細胞シグナリングのための成体マウスの心筋細胞の単離と文化

我々は、成体マウス心筋細胞の単離のための信頼できる方法を記載している。このプロトコルは、遺伝子改変マウスの様々から機能大人の心筋細胞の培養のための一貫性のある結果が得られます。

技術の進歩は、遺伝子導入および遺伝子ノックアウトマウスは、多くの研究分野において不可欠なツールを含む、遺伝子改変マウスを作った。大人の心筋細胞は広く、心臓細胞生理学や病態生理のためだけでなく、薬学的介入のための良いモデルとして受け入れられています。遺伝子改変マウスは、心筋細胞 '最終分化に非効率的で必要な遺伝子型を生成するために、複雑な心筋細胞の感染プロセスの必要性を排除する。高量と質の機能的心筋細胞の単離および培養は劇的に循環器病研究の利益と細胞シグナル伝達研究や薬剤開発のための重要なツールを提供します。ここでは、少しのトレーニングを実施することができる成体マウス心筋細胞の単離のための十分に確立された方法を記載する。マウスの心臓を摘出し、孤立した心臓のシステムにカニューレを挿入し、その後、カルシウムを含まない、高Pで灌流otassiumバッファは、ランゲンドルフ逆行灌流モードでのII型コラゲナーゼ消化した。このプロトコルは、遺伝子改変マウスの様々から機能成体マウスの心筋細胞の収集のための一貫性のある結果が得られます。

心筋細胞は、増殖性ではありません。 HL-1およびマウス心房腫瘍由来AT-1細胞のようないくつかの心房心筋細胞系があり、;しかし、研究のために利用可能な大人の心室の心筋細胞株は存在しない。成体マウスの心筋細胞の初代細胞培養は、細胞および分子レベルでの心臓研究のための強力なモデルを提供する。今日まで、これらは生化学的、生理学的、および薬理学的研究¹のために広く使用されてきた。さらに、遺伝子改変マウスを頻繁に使用すると、心筋細胞の単離の効果的な方法を必要としている。純粋培養では、内因性神経ホルモンやホルモン様因子^2,3を介するなどの他の臓器や体循環との相互作用から自由な条件を可能にします。しかし、心筋細胞の正常な絶縁が困難な場合があります。

我々はここに紹介するプロトコルは、成体ラットcardiomyocytと私たちの経験に基づいていますESとオコンネルら ^4,5に記載されている方法。特に2007 ⁵は、それらは、細胞培養および機能アッセイ緩衝液製剤からの詳細な技術を説明した。マウス筋細胞がラットの心筋細胞に比べて拘縮を非常に受けやすいので、マウスプロトコルでの灌流、消化、Ca ^{2 +}の寛容、メッキ、培養に用いるバッファまたはメディアは、非特異的な興奮収縮連関阻害剤、2を補足している彼らの自発収縮を阻害する3 - ブタンジオンモノオキシム（BDM）は、したがって生存棒状筋細胞の収量が有意に改善する。ここで紹介するプロトコルでは、筋細胞はII型コラゲナーゼを有する改変ランゲンドルフ灌流によって単離心臓から高カリウムバッファーで分離される。コラゲナーゼIIは、効果的に細胞間マトリックスを解放細胞を分解します。灌流液は、低レベル⁶で、細胞の代謝を維持します。 additi中で、ここで使用されるハーバード装置から分離した心臓システムは、正確な温度と一定の圧力制御⁷用にうまく設計されている。このアプローチは、非常に再現性製剤および心臓肥大アッセイのためのシグナル伝達タンパク質または2-3日培養を測定するための一晩培養に使用することができる単一の細胞型の均一な集団を提供する。

マウス上のすべての研究は手順や国立衛生研究所のガイドラインに従って行われていた、およびプロトコルは、トレド大学の制度的動物実験委員会、医学、生命科学大学によって承認された。

1。灌流システム準備

1. アイソ前日、速いアルカリ残留物のない洗剤の溶液で（貯水池を含む）全体の灌流系を埋める。ソリューションは、数時間または一晩のためにシステムに浸透することができます。
2. 翌朝、37℃のサーモサイクラーの温度を調整し、溶液を温めることができます。洗剤溶液を除去し、滅菌蒸留水で十分にシステムをフラッシュします。すべての側枝を忘れないでください。
3. 一定の蠕動ポンプを介して灌流液を使用してシステムを記入し、保護するためにサイドマウント注射器で大動脈室（気泡トラップ）から泡の空気を描く冠動脈閉塞の心。蠕動ポンプの流量は、日常的にチェックする必要があります。

