隔离成年小鼠心肌细胞的细胞信号传导和文化及

我们描述了成年小鼠心肌细胞分离的可靠方法。该协议得到了一致的结果为从各种转基因小鼠的功能成年心肌文化。

技术进步已经使转基因小鼠，包括转基因和基因敲除小鼠，在许多研究领域必不可少的工具。成人的心肌细胞被广泛接受为一个很好的模式心脏细胞生理学与病理生理学，以及医药干预。转基因小鼠排除需要复杂的心肌细胞的感染过程，以产生期望的基因型，这是低效的，由于心肌细胞"终末分化。隔离的高数量和质量心肌功能和文化将极大地有利于心血管疾病的研究，并为细胞信号转导研究和药物开发的重要工具。在这里，我们描述的，可以用很少的培训来实现成年小鼠心肌细胞分离一套行之有效的方法。小鼠心脏被切除，插管到离体心脏系统，然后用无钙及高磷灌注otassium缓冲其次是Ⅱ型胶原酶消化的Langendorff逆行灌注模式。这个协议产生一致的结果为功能性成年小鼠心肌细胞来自各种转基因小鼠的集合。

心肌细胞不增殖。也有一些心房心肌细胞系，如HL-1和AT-1细胞从小鼠心房肿瘤衍生的;然而，没有成年心室的心肌细胞可用于研究线。成年小鼠心肌细胞的原代细胞培养提供了强大的模型心脏研究在细胞和分子水平。迄今为止，它们已被广泛用于生化，生理和药理学研究^1。此外，频繁使用转基因小鼠的必要了心肌细胞的分离有效的方法。纯培养允许无相互作用与其他器官的条件和全身循环，例如通过内源性神经激素和激素样因子^2,3。然而，心肌细胞的成功分离是具有挑战性的。

我们这里介绍的协议是基于我们与成年大鼠cardiomyocyt经验ES和O'Connell 等人 ^4,5中记载的方法。尤其是在2007年^5，他们描述了从缓冲准备详细的技术，细胞培养和功能测定。自小鼠细胞极易受到挛缩相比，大鼠心肌细胞中，用于灌注，消化，Ca ^{2 +}的耐受性，电镀和培养的小鼠协议的缓冲器或介质补充有非特异性兴奋-收缩偶联酶抑制剂，2， 3 - 丁二酮肟（BDM），以抑制其自发性收缩，因而生存能力和杆状细胞产量显著提高。在这里介绍的协议中，肌细胞是由改性的Langendorff灌注的II型胶原酶分离在从分离的心脏较高的钾缓冲液中。 Ⅱ型胶原酶有效地打破了细胞间基质，并释放细胞。该灌注溶液也保持细胞的新陈代谢处于较低水平^6。在additi上，来自哈佛仪器，我们这里使用的离体心脏系统是精心设计的精确的温度和恒压控制^7。这种方法提供了高度可重复的制剂和单一的细胞类型，这可用于在培养过夜，用于测量信号蛋白或2-3天培养心肌肥厚测定的均一群体。

对小鼠的研究都按照程序，美国国立卫生研究院的指导方针进行，而协议已获托莱多大学的机构动物护理和使用委员会，医学与生命科学学院。

1，灌注系统准备

1. 隔离的前一天，填充整个灌注系统（包括水库）用快速碱性无残留洗涤剂的溶液。让溶液浸泡到系统中的几个小时或过夜。
2. 第二天早上，调节热循环温度至37℃，并让溶液升温。除去洗涤剂溶液并彻底用灭菌蒸馏水冲洗系统。不要忘了所有的偏科。
3. 通过恒蠕动泵填补了系统灌注缓冲液，绘制气泡从主动脉腔（气泡陷阱）与侧置式注射器保护在心脏冠状动脉闭塞。蠕动泵的流量应定期检查。

