遺伝的誘導との頭部の複合体における良性および浸潤性腫瘍の可視化のためのプロトコル

RAS ^V12と走り書き 、腫瘍細胞はまた、侵襲性の挙動を表示するショウジョウバエにおける腫瘍増殖をもたらす様細胞極性遺伝子の突然変異のような活性化癌遺伝子間の協力。ここに良性および浸潤性腫瘍の誘導および観察のための単純なプロトコルが提示される。

ショウジョウバエは、過去数十年の間、通常の開発や病気の遺伝的基礎の理解を照らしており、今日では、複雑な疾患^1-7の我々の理解に非常に貢献し続けています。転移性の状態に良性の腫瘍の進行は、複雑なイベント⁸で、私たちはより良いこの病気⁹の遺伝的基礎を理解するために、ショウジョウバエでモデル化されています。ここで私は、遺伝的に誘導し、観察した後、 ショウジョウバエの幼虫の腫瘍の進行を分析するための単純なプロトコルを提示する。腫瘍誘発技術はMARCMシステム¹⁰に基づいており、活性化癌遺伝子、Rasの^V12及び細胞極性遺伝子の損失（ 落書き 、 ディスク大きく 、 致死巨大幼虫 ）浸潤性腫瘍^9を生成する間の連携を利用している。私は、これらの腫瘍は完全な幼虫で可視化することができる方法を紹介し、次に、どのようにこれらは、さらなる分析のために切開することができます。ここで紹介する単純化したプロトコルにより、この技術は腫瘍の浸潤における遺伝子の役割を理解することに興味の研究者によって利用されるのを確認する必要があります。

転移性の状態に良性の腫瘍の進行は、本体⁸に存在する防御機構の回避することを特徴とする段階的なプロセスです。例えば、体内の腫瘍細胞は、アポトーシスや免疫システムを回避する基底膜と呼ばれる特殊な細胞外マトリックス（ECM）を突破し、周囲の細胞⁸が課す社会的コントロールを克服できなければなりません。これは、がん細胞が転移と呼ばれるプロセスでの遠隔部位に移行し、コロニーを形成する能力を獲得という段階的進行を介して行われます。腫瘍細胞は、体によって課さ障壁を克服する方法についての我々の理解は、しかし、研究から出てくる写真は、癌細胞による正常な発生過程およびシグナル伝達経路の繰り返し使用^11月13日にこれまでのポイントを行って、まだ始まったばかりである。

フルーツ飛ぶキイロショウジョウバエは、私たちのウントに途方もなく貢献してきました過去数十年の^14〜17にわたって開発、洗練された遺伝学的技術を用いて正常な発達と病気のerstanding。我々は、様々な癌遺伝子および癌抑制遺伝子^18〜22歳のより良い理解に到達した突然変異誘発および過剰発現のツールを使用して。しかしながら、腫瘍転移は、細胞培養モデル^23,24ならびに種々の異種移植モデル^25-27主に研究されているいくつかの遺伝子病変間の協力の結果である。それらは完全に生体に見られる条件を模倣しないように、これらのモデルは、強力なしかし、それらの限界がある。さらに、マウスでの利用可能なトランスジェニックモデルが面倒で、侵襲性行動^28,29の遺伝子解析に資するものではない。いくつかの研究は、ショウジョウバエ ^30,31における腫瘍細胞の浸潤を理解しようと試みてきた。これらの技術は、主にホストに原発性腫瘍の移植を利用して、TRAの追跡に依存している隣接組織^32,33の侵入のために腫瘍をnsplanted。 MARCM ¹⁰と呼ばれる強力な技術は、ショウジョウバエ ⁹に腫瘍の浸潤をモデル化するためにPagliariniと徐により適応されました。腫瘍の浸潤のエレガントな遺伝的モデル化は、活性化癌遺伝子や細胞極性の喪失との連携を悪用。このモデル化のパワーは浸潤性腫瘍は、したがって組織の移植のための必要性を回避無傷の生物に作成されるという事実にある。発癌の協力をもたらすために、Rasの^V12のような活性化癌遺伝子は、幼虫の目を触角にある細胞のクローンで表されます。 MARCM技術の結果、これらのクローンはまた、簡単に視覚化のために、緑色蛍光タンパク質（GFP）が付いていますし、細胞極性の走り書き致死巨大な幼虫のような変異体、および大規模なディスクのためにホモ接合作られています。結果がで浸潤性の腫瘍を、GFPをタグ付けされている頭部複雑。本報告では、私誘導し、無傷の幼虫のコンテキストでかつ摘出頭部複合体の両方で、これらの浸潤性腫瘍を可視化する方法を示します。ここで紹介する腫瘍誘導はショウジョウバエの第二の染色体上の試薬 ​​を利用しています。 表2には、私は同じ目的のために利用することができ、Xおよび^第 3染色体上の株式のリストを提供する。私はこの単純化されたプロトコルは、腫瘍の進行の分子基盤を理解することに興味を持って研究者にこの技術は容易にアクセスできるようにと考えています。