2。バッファの調製、培養培地、食器

1. 灌流バッファー：使用前に1X潅流液の500ミリリットルを加えます。このカルシウムを含まないバッファーは113のNaCl、4.7のKCl、0.6mMのKH ₂ PO _4、0.6のNa ₂ HPO _4、1.2のMgSO _4、10のNa-HEPES、12mMの_炭酸水素ナトリウム、10 mMのKHCO _3、0.032が含まれています10mMのフェノールレッド、30mMのタウリン、10mMのBDM、および5.5 mMグルコース。 2 M HClでpHを7.0に調整し、0.2μmのフィルターで濾過し、4℃で保存
   注：a）は、灌流溶液は、それが使用されるのと同じ日に調製されるべきである。いくつかの場合においては、4℃で3日未満用溶液を保存するために許容可能であるB）このバッファは休止心筋細胞を維持することができます15.3 mmまでの高カリウム濃度の上昇を持って、ATP Cを減らすonsumptionおよびCa ^{2 +}トレラント能力を高める。
2. 消化緩衝液（300 U / mlの25〜50ミリリットル/ハート）：直前に灌流する準備をします。 II型コラゲナーゼの総活性の15,000 Uを量り、培養フード内の50ミリリットルの灌流液に溶解する。最終的なカルシウム濃度は50μMを作るために100のCaCl _2（原液を、濾過滅菌）の25を添加する。分離のための準備ができて37℃にバッファを温めます。トリプシンとは異なり、コラゲナーゼは、50〜100μMのCa ^{2 +}の存在下で最適に動作します。
3. 停止緩衝液（50ミリリットル/ハート）：培養フードで動作します。 5ミリリットルの滅菌FBSを灌流液の45ミリリットルを混ぜる。
   1. 私（12.5μMのCa ^{2 +）}のCa ^{2 +}ソリューション：停止緩衝液20mlに100 mMのCaCl _2を 2.5μLを加え、混合する。
   2. Ca ^{2 +}の溶液II（100μMのCa ^{2 +）：}ストップ緩衝液10mlに100のCaCl _210μlのを追加して混合する。
   3. Ca ^{2 +}のソリューションIII（400μMのCa ^{2 +}）：ストップ緩衝液10mlに100のCaCl ₂の40μl加え、混合する。
   4. Ca ^{2 +}のソリューションIV（900μMのCa ^{2 +）：}ストップ緩衝液10mlに100のCaCl ₂の90μl加え、混合する。
4. （50ミリリットル/ハート）培地をメッキ：BDM原液の転送培養フード中の滅菌50 mlのコニカルチューブに2 mMのL-グルタミンおよび1.26のCaCl _2を含むMEMの43ミリリットルとFBSの5ミリリットルを加え、1ミリリットルを（ 500 mMの、フィルター滅菌した）、および0.5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン（10,000 U / ml）を加えた。混合し、2％のCO _2、緩いキャップを37℃のインキュベーターに先立って、筋細胞の単離に2〜3時間平衡化させます。右筋メッキの前に、培地中に200 mMのATPの0.5ミリリットル（pHは7.2、原液を、滅菌フィルタ）を追加します。
5. 培養液（50ミリリットル/ハート）：転送培養フード中の滅菌50 mlのコニカルチューブに2 mMのL-グルタミンおよび1.26のCaCl _2を含むMEMの48ミリリットルとBDM原液（500 mMの、filteの1ミリリットルを追加r）を滅菌し、0.5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン（10,000 U / ml）を加えた。混合し、2％のCO _2、37℃インキュベーター前筋細胞の単離には平衡化させます。使用前に、培地中に100 mg / mlのBSA（濾過滅菌）の0.5ミリリットルを追加。
   注 ：2％CO ₂インキュベーターを使用するmyoctyesは24時間までそれらの棒状の形態を維持するのに役立つ6.9〜7.0で培養培地のpHを維持することが容易になる。
6. ラミニン（1〜2μgの/ cm ^2）をコーティングしたディッシュまたはプレート：転送1 mg / mlの自然なマウスラミニン200μlの滅菌PBSを20ミリリットルの（W / O、カルシウム、マグネシウム）と混ぜる。 、100 mmの皿に35-mmディッシュ、60mmの皿に2.5ミリリットル、または5ミリリットルに1ミリリットルを追加均等に表面を覆うように振る、と場所のCO ₂ 2％、37℃のインキュベーター筋メッキ時まで。
   注：皿又はプレートをコーティングした日に使用されていない場合は、パラフィルムで密封し、4℃で一晩（スローコーティング）で保存することができる。シールのrequです蒸発や汚染を防止するために赤外発光ダイオード。コー​​ティングされたプレートを、1週間まで4℃で保持することができる。