2，缓冲溶液之制备，文化传媒，和菜

1. 灌注缓冲液:请在使用前500毫升的1X灌注缓冲。此无钙缓冲液含有113 mM氯化钠，4.7 mM的氯化钾，0.6mM的KH ₂ PO _4，0.6毫米的Na ₂ HPO _4，1.2 mM的MgSO ₄干燥，10毫钠HEPES，12mM的_碳酸氢钠 ，10mM的KHCO _3，0.032毫酚红，30 mM的牛磺酸，10毫米的BDM，和5.5毫米的葡萄糖。将pH调节至7.0，用2M HCl和通过0.2微米的过滤器，过滤存储在4℃下
   注意:a）本灌注溶液应准备在同一天使用时。在某些情况下，它是可以接受的，以存储少于3天的溶液在4℃下B）这个缓冲区具有较高的钾浓度达15.3毫米，这可以保持心肌细胞静止期，减少ATP的Ç【消耗和增加的Ca ^{2 +}的容错能力。
2. 消化缓冲液（300单位/毫升，25〜50毫升/心脏）:准备之前，为了灌注。称取II型胶原酶的总活性为15,000 U，溶解在培养罩50毫升灌注缓冲。加入25微升100毫米氯化钙_2（原液，过滤消毒）做最后的钙浓度为50微米。暖缓冲到37℃时准备好隔离。不像胰蛋白酶，胶原酶工作在50-100微米的Ca ^{2 +}的存在下最好。
3. 终止缓冲液（50毫升/心脏）:操作中培养罩。混合45毫升的灌注缓冲液用5ml无菌胎牛血清。
   1. Ca ^{2 +}的溶液I（12.5微米的Ca ^{2 +）:}加入2.5微升100mM氯化钙_2〜20的停止缓冲液，混匀。
   2. Ca ^{2 +}的溶液II（100μM的Ca ^{2 +）:}添加10微升100mM的CaCl ₂至10ml的终止缓冲液，混匀。
   3. Ca ^{2 +}的溶液III（400μMCa ^{2 +}的）:加入40μl100毫米氯化钙_2〜10毫升挡车器，混匀。
   4. Ca ^{2 +}的溶液IV（900μM的Ca ^{2 +）:}添加90微升100mM的CaCl ₂至10ml的终止缓冲液，混匀。
4. 电镀液（50毫升/心脏）:传输43毫升MEM中含有2mM L-谷氨酰胺和1.26毫米氯化钙₂到无菌的50毫升锥形管中培养罩和加入5 ml的FBS，1毫升的BDM原液（ 500 mM时，过滤器灭菌）和0.5 ml青霉素/链霉素（10,000 U /毫升）。混合和2％的CO _2，37℃培养箱松瓶盖平衡2-3小时前，心肌细胞隔离。右肌细胞电镀之前，加入0.5毫升200毫摩尔ATP（pH值7.2，料液，过滤灭菌）到培养基中。
5. 培养基（50毫升/心脏）:传输48毫升含有2mM L-谷氨酰胺和1.26毫米氯化钙₂到无菌的50毫升锥形管中培养罩MEM中并加入1毫升BDM储备溶液（500 mM时，过滤接ř消毒），和0.5 ml青霉素/链霉素（10,000单位/毫升）。混合和平衡在2％的CO _2，37℃培养箱前肌细胞隔离。在使用之前，加入0.5毫升100毫克/毫升BSA（过滤灭菌的）到培养基中。
   注意 :使用2％CO ₂培养箱中有利于维持培养基的pH在6.9-7.0，这有助于myoctyes保持它们的棒状形态长达24小时。
6. 层粘连蛋白（1-2微克/厘米^2） -包被的培养皿或板:传输200微升的1毫克/毫升的天然小鼠层粘连蛋白20的灭菌PBS（W / O型钙和镁）的溶液并混合。加入1 ml至35毫米的菜肴，2.5毫升到60毫米的菜肴，或5毫升到100毫米的菜，摇到均匀覆盖面，并将其放置在2％的CO _2，37℃培养箱中培养，直到肌细胞电镀。
   注意:如果菜肴或板不是在天涂覆使用，它们可以被用石蜡膜密封并储存于4℃过夜（慢涂层）。密封是热曲IRED以防止蒸发和污染。涂层板可保持在4℃下长达1周。

3，小鼠心脏拆卸和插管

1. 浸泡剪刀和镊子在70％乙醇浸泡30分钟，让他们干。
2. 权衡鼠标到0.1克。记录其体重，品系，性别和出生日期。
3. 注入200μL肝素（100 IU /鼠标）IP 10分钟前麻醉，防止血液凝固的冠状动脉。麻醉小鼠200毫克氯胺酮/ kg体重和10毫克/公斤体重甲苯噻嗪腹腔注射，等待5-10分钟，直至鼠标停止响应的尾巴/脚趾捏。
4. 轻轻固定的前爪和后爪的pinnable工作表面（ 即发泡胶）在动物手术托盘或桌子板凳附近灌注系统确保鼠标在仰卧位。
5. 擦拭胸部和腹部，用70％的乙醇。做中线的皮肤我ncision从中间腹部有手术剪刀隔膜。
6. 切割膜片与另一手术剪刀按住胸骨弧形锯齿钳。削减双边和retroflect胸廓暴露心脏。
7. 提起心脏稍微用弯曲细小锯齿和无创伤钳和解剖的心脏出了胸腔尽可能靠近背侧胸壁。
8. 在心脏转移至有冷灌注缓冲液100毫米的菜。精心修剪掉的结缔组织，如肺，胸腺和支气管。
9. 识别主动脉及其分支颅，通常隐藏在胸腺和脂肪垫。切开主动脉低于其首支^13，抓住主动脉壁，解除心脏，稍微滑了到灌注液填充主动脉插管（1.0毫米外径不锈钢套管用钝/平头和凹口1到2毫米以上使用两个超精细尖F或a 22政可重复使用的喂食针）;尖orceps。
   注意:a）本灌注流体应当心脏插管过程中滴落，以防止气泡进入冠状动脉; b）不断插管的尖端正上方的主动脉瓣。
10. 夹住主动脉插管并结扎主动脉插管用6-0手术丝。整个插管时间不超过120秒。