1。良性非浸潤性腫瘍の誘導

1. 良性腫瘍の誘導のために、表2にリストされている銘柄を使用してください。
2. 以下の遺伝子型の「テスター」の株式のためのスターター培養を準備します。浴槽-GAL80、FRT40A、Y、EY-FLP1、W Act5C> Y +>のGal4、UAS-GFP
3. 以下の遺伝子型の「テスト」の株式のためのスターター培養を準備します。W; FRT40A、UAS-Rasの^V12 / CYO
4. 「テスト」在庫から「テスター」株式と10人の男性から10女性の処女を収集します。
5. フライ食品とバイアルの両方を配置することで、「テスター」と「​​テスト」の在庫からオスとメスを渡ります。
6. 25℃のインキュベーターにクロスを置き、男性と女性が交尾し、24〜48時間のために卵を産むことができます。
7. 十分な卵の堆積のためと第齢幼虫は文化が乾燥していないことを確認しての存在のためにバイアルをご確認ください。
   1. オートクレーブ処理を数滴を追加します。（文化は乾燥されている場合）には湿った保つために培養液に蒸留水を。
   2. 文化を監視し、必要に応じてステップ1.7.1を繰り返し続けています。
8. セクション3で概説したように、蛍光実体顕微鏡下に3齢幼虫をさまよう観察します。

2。浸潤性腫瘍の誘発

1. 浸潤性腫瘍の誘導のために、表2にリストされている銘柄を使用してください。
2. 以下の遺伝子型の上記のステップ1.2からスターターカルチャーを使用し、Y EY-FLP1、W、浴槽-GAL80、FRT40A; Act5C> Y +>のGal4、UAS-GFP
3. LGL ^{4、FRT40A、UAS-Ras}の^V12 / CYO、W：以下の遺伝子型の「テスト」の株式のためのスターター培養液を準備します
4. 「テスト」在庫から「テスター」株式と10人の男性から10女性の処女を収集します。
5. フライFとバイアル中で、それらの両方を配置することによって、「テスター」と「​​テスト」の在庫から男性と女性を渡るOOD。
6. 25℃のインキュベーターにクロスを置き、男性と女性が交尾し、24〜48時間のために卵を産むことができます。
7. 十分な卵の堆積のためと第齢幼虫は文化が乾燥していないことを確認しての存在のためにバイアルをご確認ください。
   1. （文化は乾燥されている場合）には湿った保つために培養するためにオートクレーブし、蒸留水を数滴を追加します。
   2. 乾きのために文化の監視を続け、必要に応じてステップ2.7.1を繰り返します。
8. セクション3で概説したように、蛍光実体顕微鏡下に3齢幼虫を観察します。

3。良性および浸潤性腫瘍の観察

1. 良性腫瘍の分離と可視化のための3齢幼虫を使用してください。
   1. 蒸留水にペイントブラシを濡らし、そしてこのペイントブラシを使用して培養バイアルの壁から数3齢幼虫をこすり。
   2. 1X PBSでうつ病スライドに幼虫を置き、ウェットペイントブラシスクラップを使用する幼虫表皮から任意の食品材料を切っメール。
   3. ペトリ皿に幼虫を置き、幼虫を固定化するために30分間-20℃の冷凍庫に出発。
      1. FLYNAPを使用して幼虫を固定する別の方法。
      2. 3.1.3.2からバイアルにFLYNAPに浸しFLYNAPの杖を置き、幼虫を、バイアルのlet差し込まバイアルを接続した後に30から40分間放置。
   4. カバーガラスで覆い、緑色蛍光タンパク質（GFP）を可視化する機能を備えた蛍光実体顕微鏡下で観察し、光ハロカーボン油の滴を追加し、スライドガラス上に固定化された幼虫を置きます。
   5. 良性腫瘍を有する幼虫は頭部複合体が存在する前方領域に緑色の蛍光を発する。
2. 浸潤性腫瘍の観察のため、上記のステップ＃2の培養セットから（誘導後）10日目の幼虫を選択します。浸潤性腫瘍を有する幼虫拡張リットルを持っているので、10日目に幼虫が選択される一般アルバルステージとpupariateに失敗します。
3. 代わりに3齢幼虫利用日10幼虫のを除いて3.1.4にステップ3.1.1に従ってください。
   1. 10日目浸潤性腫瘍を有する幼虫は頭部複合体が存在する前方領域に緑色の蛍光を発する。
4. 蛍光顕微鏡デジタルカメラが装備されている場合は、蛍光良性および浸潤性腫瘍を有する幼虫の写真を撮る。

