線形増幅媒介のPCR - 不明隣接するDNAの遺伝的要素と特性の局在

（LAM）-PCR媒介線形増幅は、ゲノムにウイルスベクターを統合の正確な位置を特定するために開発された方法である。技術などの遺伝子治療患者におけるクローン性のダイナミクスを研究するための優れた方法、新規ベクター技術のバイオセーフティ、T細胞の多様性、癌幹細胞モデルであるように進化している

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3’- and 5’- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

PCR（LAM-PCR）媒介線形増幅は、任意の起源の既知のDNAに隣接する未知の隣接DNAを同定し、特徴づけることができます。具体的には、LAM-PCRは、宿主ゲノム内に^1,2（IS）ウイルスベクター組込み部位を局在化するために開発された。レトロウイルスやトランスポゾンのような遺伝的要素が（半）ランダムに^3-6で宿主ゲノムにそれらのゲノムを統合。多くの場合、これらのベクターは、集積正確に位置を知ることが決定的である。 LAM-PCRは、ライゲーション媒介PCR法⁷およびその変種またはインバースPCR ⁸のような代替技術よりも優れていることが証明されています。この方法の感度およびロバスト性は、ベクターゲノム接合の初期前置増幅、増幅されたPCR産物の磁気選択から生じる。上記の代替的な方法と同様に、LAM-PCR法は、IS ^9月11日の検索能力に偏りを導入し、制限酵素の使用に依存している。このように、ISレパートリー（integrome）のサブセットのみが1の反応で検出することができる。このバイアスは、制限酵素⁹の最適な組み合わせを使用して所与の試料の平行分析することによって最小化される。近年、非制限LAM-PCR（nrLAM-PCR）と呼ばれる技術の変形は、制限酵素の使用を回避し、単一の反応^9,12試料の公平なゲノムワイドな解析を可能にする開発されている。

過去には、LAM-PCRは、原因レトロウイルスは、臨床遺伝子治療試験^13-15における少数の患者における白血病を引き起こすIS同定するために使用されている。それ以来、LAM-PCRを識別するように適合されている他の組込みベクター（レンチウイルスベクター、トランスポゾン）にも受動的にアデノ随伴ベクター（AAV）またはインテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクター（IDLV）のようなベクトルを統合する統合パターンを識別するためにからのものである^{16 -21。} LAM-PCR法の応用を広げている。伝統的なLY、技術が広く遺伝子治療を受けた患者における遺伝子改変細胞のクローン組成を研究するために、またはそれらの積分^15,16,22-24挙動^を解明することにより、新規なベクター系の生物学的安全性を評価するために使用される。最近では、LAM-PCRはIDLV捕獲アッセイ²⁵でデザイナーのヌクレアーゼの特異性とオフターゲット活性を測定することができました。

また、LAM-PCR法は簡単に生物中で時間をかけて導入細胞の運命を追跡することができます。このことは、癌原遺伝子、ならびに腫瘍抑制遺伝子を同定するために、また、造血又は癌幹細胞生物学^26-28を研究することを可能にする。少なくとも最後のではなく、LAM-PCR法は、ヒト^29（および未発表データ）におけるT細胞受容体の多様性を研究するようになった。

テクノロジーの本質的なパワーは、一塩基rで未知のフランキングDNAの何百万人を特徴づけることができ、深いシーケンシング技術にメソッドをリンクすることによって強化されている全ゲノム中esolution。以下のプロトコルでは、レンチウイルスベクターを特定するために例示的に知られていない隣接DNAの増幅および識別は、ステップバイステップを説明します。プロトコルで使用したオリゴヌクレオチドを表1に示す。抽出DNA又は任意の供給源のcDNAをLAM-PCRおよびnrLAM-PCRのためのDNA鋳型として使用することができる。

リンカーカセット1。準備（LC）

1. LC1オリゴヌクレオチド（ 表1）の40μL、LC2オリゴヌクレオチド（適切な制限酵素オーバーハングを有する表1）の40μL、110μLのTris-HCl（100ミリモル、pH7.5）にし、10μlの250のMgCl _2を混ぜる。
2. 5分間95℃でインキュベートし、反応を室温までゆっくりと冷ましてみましょう。 300μlのH ₂ Oを加え、遠心分離フィルターにdsLinker-DNAを集中。 0.2 PCRチューブで準備リンカーカセットの溶出液を、アリコート10μlに80μlのH ₂ Oを追加します。

