角膜マイクロアッセイ：マウス眼における血管新生のモデル

プロトコルは、マウスにおいて開発された角膜マイクロポケットアッセイを説明しています。

マウス角膜マイクロポケットアッセイは、血管形成を評価するための堅牢かつ定量的なin vivoアッセイである。自然に無血管の角膜を通して血管増殖を誘発特定の成長因子を含む標準化された徐放性ペレットを使用することにより、血管新生を測定し、定量することができる。このアッセイにおいて血管新生反応は、使用される成長因子の種類と用量に応じて、数日間にわたって生成される。血管新生の誘導は、一般的に塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）または血管内皮増殖因子（VEGF）のいずれかによってトリガされる。スクラルファートとヒドロン（ポリ-HEMA（ポリ（2 - ヒドロキシエチルメタクリレート）））これらの成長因子を組み合わせて、ペレットに混合物をキャストすることによって、それらは外科的にマウスの眼に埋め込むことができる。これらの均一なペレットは、血管領域Qに必要な十分な血管新生応答を可能にする（それぞれ、bFGFまたはVEGF）五、六日間の成長因子をゆっくりと放しスリットランプを用いてuantification。このアッセイは、血管形成モジュレーター薬または治療、ならびに血管新生に影響を及ぼす異なる遺伝的背景との比較評価を含む異なる用途に使用することができる。この検定の練習後に熟練した研究者は、眼あたり5分未満でペレットを移植することができます。

血管新生のプロセスは、新たな血管の形成は、既存のものを形成し、非常に複雑であり、血管の出芽および形態の異なるステップを制御するいくつかの内因性因子によって調節される。血管新生に起因プロと抗血管新生因子のバランスのずれ、通常は休止状態にある血管系を維持してバランスをトリガされます。成人における血管新生は、そのような女性の卵巣周期中のように、あるいは創傷治癒および組織再生などの修復過程における特定の生理学的条件で発生します。しかし、それはまた、悪性腫瘍、自己免疫状態および炎症性疾患を含むいくつかの病態の特徴である。これらの生理学的および病理学的状態における血管新生の関与は、それの研究と治療のための魅力的な標的のための重要な課題となります。

血管新生の複雑さと、いくつかのCEの関与のために細胞および間質細胞の循環内皮細胞、周皮細胞、を含むプロセスでLLSおよび因子は、in vitroモデルは、限定されるもので残り、 生体内微小環境に固有のを再現することはできません。血管新生の主要なインビトロアッセイは、主に内皮細胞に直接影響を観察し、制御された条件下で血管新生過程の特定のステップを測定することに焦点を当てている。これらのアッセイは、in vitroでのものとは異なり、 エクスビボモデル。内皮細胞増殖¹の定量化、遊走^2、ネットワーク形成^3、管形成⁴及びスフェロイド⁵からの発芽を含む、より複雑であり、多数の組織の細胞型を組み込んで、例がある大動脈輪アッセイ^6。それにもかかわらず、他のシステムと同様に、循環細胞の寄与およびin vivoで存在する内皮細胞の自然な間質をキャプチャすることはできません。試みずっと改善したものの、マイクロ流体システム^7、しかしでもこれらのアッセイを使用して実行されるin vivoでの設定を模倣する流れの下の血管形成を研究するために、まだ、生体内に存在するすべての区画を占めることができない。

ためのin vitroおよび ex vivo血管新生モデルの制限のためのin vivoモデルは、血管新生研究のためのより信頼性の高い選択肢を残る。これらのモデルの例としては、顕微鏡⁸下で成長する血管の可視化を可能にする透明なチャンバー、「窓」の移植、例えばマウス耳およびニワトリ漿尿膜（CAMなどの正常組織におけるマトリゲル及び血管形成のような注射可能な皮下移植を含む）。しかし、最も許容され、定量的なin vivoでの血管新生モデルの一つは、当然無血管悪用ここで説明した角膜マイクロポケット血管新生アッセイは、ある新しい血管新生増殖^9を視覚化し、評価するための「スクリーン」として角膜。