4。良性および浸潤性腫瘍の頭部のコンプレックスとさらなる観察の解剖

幼虫の半透明の表皮が困難腫瘍の浸潤の程度を観察することができる。このように侵入の程度は良く幼虫から頭部の複雑な解剖により可視化されている。次の手順では、頭部の複合体を解剖するのに利用されるべきである。

1. 湿ったペイントブラシを使用して（良性腫瘍のための）3齢幼虫を選択し、（浸潤性腫瘍の場合）10日目の幼虫Fそれぞれの培養バイアルをROMを
2. 冷たい1X PBSを含む解剖皿の井戸に幼虫を置く。幼虫表皮から任意の食品の粒子を掻き取るペイントブラシを使用してください。
   1. 冷たい1X PBSを含む解剖皿の新鮮なウェルにきれいな幼虫を転送します。
   2. 蛍光を検出することが可能な実体顕微鏡を用いて、GFP蛍光の有無を確認してください。幼虫を有する非GFPを捨てる。
3. （解剖プロトコルは腫瘍はこれらの2つのタイプのために同じまま）のどちらか良性または浸潤性腫瘍を有する幼虫を転送解剖皿に新鮮なウェルに冷たい1×PBSの1.0ミリリットルを追加し、ピンセットを使って。
4. 前端から3分の2程度ピンセットを使って幼虫を押したままにします。
   1. 鉗子の他のペアを使用し、スマートに幼虫の後部3分の1を分離し、それを廃棄します。
   2. 幼虫の前方3分の2を手放す。幼虫内の圧力の内容が解放される幼虫は、体腔からにじみ出るう。
   3. 腸、脂肪体、体腔外に染み出してきた幼虫の他の内側の内容を削除するためにピンセットを使用してください。
   4. 幼虫の口フックを保持し、幼虫表皮にそれをプッシュするピンセットを使用し、完全に幼虫を反転鉗子の他のペアを使用。
   5. 優しく、慎重に脂肪体、唾液腺、腸、翼ディスク複合体および任意の気管チューブを取り除くために鉗子を使用してください。頭部複合体は、現在、反転幼虫の口フックに取り付ける表示されるはずです。脳半球と腹側神経索（VNC）はまだ、VNCから発せられる神経を通して幼虫表皮に接続される。
   6. 優しく頭部神経と幼虫の表皮との間の接続を破るためにピンセットを使用してください。
   7. VNCと幼虫表皮の間の神経接続が切断さと余分な脂肪本体やその他の組織が除去されると、頭部COmplexがはっきり見えるようになりだろうと口だけのフックで幼虫表皮に添付されます。
   8. 複合体は、抗体染色のようなダウンストリームアプリケーションのため以降の視覚化のために固定される必要がある場合、頭部複合体は、幼虫の表皮に装着しておくことができます。
   9. それ以上のダウンストリームのアプリケーションが実行されないであろう場合には、頭部の複合体は、幼虫の表皮から分離し、さらに、観察および分析のためのメディアのマウントベースグリセロールの低下に配置することができます。封入剤としてVECTASHIELDを使用してください。

プロトコルの結果がここに提示され、ユーザは、幼虫の目触角成虫盤で活性化癌遺伝子を過剰発現させることにより、良性腫瘍を誘発することができます。ユーザはまた、細胞極性遺伝子にも変異細胞のクローンで活性化癌遺伝子を過剰発現させることによって眼触角で浸潤性腫瘍を誘発することができるであろう。腫瘍は簡単に全体の幼虫や幼虫の体腔（ 図1）の摘出された頭部の複合体では「緑色蛍光」は、組織としての蛍光実体顕微鏡の助けを借りて可視化することができた。浸潤性腫瘍は、腫瘍や、VNCや他の隣接する臓器へのGFP陽性浸潤性腫瘍のその後の移行の大規模な異常増殖をもたらすのに対し、良性腫瘍は、GFP陽性細胞のクローンとして眼の触角複合体にローカライズされます。 （浸潤性腫瘍の遺伝子型から派生した）> 10日齢の幼虫GFP陽性着脱二次腫瘍ではfloa幼虫の体腔内ティンも観察することができる。良性腫瘍を有する幼虫が時間通りにpupariateながらさらに、浸潤性腫瘍を有するものは、拡張された幼虫の期間があり、pupariateに失敗します。これらの侵襲性の腫瘍を有する幼虫を容易流体封入体腔有する「巨大幼虫」として観察することができた。