ベクターゲノム接合の2。プレ増幅

1. 分析される各サンプルを50μlのPCR反応物を調製するため。
   1. DNAサンプルの濃度を決定する。 0.2ミリリットルのPCRチューブにDNAをピペットXμL（LAM/100-1のため1〜1,000 ngの、nrLAM 000 NG）。 DNAの量は、各サンプルにし、RANに等しくなるはずである0.5から25μLのGE。
   2. 表2に記載したようにPCRマスターミックスを調製ミックス（50 - x）を0.2ミリリットルのPCRチューブ中の各DNAサンプルとマスターミックス液。
2. 表2に例示したPCR条件を用いて、プリアンプするベクターゲノム接合部。PCRの完了後、各PCRチューブおよびPCR再放送番組に0.5μlのTaqポリメラーゼを加える。 PCR産物は、-20℃で最大4日間または長期間、4℃で保存することができる

PCR産物の3。磁気分離

1. 磁性ビーズの作製
   1. ピペット1.5ミリリットルチューブにストレプトアビジン被覆磁性ビーズを20μl（200μgの）、室温で磁性粒子分離（MPS）に1分間さらすこと。上清を捨てる。
   2. MPSからチューブを外し、40μLPSB / 0.1％のBSA（pH7.5）中の磁気ビーズを懸濁します。 1分間のMPSに公​​開し、上澄みを捨てる。一度この手順を繰り返します。
   3. 洗浄ビーズWI3 MのLiCl溶液20μl（3 MのLiCl、10mMトリス-HCl、1mMのEDTA）番目1分間のMPSに公​​開し、上澄みを捨てる。 6 M LiCl溶液（6M LiClと10 mMのトリス-HCl、1mMのEDTA）50μlに再懸濁ビーズ。
2. 作製した磁気ビーズを50μlのステップ2.2からの全体のPCR反応を混ぜる。少なくとも室温で2時間、水平振とう器（300 rpm）の上でインキュベートする。このステップでは、コーティングされたビーズ（DNA-ビーズ複合体）をストレプトアビジンビオチン化PCR産物に結合できます。 DNAビーズ複合体を一晩振とう器上でインキュベートし、又は最大4日間4℃で保存することができる。
3. 室温で1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を公開、上清を除去し、100μlのH ₂ O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁すぐにLAMやnrLAMステップ5ステップ4に進みます。

4。LAM-手順

1. 二本鎖DNA（dsDNAの）合成（LAMのみ）
   1. 1分間のMPSとDIS、ステップ3.3からDNA-ビーズ複合体を公開カード上清。 H ₂ Oを8.25μL、1μlの10倍ヘキサバッファー、0.25μLのdNTP（10 mM）および0.5μL（2 U）ノウポリメラーゼを追加します。 1時間37℃でインキュベートする。
   2. H ₂ Oを90μLを加え、1分間のMPSに公開。上澄み液を捨て、100μlのH ₂ O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁
2. 制限消化
   1. 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を露出させ、上澄みを捨てる。制限酵素バッファー、制限酵素0.5μlの1μLの10倍、8.5μlのH ₂ Oを加え、1時間反応をインキュベートする。ステップ4.1.2を繰り返します。
      注：制限酵素のメーカーが推奨する温度で反応をインキュベートする。内に存在するか、目的のDNAで前増幅のために使用されるプライマー結合部位の下流に制限部位が存在しないことを確認してください。適当な制限酵素/制限酵素の組み合わせの選択のために⁹を参照してください。
3. DSリンカ（LK）の連結
   1. 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を露出させ、上澄みを捨てる。 5μlのH ₂ O、1μLの10X FastLinkバッファー、1μlのATP（10mM）を、ステップ1.2〜2μLリンカーカセット、および1μlの高速リンクDNAリガーゼ（2単位/μl）を追加します。 5分間室温でインキュベートする。ステップ4.1.2を繰り返します。
4. 合成したdsDNAの変性
   1. 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を露出させ、上澄みを捨てる。 5μLの0.1NのNaOHに再懸濁DNA-ビーズ複合体。水平シェーカー上で室温で5分間インキュベートする。
   2. 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を公開し、新しい1.5 mlチューブに上清を含む前置増幅、ベクターゲノム接合を収集します。すぐに-20℃で、ステップ6またはストア上清を進める

5。nrLAM - 手順

1. 一本鎖リンカーのライゲーション（SSLC）（nrLAMのみ）
   1. MPSにステップ3.3からDNA-ビーズ複合体を公開1分間、上澄みを捨てる。 6.5μlのH ₂ Oを追加し、1μlを10倍反応バッファーを、CircLigase 0.5μLのMnCl _2（50mm）で、0.5のATP（1 mM）をμL、1μlのssLinkerオリゴヌクレオチドおよび0.5μlのCircLigase（100 U /μL）。 1時間60℃でインキュベートする。
   2. H ₂ Oを90μLを加え、1分間のMPSに公開。上澄み液を捨て、100μlのH ₂ O中のDNA-ビーズ複合体を洗うこの場合も、1分間のMPSに公開上清を廃棄し、10μlのH ₂ O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁

