映像スタッフの間にラックアセンブリに助けオットーJ. Brinerとルークジャッフェ（DNA医学研究所）は、飛行週の間にビデオ映像を提供した。カルロス·バリエントス（DNA医学研究所）が写真とフィギュアの援助を提供しました。テクノロジー2010プログラムの宇宙環境へのファシリテアクセスに感謝し、米航空宇宙局（NASA）の削減重力オフィス、人間の適応とその対策課、NASAグレンリサーチセンター、ZIN·テクノロジーズと人間の研究プログラム。