マウスで開発されたようにここでは、角膜マイクロポケットアッセイを記述する。最初に、モデルは、ウサギ角膜における非特異的な血管新生刺激を測定した。これは、ウサギの眼の前房の房水に腫瘍断片を導入することによって行われ、腫瘍誘導性新生血管^11を測定した。

しかし、このアッセイは、後でより良い指定血管新生効果を標準化するために、特定の成長の影響を研究するために^10因子発生した。目に増殖因子を放出するために、血管新生増殖因子の既知量を含有する徐放性ペレットは、代わりに組織を使用した。そのようなbFGFまたはVEGFなどの精製された組換え血管新生タンパク質の利用可能性は、血管新生modulaters ¹²の具体的な目標としてのそれらの使用を可能にした。最初に、このアッセイであった主にそのサイズのためにで動作するように容易になりますが、後でモデルをマウスに翻訳されたウサギ、で使用される;小型で安価な動物モデル。マウスにウサギからシフトすることにより、血管新生^13に影響^を与える遺伝的構成要素の研究の新たな領域を作成し、遺伝子操作した動物を使用することができるという重要な利点を提供した。血管新生の研究に角膜アッセイのより許容使用量に加えて、他の生物学的プロセスはまた、改変されたアッセイを用いて研究されてことができる。例えば、リンパ管新生の研究は、特定の分子マーカー¹⁴を通ってリンパ管の可視化を可能にした低用量のbFGFペレットの注入により可能となった。さらに、このアッセイは、血管形成¹⁵に対する放射線の影響を評価する手段を提供している。

要約すると、角膜マイクロ血管新生アッセイは、定量的、担当者であるin vivoでの血管新生のroducible、柔軟な評価。このアッセイの主な利点は、血管が自然に無血管組織に成長するので、背景血管の測定が不要であることである。私たちは詳細に、ここでこのアッセイのプロトコルを説明し、発生する可能性がありますさまざまなシナリオについて説明します。アッセイは3別個のセグメントで構成されています。ここでは、成長因子の包括的なペレットの調製、その後の外科的移植、最終的に得られた新生血管の成長を定量化するために使用される方法について説明する。

動物に関わるすべてのプロトコルはに提示され、承認施設内動物管理使用委員会によって小児病院ボストンで、かつ実験動物管理の評価と認定協会（AAALAC）の勧告に従って行われているされている。手順の実行中、滅菌機器および無菌techniqureを使用してください。

ペレットの調製

1. スクラルファート10mgのおよび滅菌曲がっていないスパチュラでハイドロン60mgの秤量。個別の微小遠心管に入れます。
2. 無菌10cmの皿にメッシュ1cmの正方形のピースを置きます。そう浅い蓋の上に載っているメッシュ反転。脇に置きます。
3. 少なくとも10分間ハイドロンと渦にエタノールを500μl添加する。
4. 簡潔にスクラルファートと渦に：増殖因子（bFGF用20μgの、VEGFに対する50μgの標準）の適切な量を追加します。に保管して成長因子1 mg / mlの濃度で-80°Cの冷凍庫。追加された液体のボリュームが完全に湿らせたスクラルファートを確保するために20μlの最小であるべきであるが、50μLを超えてはならない。より大きな体積は、次工程での液体の蒸発が困難になる。
5. 混合物が完全に乾くまで使用される液体の量に応じて、通常は30〜50分で、低に設定された遠心エバポレーターにスクラルファート混合物を配置します。
   1. 無菌へらのテーパー端部と残留水分のため、混合物を確認してください。混合物は「歯ごたえ」を感じるはずです。
6. チューブ内にスクラルファート混合物を分割するへらの先細端部を使用してください。
7. スクラルファートにハイドロンの10を添加する。
   1. 原因ヒドロンの粘性に、200μlのピペットチップから端を切ってから、再度ピペッティングスクラルファートに添加する前に10μLを描くとリリース。
8. すぐに曲がったスパッツを使用ULAはハイドロンとスクラルファートを混合し、チューブから削除する。
   1. 曲がったへらの先端部の下側に沿って混合物を収集した後、チューブの壁に沿ってへらを引き出しながら、チューブを回転させます。この手順が効率的に行われなければならないので、混合物は急速に乾燥します。
9. 所定の位置に保持するために鉗子を使用して準備されたメッシュ上の混合物を広げる。混合物が均一な層であることと、メッシュの穴に埋める必要があります。
10. ハイドロンを含むチューブに曲がったへらを浸し、コートのメッシュの両面を、それを使用しています。
11. 皿の縁に側に傾いてコーティングされたメッシュを置き、30〜45分間、室温での乾燥を可能にする。
12. -20℃の冷凍庫でメッシュを配置するか、次のステップにすぐに進みます。皿の内側にメッシュを保管してください。
13. 大きなペトリ皿、蓋オフの内側に35mm皿を置きます。慎重に35mm皿の上に離れて、メッシュの繊維を引っ張って一対の鉗子を使用してください。ストレイペレットC最後に大きな皿から収集することができる。
    1. スコープの下での均一性のために、ペレットを確認してください。プロセスは、このようにbFGFおよびVEGFに対するペレット当たりの標準投与量はそれぞれ80 ngの200 ngの、ある約250のペレットが得られます。
14. 最大3ヶ月間-20℃の冷凍庫で35mmディッシュに保管してペレット。