6。指数関数的増幅I

1. 分析される各サンプルを50μlのPCR反応物を調製するため。
   1. （ステップ4.4.2（LAM）または5.1.2（nrLAM）から）、ピペット2μlのテンプレートDNA 0.2ミリリットルのPCRチューブに。
   2. 表3に記載したようにPCRマスターミックスを調製する。ステップ6.1.1から各サンプルにマスターミックス48μLを追加し、PCR conditioによりベクターゲノム接合部を増幅する表3に例示したナノは、PCR産物は、-20℃で最大4日間または長期間、4℃で保存することができる。

PCR産物の7。磁気分離

1. 3.1.3 - ステップ3.1.1に例示したように磁気ビーズを準備します。 6 M LiCl溶液（6M LiClと10 mMのトリス-HCl、1mMのEDTA）の（nrLAM用）（LAM用）20μLまたは50μLに再懸濁ビーズ。作製した磁気ビーズ（ステップ7.1）でステップ6.1.2から20μL（LAM）またはPCR反応液50μl（nrLAM）を混合し、室温で2時間、水平振盪（300回転）上でインキュベートする。 DNAビーズ複合体を一晩振とう器上でインキュベートし、又は最大4日間4℃で保存することができる。
2. 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を公開、上清を除去し、100μlのH ₂ O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を露出させ、上澄みを捨てる。
3. 20μL（LAM）または5μL（nrLAM）0.1NのNaOHに再懸濁DNA-ビーズ複合体。 Incu水平シェーカー上で室温で10分間BATE、1分間のMPSに公​​開し、新しい1.5 mlチューブに上清を含む増幅されたDNAを収集します。すぐに-20℃でステップ8.1またはストア上清を進める

8。指数関数的増幅II

1. 分析される各サンプルを50μlのPCR反応物を調製するため。
   1. 0.2ミリリットルのPCRチューブに（ステップ7.3から）ピペット2μlのテンプレートDNA。
   2. 表4に記載したようにPCRマスターミックスを調製する。ステップ8.1.1からの各サンプルにマスターミックス48μlを添加し、表4に例示したPCR条件によってベクターゲノム接合を増幅する。PCR産物は、最大4 4℃で保存することができる-20℃での日または長期
2. 可視化するために（NR）LAM-PCR産物を2％アガロースゲル上で、ステップ8.1.2からのPCR産物の10μlを負荷。バンドが可視である場合、高解像度のゲル上でLAM-PCR産物を10μlを分析する。注意：のEthidium臭化変異原性である。非常に慎重に作業し、常に適切な手袋を着用してください。

ハイスループット配列決定のための9。準備

1. （NR）LAM-PCR産物の精製
   1. 室温AMPure XP磁性ビーズ44μlのステップ8.1.2から40μlのPCR産物を混合します。室温で5分間インキュベートし、さらに2分間、MPSに公​​開。
   2. 上澄み液を捨て、MPSに200μlの70％エタノールで二度洗い。
   3. 上澄み液を捨て、30μlのH ₂ O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁1分間インキュベートし、新鮮な0.2ミリリットルチューブに上清を移す。精製したDNAの濃度を測定する。
2. Fusionprimer PCRは、特定のアダプターの配列を決定する追加します。
   1. 分析される各サンプルを50μlのPCR反応物を調製するため。
   2. 0.2ミリリットルのPCRチューブにDNAをピペットXμL（40 NG）。 DNAの量は、各試料中および0.5〜25μLの範囲で同じにする必要があります。
   3. 表5に記載したようにPCRマスターミックスを調製入れる。（50 - x）が、ステップ9.2.2からの各サンプルにマスターミックス液を、表5に例示したPCR条件によって（NR）LAM-PCR産物をシーケンシングアダプターを導入するPCR産物-20℃で最大4日間または長期間、4℃で保存することができる。
   4. Fusionprimer-PCR産物を可視化するためには、2％アガロースゲル上で、ステップ9.2.3からのPCR産物10μlのロード。 9.1.3 - 9.1.1の手順に記載されるように、残りのPCR産物を精製する。正確Fusionprimer-PCR産物の濃度およびフラグメントサイズを定量化するための自​​動化された高分解能電気泳動デバイス上の工程9.4から1μlの精製PCR産物を分析する。