4，心脏灌注和消化

1. 用无钙灌注缓冲液灌注心脏在4毫升的流速/分钟约4-5分钟，直到流出物变得清晰，然后切换到含有50微米_氯化钙消化缓冲液和灌注的3.5-20分钟根据小鼠品系，灌注压和胶原酶活性。如果适用，当消化增加的主动脉压力70-80毫米汞柱。必要时，酶灌流液可以循环进行消化。通常情况下，300 U / ml的酶缓冲液将在4毫升/分钟的流量在10〜12分钟消化心脏;如果施加负荷压力在70毫米汞柱，300 U / ml的将仅3.5-5.5分钟以4毫升/分钟的流速。
2. 终止消化时，心脏变得略显苍白和松弛。它应该是海绵状时，轻轻挤压。

5，细胞分离和重新引入钙

1. 从插管用70％乙醇浸泡的钳子拉主动脉，并把心脏成含有2.5毫升消化缓冲液中的无菌的60毫米培养皿中。搬入培养罩采用无菌物品供应，保持留意无菌技术，这和后续步骤。
2. 移除主动脉，心房和大血管细手术剪。轻轻挑逗心室成10-12小块，用两个细尖镊子。
3. 轻轻吸取的心脏碎片和细胞上下〜10倍与10毫升的移液管，然后转移到一个15毫升的聚丙烯锥形管。涮菜用口含12.5微米_氯化钙和转让7.5毫升钙溶液这个进入管，从而导致10毫升的最终体积。
4. 轻轻吸取细胞悬液上下用细尖移液管驱散大块的心脏组织。
5. 然后离心3分钟，以20×g离心以分离出小的非心肌细胞的细胞，如内皮细胞和成纤维细胞。
6. 吸上清，重悬肌细胞沉淀在10毫升钙的解决方案，我用100微升200毫摩尔ATP（pH值7.2，储备液，过滤除菌）的补充。离开该管在通风橱中3-5分钟。
7. 传输重复10微升等分至血细胞计数器计数杆状和圆细胞。计算细胞总数，并计算棒状细胞的百分比。
8. 离心细胞为3分钟，在20×g下。除去上清，悬浮颗粒在10毫升钙溶液II含有100微米_氯化钙 。吹打分散的细尖移液管的细胞向上和向下。
9. 分别用钙溶液III（400微米_氯化钙 ）和IV（900微米_氯化钙 ），重复上述步骤（5.8）。
10. 对于小鼠心肌细胞原代培养，悬浮最终心肌细胞沉淀在5毫升电镀液中。计数细胞总数和计算的杆状细​​胞的百分比。

6。细胞培养

1. 调整的杆状细胞浓度至25000杆状细胞/ 50-ml管毫升。使用10毫升吸管暂停他们也轻轻吸取的细胞。避免在移液管和管细胞沉淀，以确保平等的细胞密度为每道菜或板。
2. 吸了层粘连蛋白涂层溶液后，将镀成肌细胞的菜肴或板。轻轻滑动培养罩的表面上的碗碟或板向前和向后和侧到侧的十字图案的三到四倍。
3. 放置碗碟或板在2％二氧化碳₂培养箱中在37℃下孵育1-3小时，以允许肌细胞附着在约80％的速度。
4. 附件后，轻轻吸了含有独立的细胞和细胞碎片的媒介。轻轻培养基加到菜肴或板的两侧。由一个执行这种媒介的变化之一。立即返回菜肴或板的孵化器。
5. O / N培养后，细胞可改为短期细胞信号转导的研究之前，在相同的培养基无BDM。保持在BDM长期培养的肥大或凋亡检测。
   注 :BDM（2,3 -丁二酮肟）能抑制肌球蛋白ATP酶活性，防止收缩。其抑制肌球蛋白为基础的收缩是可逆的。据报道，BDM可能有一些潜在的副作用，如作为一种非特异性磷酸酶，从SR增加钙释放，并改变游离钙离子浓度和蜂窝电PROPE的rties，所以治疗前，BDM应该被删除。此外，在某些情况下，一个特定的肌球蛋白II抑制剂II型肌球蛋白可以是一种替代药物，抑制心肌收缩^8,9。然而，在我们的情况下，BDM比II型肌球蛋白更好地为求心肌细胞的质量和数量。