ペレットの2。外科的移植

1. 手術用顕微鏡下の手術領域を設定します。
2. アベルチン（400-500ミリグラム/ kgを、腹腔内）でマウスを麻酔し、目が見えるように、顕微鏡下でマウスを置きます。麻酔の十分なレベルを確保するために、つま先のピンチを実行します。
3. 眼球の上プロパラカイン液の1滴を配置することによって、マウスの眼を麻酔。 20〜30秒待ってから、ガーゼパッドで軽くたたく。
4. 鈍く＃1宝石商鉗子は鉗子と目の間の皮膚を残すことが確実であることをマウスの眼をProptose。正しく適用される圧力を判断することが重要である。60;緩すぎるホールド目が手術中に移動することを可能にする一方あまりにもしっかりと目を保持することは、それが赤やイライラになることになります。
5. 角膜に角膜輪部から約1mmの切開を作るために30°マイクロナイフを使用してください。切開は、長さ1〜2 mmでなければなりません。切開はmidstromaに上皮層を超えて浸透するのに十分な深しかし目を破裂しそう深くはないでなければなりません。
6. 切開に垂直にポケットを作るためにフォン·グレーフナイフを使用してください。
   1. 切開部位での角質層の下にナイフをスライドさせ、ゆっくりとナイフを働くので、ポケットを形成し、スペースを拡大するために切開に沿って移動します。それは、目の曲で作業できるようにするだけでなく、マウスを移動するのに役立ちます。目を破裂を避けるために先端を下方へ押すことがないように注意してください。
7. プロパラカインで第5位宝石商の鉗子を湿らせ、皿の外にペレットを拾う。目の上にペレットを配置します。
8. プロパラカインとフォン·グレーフナイフを湿らせ、それがゴム状と柔軟にするペレット上に液体の一部を移す。ガーゼパッドまたは綿棒で余分な水分を取り除きます。
9. 角膜層の下の内側にそれをプッシュするフォン·グレーフナイフを使用してポケットにペレットを挿入します。ペレット全体が内側になると、ペレットが安全であることを確認するために、サイト上でフォン·グレーフナイフの平らな面を実行します。
10. コー​​トトリプル抗生物質軟膏眼。
11. マウスを裏返し、反対側の目の中に手術を繰り返します。

角膜血管新生の3定量。

一定期間にわたって血管を開発するために、動物にしておきます。容器グレーディングの日は使用される成長因子に依存する。 5日目と6日目での弱いVEGF上のグレードのbFGF注入の日は0日です。