3。マウスハートの取り外しおよびカニューレ挿入

1. 30分間、70％エタノールではさみや鉗子を浸し、それらを乾燥させます。
2. 最寄りの0.1グラムにマウスを量る。その体重、系統、性別、生年月日を記録します。
3. 200μlのヘパリン（100 IU /マウス）冠状動脈の血液の凝固を防ぐために、従来の腹腔内麻酔を10分間注入する。 200ケタミンのmg / kg体重と腹腔内注射によるキシラジンの10 mg / kg体重でマウスを麻酔し、マウスは尾/つま先ピンチに応答を停止するまで、5〜10分間待ちます。
4. 優しく灌流システムに近い動物の手術トレーやテーブルベンチにpinnable作業面（ すなわち発泡スチロール）に前足と後足を固定して仰臥位でマウスを固定します。
5. 70％エタノールで胸と腹部を拭きます。正中皮Iを作る外科はさみで横隔膜半ば腹部からncision。
6. 別の外科はさみで横隔膜をカットし、湾曲した鋸歯状の鉗子で胸骨を保持します。両側性に切断して心臓を露出させ胸郭をretroflect。
7. 少し細かい曲線状の鋸歯状と非外傷性鉗子を用いて心臓を持ち上げて、背側胸壁にできるだけ近い胸腔から心を解剖。
8. 冷たい灌流バッファーを含む100 mmの皿に心を移します。慎重に、肺、胸腺、および気管支などの結合組織を切り取る。
9. 通常、胸腺および脂肪パッドによって隠されている大動脈とその頭蓋枝を識別します。心を持ち上げ、大動脈壁をつかみ、その最初の分岐¹³の下に大動脈を切断し、少し灌流液で満たされた大動脈カニューレ（フラット/鈍先端とノッチ1及び上記2ミリメートルと1.0ミリメートル外径のステンレス鋼カニューレにそれをスリップ2超精密チップFを使用するか、22 G、再利用可能な給餌針）の先端orceps。
   注：a）は、灌流液が冠状動脈に入るの気泡を防止するために、心臓の空洞中に滴下されるべきである; B）だけで大動脈弁の上にカニューレの先端を保管してください。
10. カニューレに大動脈をクランプし、6-0、手術絹糸でカニューレに大動脈を結紮。全体挿管未満120秒を取る必要があります。

4。心灌流し、消化

1. 、流出液が透明になるまで、50μMCaCl _2を含む消化緩衝液に切り替え、マウス系統に依存して3.5から20分間灌流4mL /分、約4-5分の流速で、カルシウムを含まない灌流緩衝液で心臓を灌流灌流圧とコラゲナーゼ活性。該当する場合は、消化する際、70〜80 mmHgのに大動脈圧力を高める。必要に応じて、酵素消化のために灌流液が再循環させることができる。典型的には、300 U / mlの酵素緩衝液を4ml /分の流速で10〜12分間で心を消化する;70 mmHgの圧力で後負荷を印加した場合、300 U / mlのを4ml /分の流速でのみ3.5-5.5分かかります。
2. 心が少し薄いと弛緩性になったときに消化を停止します。優しく挟まれたときには、スポンジ状にする必要があります。