LAM-PCRは、各接合のために定義された断片サイズを有するベクターゲノム接合部の増幅をもたらす。個々のPCR断片のサイズは、ゲノムDNA中の既知の位置と最も近い制限酵素認識部位の間の距離に依存する。これは、例えば 、ゲル電気泳動により分析試料中の増幅された接合部の多様性を可視化することができ、単一の（モノクローナル）、（オリゴクローナ）は、いくつか、又は複数の（ポリクローナル）のバンドがゲル上に存在する場合。 LAM-PCRの結果は、最高の高分解能電気泳動ゲル（ 図2A）によって観察されず、2％アガロースゲル（ 図2B）上で可視化することができる。 nrLAM-PCRは、個々の接合のための様々な長さのPCR断片を生じる。このように、モノクローナル、オリゴクローナルまたはポリクローナルサンプルは電気泳動によりスメアとして表示され、視覚的に区別することができない。 2％アガロースゲル上nrLAM-PCR産物を視覚化すること成功を決定するのに十分であるプロトコル（ 図2C）のCESS。回収されたゲノムDNAを配列決定した後、ベクター（ 図3A）の場所の正確な位置を識別するために、それぞれの宿主ゲノムに整列させることができる。ゲノムの注釈は、遺伝子コード領域（ 図3B）、または転写開始部位に近い（ 図3C）に統合するための好みのような別のベクター特定の機能用でレパートリーを分析することができます。

図1。LAM-PCRおよびnrLAM-PCR法の概略概要。 A）どちらの方法でも、既知のDNA配列のレトロウイルスベクターの（ここでは長い末端反復配列（LTR））の端に近いハイブリダイズビオチン化プライマーを用いてベクターゲノム接合部の初期プレ増幅で始まる。ビオチン化におけるプリアンプ結果同一または異なるベクターゲノム接合部に異なる大きさの一本鎖DNA。ビオチン化一本鎖DNAは、磁性粒子に捕捉されます。B）LAM PCR、二本鎖DNAの合成で構成される酵素反応工程、制限消化および既知のリンカーDNAの連結のための製品の両端の既知の配列と異なるサイズの製品を生成します。制限長多型に起因して、各増幅された接合部が特徴的な長さを有している。変性後LAM-PCR産物を、リンカーおよびベクター特異的プライマーを用いたネステッドPCRにより増幅される。C）nrLAMためのssDNAリンカー配列を直接リンカーとネストされたPCRによって指数関数的増幅を可能にする）Aからの前置増幅されたssDNAの未知の末端に連結され、ベクター特異的プライマー。この図は、から変更されている ^2,12。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 >

図2。LAM-PCRおよびnrLAM-PCRの代表的な結果。遺伝子療法治療を受けた患者の末梢血から単離されたDNAの、B）LAM-PCR分析。ゲル上のバンドの数は、試料中に存在するISの数に対応する。高分解能ゲル（B）は（A）C）レンチウイルスベクターで形質導入された単一細胞クローンまたはバルク細胞のnrLAM-PCR分析を、2％アガロースゲルでも分析されたサンプルのクローンを可視化するために適している。スミアが電気泳動後のゲル上に見られ、増幅挿入部位の数とは無関係。 M、100 bpラダー; MCは、モノクローナル; OC、オリゴクローナル;パソコン、ポリクローナル。この図は^、2,9から変更されている。

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図3 LAM-PCR及びその後の、ハイスループットシークエンシングによる分析ISのための代表的な例は、ガンマレトロウイルスから二人の患者における分布（青）またはレンチウイルス（緑色）は、臨床遺伝子治療試験IS。それぞれのゲノム配列決定およびLAM-PCR産物のマッピングを評価することができるISの後に、例えば ：ガンマレトロウイルス及びレンチウイルスベクターとCとの間の遺伝子のコード領域に挿入するための好みに応じてIS B）の差A）ゲノムワイドな分布）転写開始部位の近くに挿入するための優先順位。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

表1。LAM-及びnrLAM-PCRのためのオリゴヌクレオチドは、レンチウイルスを増幅するのです。SSLCは5 '末端（P）でリン酸化され、結紮時にSSLCの多量体化を回避するために、3' didesoxycytidin（DDC）であります。一般的には、（NR）LAM-PCRプライマーは、18〜25ヌクレオチドからなるべきであると、宿主ゲノムに合わせるべきではありません。前増幅のためのプライマーは、ベクターの5 'または3'末端（120bpの≤）のできるだけ近くに配置されるべきである。指数PCR IおよびIIのための2つの追加のプライマーは、プライマー間に配置される必要があるプレ増幅およびベクトルを最終目的として使用される。プレ増幅および指数PCR用プライマーは、私は5'-リン酸化（P）である必要がある。