1. アベルチン（400-500ミリグラム/ kgを、腹腔内）でマウスを麻酔。
2. GRAための細隙灯顕微鏡を使用鼎。一方の眼は、血管が発芽している眼の周囲に血管長と距離を定量化するために、測定の補助として使用される接眼レンズ内のレチクルラインを有している。
   1. そう、目に直接進んペレットと、眼で見られるマウスを配置する、スコープの前でマウスを押したままにします。皮膚は顔に締め付けられると、目を少しproptosedされるように、親指と人差し指の間に頭部を安定させます。
3. ペレットの真下に輪部血管に沿ってレチクルのy軸を置きます。ペレットに向かって上向きに分岐する血管の長さを測定します。ミリの十分のこの測定値を記録し、血管長（VL）（ 図1A）を指定。
4. これらの血管が発芽していることを目の周りの距離が明確になるように、マウスまたはレチクルのどちらかの電源を入れます。それは12の指定この数クロック時間（CH）（ 図1を介して1の間隔で時計の文字盤などの眼と考えるのが最も簡単ですB）。それは、0.25（ 例えば、2、2.25、2.5または2.75）の整数または分画することができます。注：CHが主観的である。例えば、いくつかの他は、容器の長さが最大半量ある時点で測定を停止することがありながら、角膜輪部から発芽したすべての血管を含むように目の周りの距離を測定することができる。重要な要因は、一つは学年に選択する方法と一致していることです。

角膜血管新生の図1の定量。血管の長さを測定するように配向細隙灯レティクルを示すC57BL / 6Jマウスに移植された（A）80ngのbFGFをペレット。 VL = 0.9ミリメートル。 （B）同じ眼を示す細隙灯レチクルは、クロック時間を測定するために回転される。 CH = 3.25。計算された血管領域= 1.84ミリメートル^2。これらの画像は、デジタルレチクル回路図の追加を可能にするために強化されています。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください。

5. 平方ミリメートルで、下記の式を用いて血管領域（VA）を計算し、楕円形の面積に基づいている（注、それはグレーディングときこれを覚えておくと便利です。）エクスプレスVA。次のように式は次のとおりです。
   Vessel全長xクロック時のx 0.2π=血管面積

通常の低血管新生C57BL / 6JマウスにおけるbFGFおよびVEGFペレットのための典型的な結果は、それぞれ、 図2A及びBに示されている。 図2Eは、これらの成長の変化用量のC57BL / 6J株における血管面積（VA）の正規分布を示して要因。 1.8〜2.4ミリメートル²の範囲内の値が許容されるものの80 ngのbFGFをペレットは、通常、約2.0ミリメートル²のVAになる。 200 ngのVEGFペレットは、通常、0.6〜0.9ミリメートル²の許容値の範囲は、約0.7ミリメートル²の応答を引き起こす。抗血管新生効果が疑われる実験のために、より大きな血管領域は減少を視覚化することができることが望ましい。 図3は、bFGFの駆動の新生血管形成に対する抗血管形成薬サリドマイドの効果を示す。治療は、血管成長の38％阻害をもたらした。実験ではどこで増加がよいそれは、標準的なペレットは付近で最大応答を引き起こすように、より低い用量を使用することをお勧めし期待される。 10-40 ngのbFGFをからなるペレットは、（ 図2C）より適切であろう。

特定の成長因子に対する高血管新生反応を有することが知られた株は、複数回、典型的な低血管新生株のVAを持つことができます。 図2Dは ​​、20 ngのFGFペレットへ129S1 / SvImJマウスの応答を示している。比較のために、同じ投与ペレットを図2CにおけるC57BL / 6Jに示されている。 bFGF-とVEGF誘導の血管新生の両方にさまざまな株の血管新生能を詳細に大規模な表では、以前に私たちの研究室¹³で公開されています。

特定の株または色素沈着は、ペレットに応答して、虹彩血管の成長または漏れを示すことができる。これは、1つまたは個別のマウスの両眼に発生する可能性がありますし、またはしない場合がありENTにわたって一貫していることアッセイが行われる怒りグループ。この現象は、前房（前房出血）を埋めるために血を引き起こし、虹彩、血管の破裂をもたらすことができる。 Hyphemas 図4は軽度（4A）を示す。困難または不可能角膜血管新生を等級行い、この発生の重度（4B）フォームができる。