5。細胞解離とカルシウムの再導入

1. 70％エタノールに浸漬した鉗子を用いてカニューレから大動​​脈を引き、2.5ミリリットル消化緩衝液を含む滅菌60 mmの皿に心を置く。このための滅菌技術とフォローアップの手順に留意滞在し、滅菌した消耗品を使用して培養フードに移動します。
2. 細かい外科ハサミで大動脈、心房、および大血管を削除します。優しく2先の細いピンセットで10月12日小さな断片に心室をいじめる。
3. 静かに10mlのホールピペットで10倍〜上下に心片や細胞をピペットして、15 mlのポリプロピレン製コニカルチューブに移す。私は12.5μMのCaCl _2、転送を7.5ミリリットル含むカルシウム溶液で、皿をすすぐこのチューブに、10mlの最終体積になる。
4. 穏やかに上昇し、心臓組織の大きな断片を分散させるために先の細いトランスファーピペットを用いて上下細胞懸濁液をピペット。
5. そして、このような内皮細胞や線維芽細胞などの小さな非筋細胞を分離する20×gで3分間遠心する。
6. 200のATP（pHは7.2、原液を、濾過滅菌）を100μlのサプリメントを吸引し、上清を切り、10ミリリットルカルシウム溶液に筋細胞ペレットを再懸濁し、私は。 3〜5分間フード内チューブを残す。
7. 転送は、棒状の丸い筋細胞をカウントする血球計に10μLずつを複製します。筋細胞の合計数を計算し、棒状の筋細胞のパーセンテージを計算する。
8. 20×gで3分間の筋細胞を遠心分離する。上清を除去し、100μMのCaCl _2を含む10ミリリットルカルシウム溶液IIにペレットを懸濁します。ピペッティングして精密チップ転送ピペットで筋細胞を分散させる上下に。
9. それぞれ、カルシウム溶液III（400μMの_塩化カルシウム）およびIV（900μMのCaCl _2）を使用して、上記のステップ（5.8）を繰り返します。
10. マウスの筋細胞初代培養用の培地をメッキ5mlに最終的な筋細胞ペレットを再懸濁します。筋細胞の総数をカウントし、棒状の筋細胞の割合を計算します。

6。細胞培養

1. 50 mlチューブ25,000棒状筋細胞/ mlになるように、棒状筋細胞の濃度を調整する。優しくそれらをよく中断し、10 mlのピ​​ペットを用いて心筋細胞をピペット。各皿またはプレートのための同等の細胞密度を確保するために、ピペット、チューブに細胞沈降を避ける。
2. ラミニンコーティング液を吸引除去した後、それらの皿またはプレートに筋細胞をプレート。そっと培養フードの表面に皿またはプレートを前後や左右に十字状のパターンでの3〜4倍にスライドさせます。
3. 2％のCO中皿またはプレートを配置37℃で₂インキュベーター約80％の割合で筋細胞の付着を可能にするために1-3時間インキュベートする。
4. 付着した後、穏やかに取り付けられていない筋細胞および細胞破片を含有する培地を吸引する。静かに皿またはプレートの側面に培養液を追加します。 1で、この培地交換のいずれかを実行します。すぐにインキュベーターに皿またはプレートを返す。
5. O / N培養した後、筋細胞は、短期細胞シグナル伝達の研究の前に、BDMない同じ培地に変更することができる。肥厚性またはアポトーシスアッセイのために、長期培養でBDMを保つ。
   注 ：BDM（2,3 -ブタンジオンモノオキシム）は、ミオシンATPアーゼを阻害し、収縮を防止することができる。ミオシンベースの収縮の阻害は容易に可逆的である。なお、BDMは、例えば、非特異的ホスファターゼとして作用SRからのカルシウム放出を増加させること、および遊離カルシウム濃度および細胞の電気プロペンの変化など、いくつかの潜在的な副作用を有し得ることが報告されているrtiesので、治療の前に、BDMを削除する必要があります。また、場合によっては、特定のミオシンII阻害ブレビスタチンは心筋細胞の収縮^8,9を阻害するための代替薬である可能性があります。しかし、私たちの例では、BDMは心筋細胞の質と量のためブレビスタチンよりも優れています。

1。成功絶縁定量

二つの基準は、分離の成功を定量するために使用されている：第一に、単離され、そして第二の心筋細胞の総数は、ロッド状のカルシウム耐性の割合は非耐性筋細胞を丸める。一般的に、このプロトコルは、1成体マウスの心臓から心筋細胞メッキや利回りに心臓の除去から（収穫総筋細胞70〜90％）の約100万棒状の心筋細胞の周りに75〜90分かかります。これは、マウスの体重および歪みによって変化し得る。典型的には、0.7〜1.0百万棒状の筋細胞は、〜25gのC57BL/6Jマウスから収集することができる、〜35グラムブラックスイスマウスから1.2から1600000棒状筋細胞、および0.7から1200000棒状筋缶〜30グラムのNa / K-ATPアーゼのヘテロ接合^{（α1、S / R）10}または〜22グラム心臓特異的NCX-KOマウス¹¹から収集する。単離された筋細胞は、通常、長方形の端部と透明なクロス細溝を有する別個のロッド形状を有している図1に示す。