表2。ベクターゲノム接合（工程2）の前置増幅のためのPCR-条件。列1-3は、単一のDNAサンプルのPCR増幅のために使用される試薬を示す。列4〜6は、ベクターゲノム接合部をプリアンプするためのPCRプログラムを例示する。

表3。指数的増幅のためのPCR-条件I（ステップ6）。列1-3は、単一のDNAサンプルの指数関数的増幅に用いられるPCR試薬を示す。列4〜6は、指数関数的にリンカー配列のライゲーション後の1サンプルを増幅するために使用されるPCRプログラムを例示する。

表4。指数関数的増幅のためのPCR-条件I（ステップ8）。列1-3は、単一のサンプルのネストされた指数関数的な増幅のために使用されるPCR試薬を示しています。列4-6は、一つのサンプルからのベクターゲノム接合部のネストされた指数関数的増幅に用いるPCRプログラムを例示する。

表5。Fusionprimer-PCR（ステップ9.2）のためのPCR-条件列1-3（NR）LAM-PCR産物の塩基配列決定アダプターを導入するために使用されるPCR試薬を示しています。列4-6 Fusionprimer-PCRに用いるPCRプログラムを例示する。

LAM-PCR法は、既知のDNA領域に隣接する未知のDNA配列を同定することができる。なぜなら公知のDNA配列にハイブリダイズする特異的プライマーを用いた接合の前増幅から得られる高感度のではなく、単一細胞レベルまでさえ稀接合を増幅して検出することができる。反して、ポリクローナル状況でLAM-PCRは、単一の反応において異なる数千の接合部を増幅することができる。

しかしながら、制限酵素の使用にin​​tegromeのみサブフラクションは、すべての特定の制限酵素を用いた接合部の存在についてLAM-PCRにより分析することができる。このように、異なる酵素と同一試料を繰り返し分析が⁹をお勧めします。まだLAM-PCRアンプリコンをゲル上に存在しない場合、最も可能性の高い公知のDNA断片の位置と選択された制限酵素の認識に最も近い部位との間の距離は、LAM-PCR産物を生じるには大きすぎる^9。この場合、他の酵素は、ジャンクションを増幅するために使用されるべきである。

nrLAMは、制限酵素の使用とは無関係であり、従って、総合的に知られているDNA配列に隣接する配列を特徴付ける高度に有用な方法を示している。省略制限は、各増幅された接合部を特徴付ける特定の制限酵素断片長多型が失われたプロトコルの結果からダイジェスト。代わりに、すべての増幅された接合部は、増幅された接合部の多様性とは無関係に、電気泳動の後、ゲル上のスメアをもたらす様々なサイズのPCR産物で表される。

LAM-とnrLAM-PCR産物の両方が下流ハイスループットシークエンシングに最適です。対応するゲノム（NR）LAM-PCR産物と検索された生の配列のマッピングはのハイスループットシークエンシングは、未知の隣接DNAを特徴付けるまたはベクトルゲノムジャンクション³⁰の正確な局在を特定することができます。fusionprimersにバーコード配列を導入することによって、LAM-及びnrLAM-PCR産物の数百一つの配列決定ラン³⁰に配列決定することができる。

上の空で実行された場合、高い感度のため、LAM-PCR法は、汚染の傾向がある。したがって、プロトコルの処理をきれいにするPCRグレードの環境と特別な注意が正常にサンプルを汚染することなくDNAに隣接する未知を増幅するために最も重要である。そのため、非形質導入したゲノムDNAとLAM-PCRのプロトコルに陰性対照として、すべてのPCR反応のための水管理を含むことを強くお勧めします。対照試料は、交差汚染は、プロトコル中に発生したことを示している場合、すべての一時停止点からの生成物は、プロトコルの一部を繰り返すために使用することができる。バンドがまだ存在している場合、すべての試薬 ​​（ 例えば 、プライマー、dNTP類、ポリメラーゼなど）を破棄することを推奨し、新しいアリコートで（NR）LAM-PCRプロトコールを繰り返している。

The authors have nothing to disclose.

Funding was provided by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, grant of the Tumor Center Heidelberg/Mannheim), by the Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), by the VIth + VIIth Framework Programs of the European Commission (CONSERT, CLINIGENE and PERSIST). We thank Ina Kutschera for demonstrating the protocol technique in the video.