成長因子によって誘導される角膜血管新生の例としては、図2 2.0 mm ^2と等しい血管面積をもたらす低血管新生C57BL / 6Jマウスに移植（A）は80ngのbFGFペレット。この用量は、血管がペレットに到達し、それに成長させることは非常に一般的です。に移植（B）20 ngのbFGFをペレットC57BL / 6Jマウス、1.04ミリメートル²に等しい血管面積が得られる。 （C）200ngのVEGFのペレット0.71 mm ^2と等しい血管面積、その結果、C57BL / 6Jマウスに移植した。高い血管新生129S1 / SvImJ株における（D）を20ngのbFGFペレット。 （C）と比較し、また、20 ngのFGFペレットは、この株が有する血管新生能よりC57BL / 6Jマウスの2倍以上。 （E）角膜血管新生の領域は、VEGFまたはbFGFのいずれかの用量を増加させることによって誘発されたC57BL / 6Jマウスでは（平均±SD、n = 10）であった。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください。

bFGF誘導ヴェスの図3の阻害血管新生阻害剤によるエルの成長。（A）コントロールのビヒクル処置C57BL / 6Jマウス。 2.0ミリメートル²に等しいグループ血管領域をもたらし80ngのbFGFをペレットの移植。 （B）（5日間経口は200mg / kgの）サリドマイド処理したマウス。グループ血管面積は1.25ミリメートル²になり、血管の成長の38％の減少を反映しています。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください。

図4。成長ネズミの虹彩における因子誘導hyphemas。（A）C57BL / 6J-TyrC-2J / Jにおける軽度の前房出血。この株は、それらの着色された対応と同じ角膜血管新生を呈するが、よりプロです出血アイリスにね。 （B）129P3 / Jマウスにおける大規模な前房出血。全体の目は近い虹彩の下部まで赤みだけでなく、血液のより顕著なプールを併設しています。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください。

成功した角膜アッセイを行うにはいくつかの重要なステップがあります。最初は、移植することが可能な均一なペレットを製造し、血管を刺激している。ペレット製剤の最も重要な部分は、1）無担体増殖因子を使用している。 2）エッペンドルフチュー​​ブからのペレットがキャストされたメッシュに迅速にしかし慎重に最終混合物を移動する）スクラルファートとハイドロンと3で、成長因子の良好な混合を確実にする。それは、「ダミー」ペレットはテクニックを実践するために、成長因子なしで行うことをお勧めします。ペレットは、白と白亜の表示され、形状は略正方形である必要があります。これらの領域は、おそらく唯一のハイドロンが含まれているように明確な領域を含む任意のペレットは除外す​​べきである。また、ペレットを模倣する結合ヘパリンスクラルファートを含めることによって安定化され、エタノールおよびそのbFGFおよびVEGFが形成されていることに留意すべきである。スクラルファートはまた徐放PLを提供するのに役立つ成長因子atform。他の刺激剤または阻害剤がペレットに添加される場合、これらの因子は、エタノール中の安定性を決定するために最初に試験されるべきである。それは、「ダミー」のペレットが最初にテクニックを実践するために、成長因子なしで行うことをお勧めします。 「ダミー」または偽ペレットはPBSでのみスクラルファートとハイドロンがテストされている成長因子または化合物の体積の代わりに含まれています。これらのペレットは、血管の成長や輪部の炎症を刺激しない。シャムペレットは、エージェントが血管新生促進であることが疑われて、ペレットへの成長因子を添加せずにテストされている実験では、適切な対照とする。化合物及び増殖因子は、単独で、成長因子のペレットは、適切な制御であろうその場合、相互作用が調査されているインスタンスのためのペレットで組み合わせることができる。