2。細胞の機能識別

我々の以前のデータは、培養新生児ラット心筋細胞において、100μMウアバインは、PI ₃ K依存性Aktリン酸化を活性化し、肥大^12を誘導できることが示されている。さらに、成体マウス心筋細胞におけるこれらの結果を確認するために、成体C57BL/6Jマウスの心筋細胞を培養し、ウアバインで処理した図2及び図3は、明らかにウアバインが用量依存的にAktのリン酸化を増加させ^、[3 H] -ロイシン取り込みを誘導できることを示してタンパク質合成の間。

図1。ブラックスイスマウスからの正常な棒状の心筋細胞を一晩後培養。筋細胞は、フォトソフトウェアを用いた位相差顕微鏡下で写真撮影した。

図2。培養された大人のC57BL/6Jマウスの心筋細胞におけるウアバインによるAktの活性化。筋細胞を5分間0〜50μMのウアバインに曝露し、そして溶解物をウエスタンによってリン酸化（セリン^473）のAkt（P-Aktの）およびAktについてアッセイしたブロット。活性化は、全Aktた（n = 5-10）に、リン酸化の比率として定量した。 * P <制御対0.05、** P <0.01対コントロール。

図3。Ouabainが4時間の血清欠乏の後、筋細胞と共にウアバイン又は100nM ET-1（陽性対照）の存在下または非存在下^の[3 H]で示した条件で処理した培養された成体C57BL/6Jマウスの心筋細胞におけるタンパク質合成を刺激する- 12時間ロイシン（1μCiの個/ ml）。細胞溶解物を、5％TCAで沈殿させ、0.2 M NaOH/0.1％SDS中に再懸濁し、そして放射能をシンチレーションカウンターで計数した。サンプルあたりのタンパク質合成は、コントロールと比較したcpm / mgタンパク質へと正規化された計算された。

成体マウスの心筋細胞の分離については、表1。ソリューション/バッファ。

表2。成体マウスの心筋細胞の単離および培養原液の調製および保存。

最高の準備のために、最も重要なステップは次のとおりです。1）速やかに切除した後にカニューレにマウス心臓をフック。 2）適切な心臓灌流。また、その水質、潅流温度、緩衝液のpH、滅菌、化学的純度、クリーン、非汚染されたチューブに注意し、室内も重要な要素である。 18.2mΩの分子生物学グレードのH ₂ Oが非常にバッファの準備をお勧めします。 200のATP原液のpHは7.2、見逃しやすいステップに調整する必要があります。

それはすぐに大動脈を識別し、フリン¹³で示すように、ちょうどその最初の分岐の下にカットすることが不可欠である。効率的なフックアップのため、ノッチ、小さな鋸歯クロスクランプで適切な大きさのステンレス製のカニューレを推奨します。連結後、カニューレの先端は、コラゲナーゼが完全に冠循環中に心臓組織との対話を支援するために、大動脈弁を超えるべきである。時々、細胞収率は、最初は大そうですしかし、多くの細胞がカルシウム寛容工程の後にラウンド形状である。一つの説明は、血管内の凝固した血液が完全に不十分な消化をもたらす心臓から除去されないことである。別の可能性は、心臓の消化の上にある。コラゲナーゼへの長期暴露は、筋細胞のカルシウムトレランス^2を削減^します。解離およびカルシウム再導入中は、筋細胞の生存率を維持するためにできるだけ穏やか心筋細胞を処理することも重要である。

要約すると、遺伝子改変マウスから、成人の心筋細胞培養物は、心臓の研究のための強力なツールです。結果を解釈するが、今後の課題を念頭に置いて、人間とげっ歯類の間の遺伝的差異を維持する必要があります。

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

この作品は、国立心肺血液研究所助成HL-36573によってサポートされていました。我々は、この原稿を編集するためのデービッド·ゾーヴァに感謝します。