1，成功的定量分离

两个标准用于定量隔离的成功:首先，心肌细胞的分离的总数，和第二，杆状耐钙圆非容错肌细胞的比率。通常这个协议需要大约75-90分钟从心脏切除到心肌细胞电镀和从一个成年小鼠心脏的产量大约100万杆状心肌（共收获细胞70-90％）。这可能与小鼠体重和应变而变化。通常情况下，0.7-1.0万元杆状细胞可以从〜25克C57BL/6J小鼠，从〜35克黑瑞鼠标1.2-1.6万元杆状细胞和0.7-1.2万元杆状细胞收集能从一个约30克Na / K-ATP酶杂合子^{（α1S / R）}或^10〜22克心脏特异性NCX-KO小鼠¹¹收集。离体心肌细胞通常有一个明显的棒状矩形两端和清晰横纹，如图1所示。

2。细胞功能鉴定

我们以前的数据已清楚地表明，在培养的乳鼠心肌细胞，100微米哇巴因可激活PI ₃ K依赖Akt的磷酸化，诱导肥大^12。为了进一步证实这些结果在成年小鼠心肌细胞，成年C57BL/6J小鼠的心肌细胞进行培养和乌本苷处理。 图2和图3清楚地表明，哇巴因可提高Akt的磷酸化的剂量依赖性方式，诱导^的[3 H] -亮氨酸掺入中蛋白质的合成。

图1:从黑色瑞士小鼠正常杆状心肌细胞后过夜文化。肌细胞是用图片处理软件相衬显微镜下拍摄。

哇巴因在培养的成年C57BL/6J小鼠心肌图2。激活Akt的。肌细胞暴露于0-50μM哇巴因5分钟，并裂解物测定磷酸化（Ser ⁴⁷³上）的Akt（磷酸化Akt）和Akt蛋白通过Western印迹。激活被量化为磷酸化至总Akt比（n = 5-10）。 * P <0.05与对照组比较，** P <0.01与对照。

图3。OuabaiÑ ​​刺激蛋白质合成中培养的成年C57BL/6J小鼠的心肌细胞后4小时血清剥夺，肌细胞与哇巴因或100nM的ET-1（阳性对照）的存在或不存在与^[3 H]所指示的条件下进行处理。 -亮氨酸（1微居里/毫升）12小时。细胞裂解液中沉淀，用5％三氯乙酸，并重新悬浮于0.2M NaOH/0.1％SDS，和放射性用闪烁计数器计数。每个样品的蛋白质的合成计算为CPM / mg蛋白和归一化相比，控制。

表1。方案/缓冲器成年小鼠心肌细胞分离。

表2。股票溶液的配制和贮存成年小鼠心肌细胞的分离和培养。

为了获得最佳的准备，最关键的步骤是:1）及时小鼠心脏挂接到切除后的套管; 2）适当的心脏灌注。另外，还要注意水的质量，灌注温度，pH缓冲液，消毒，化学纯度和洁净，无污染管和室也是重要因素。 18.2MΩ分子生物学级H _{2 O}的强烈建议缓冲液配制。 200毫摩尔ATP储备溶液的pH值应调整到7.2，这是很容易错过的工序。

关键是要迅速查明主动脉和削减略低于公司第一分公司如由弗林^13。为有效钩取，适宜尺寸的不锈钢套管与槽口和小锯齿状交叉夹紧建议。结扎后，插管的尖端应高于主动脉瓣，以帮助心脏组织冠脉循环过程中胶原酶充分互动。有时，细胞产量大，似乎开始但许多细胞是圆形的钙宽容步骤之后。一种解释是凝固的血液在血管可能无法完全从心脏，导致消化不充分去除。另一种可能性是在心脏的消化。长时间暴露于胶原酶降低心肌细胞钙耐受性^2。中的解离和重新引入钙，这也很重要，以处理心肌尽量轻柔以维持心肌细胞的生存能力。

综上所述，从转基因小鼠成年心肌文化是一个强大的工具，用于心脏病研究。然而，今后的工作应解释结果时牢记人类和啮齿动物之间的遗传差异。

作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。

这项工作是由国家心脏，肺和血液研究所资助的HL-36573的支持。我们感谢大卫·索瓦先生编辑这篇稿子。