外科的移植は、アッセイの最も困難な部分です。0;これは、切開の適切な深さを測定するために、最初は非常に困難である。深すぎる切開は、地球が破裂する原因となり、眼が動作不能になった。これは劇的な効果であり、したがって、1はすぐに目を「ポップ」しないように学習します。それは一貫して、ポケット形成を可能にするのに十分な深さの切開を作るためにかなり時間がかかります。切開部が浅すぎる場合には、それがポケットを作るために挿入されているように、角膜の最上層は、容易に損傷またはフォングレーフナイフで食い物にされている。新しい血管の成長を定量化する最後のステップは、グレーディングの方法で、一貫性が必要です。目の周囲の成長を描いたクロック時間値はより主観的であるが、血管の長さは簡単な測定である。使用される方法は、マウスからマウスへの実験の間で同じである必要があります。

検定のもう一つの重要なコンポーネントは、麻酔の選択ができますです使いやすさと、外科的処置の成功に影響を与える。それはノーズコーンを介して配信、気化麻酔とは対照的に、マウスの簡単な操作を可能にするように注射用アベルチンは最も複雑である。それが原因げっ歯類^16,17角膜病変との関連にも同様にケタミンとキシラジンの組み合わせを避けることをお勧めします。

これは、実験中のマウスの体重の変化に注意することが重要である。体重減少が悪い住宅事情や病気を示すことができ、これらは、負に目に血管を成長させるマウスの能​​力に影響を与えることができる。もしあれば重みは、失われた重量の百分率を決定するために、ペレット注入及び血管グレーディングの日に注意すべきである。 5％以下の損失が許容され、特に頻繁な投薬を用いた治療実験中、マウスを処理する応力に起因し得る。 5％を超える体重減少が懸念されるとします非特異的に血管の成長を抑制する。従って、このような実験の結果は無効とみなされるべきである。

手順技術および研究変数の有効性の固有の実験差異を説明するために、マウスの最小数は、有効な結果を達成するために使用されるべきである。私たちの経験では、10の目のn個を得たグループあたり5匹のマウスよりも少ない助言ません。

角膜マイクロポケットアッセイの多くの利点にもかかわらず、いくつかの制限もあります。主な欠点は、技術を習得するために、比較的長いトレーニング期間の必要性である。 20〜25匹のマウスの実験では、信頼できるとみなすことができる前に、マウスの眼で働いていない前に、技術的な経験を持つ個人は練習の約4ヶ月を必要とするであろう。また、アッセイを実施する別の人との間のいくつかの変形例では、このように行われた実験間で比較することの可能性を制限することがあるさまざまな人だけ異なる時間の。このモデルのもう1つの制限は、実験は（5-6日）が比較的短く、ペレットからのbFGFまたはVEGFの放出によって制限されているということです。これは、部分的手順の前に所望の時間のマウスの前処理によって補償することができるが、したがって、このアッセイは、 インビボでの速い応答を有する治療に非常に適している。標準薬物検査のアッセイは、典型的にグレーディング（5日目または6）の日まで継続してペレット移植の日に（0日）を投与することを開始します。

この技術の重要性は、それが最も信頼性の高い定量的な血管新生アッセイの1つであることである。マウスでの代替はマトリゲルプラグアッセイである、しかし、このアッセイは、より定性的で、プラグに発生した大規模な細胞浸潤に起因する特定の増殖因子にあまり特異的である。角膜アッセイの柔軟性は1つが量を調整することができますの血管新生生成され、特定の刺激剤を選択する。これは、他の既知のまたは疑われる血管新生因子を標準的な増殖因子を置換することが可能である。加えて、全身送達することなく、抗血管形成活性を評価するために、同一ペレット内で標準的な増殖因子および可能な阻害剤を組み合わせることが可能である。最後に、このアッセイは、いずれかの遺伝的影響をマッピング及び血管形成に対する特定の遺伝子の影響を確立する際に有用であり得る異なる遺伝的背景上で血管新生を刺激することができる。

著者らは、開示することは何もない。

私たちは、グラフィックの仕事のためにクリスティン·ジョンソンに感謝します。