図1。 ショウジョウバエの良性および浸潤性腫瘍ABはパネル左：AB右のパネルはそれぞれ、良性および浸潤性腫瘍と緑の蛍光を発する幼虫 ：良性または浸潤性のどちらかの腫瘍を有する幼虫から解剖頭部複合体をそれぞれA）良性腫瘍が目を触角に局在しているこれらが誘導されるディスク。 GFPラベル組織のような連続した臓器に移行していないことに注意してください腹側神経索（VNC）。頭部の複雑なベアリング浸潤性の腫瘍は10日目幼虫から）のB。Bと比較してみましょう。腫瘍組織（緑）の異常増殖し、また、VNCや（赤い矢印で示される）、腫瘍組織による口のフックのような連続した臓器の侵入を注意してください。浸潤性の腫瘍組織による連続した臓器の浸潤が矢印で示されている。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

図2。 VNC上の移動の程度に基づいて、浸潤性腫瘍の分類体系 。 VNCの概略は、緑色の塗りで描かれた腫瘍の移動の程度と示されている。に関連付けられた番号マイグレーションの重症度は、各概略上方与えられる。

表2。良性腫瘍および浸潤性腫瘍を誘発するために必要な株式の遺伝子型は、全ての在庫が示す基準に記載されている。株式市場は、天徐の研究室から請求してください。

癌は過去に比べてはるかに優れた理解、今日と複雑な疾患である。しかし、まだ多くを学んだし、我々は根本的なメカニズムの全体像を持って前に説明される必要がある。ここで紹介する単純なプロトコルは、遺伝的、生物全体に良性および浸潤性腫瘍を誘発し、このモデルでは腫瘍の進行に関連した生物学を研究することが可能となる。 ショウジョウバエにおける既存の技術および他の生物のほとんどは、腫瘍形成および転移または成体宿主^23-27に原発腫瘍組織の移植を使用するシステムを理解するために、細胞培養ベースのシステムを利用してのいずれか。セルベースおよび移植技術の両方が彼らの限界がある。例えば、移植技術は面倒で時間がかかり、宿主に非腫瘍組織の移植をもたらす可能性がある。これは実験的な成果物の生成をもたらす可能性があります。さらに、細胞カルトUREベースのシステムは、生物全体に存在し、実環境の単なる近似値である。この制限は、それが難しい腫瘍の進行および転移³⁴において重要な役割を果たしている非常に重要な腫瘍微小環境との相互作用を模倣することができる。ここに記載した技術は、正常ショウジョウバエにおける腫瘍進行の遺伝的および分子的基礎を調査するためにいくつかの研究グループによって採用されている。例えば、この技術を利用するには、JNK経路が両方の浸潤性腫瘍においてアップレギュレートされ^、35,36、腫瘍の進行のために必要であることが実証された。別の研究では、腫瘍の進行におけるマトリクスメタロプロテアーゼの役割は、この遺伝子モデル^12,37で示された。

ここで紹介するプロトコルに関連する重要なステップは、良性および浸潤性腫瘍の誘導のために使用される株式の正確な遺伝子型で始まります。注意を保証するために注意すべきことは、これらの株式市場は「壊し」ではありません。株式は、定期的に黄色の存在を確認することができます（Y ^{- ）}株式の内訳を示すものであろう飛ぶ。これはMARCMテスター在庫FLPアウトカセットが自然に出反転しているため、構成的にGal4を発現していることになることを示すことになる。これは、腫瘍が誘発されるように、また、バイアル中、18℃で、重複した株式を保持することにより防止することができ、幼虫が良性および浸潤性腫瘍のためにチェックする必要が生じた日も非常に重要です。良性腫瘍を有する幼虫は、野生型の幼虫と密接に類似した発達のタイムラインに従っている間、幼虫は浸潤性腫瘍を有するとの話は違います。浸潤性腫瘍を有する幼虫の表示は幼虫期を延長し、一部はpupariateに失敗。実際に障害が発生したpupariationに対するpupariationのこの特性が原因拡張幼虫のMenut ら ³⁸による侵襲的な腫瘍抑制の指標として利用されているステージは、浸潤性腫瘍を有する幼虫では、最良の結果を得るために8〜10日目、誘導後の周り浸潤性腫瘍を観察することが重要です。それは実体顕微鏡下で容易に観察されるように日に8月10日に十分な腫瘍の移行は、VNC上で起こっている。腫瘍を観察することができるが、10日を超えて、それは完全にそれが困難な解剖標本における頭部複合体を配向させるVNCを巻き込むし始める。幼虫全体の腫瘍の可視化に関連する別の重要なステップは、幼虫を固定化する能力である。 FlyNapと低い温度の両方は、詳細なプロトコールで概説した幼虫を固定するために使用することができる。解剖頭部複合体が抗体で染色する必要がある場合、最終的に、その後解離を氷上で行われるべきであり、複合体は30分以内に修正されるべきである。

ここに記載した技術は、腫瘍の進行において役割を果たすことが疑われる遺伝子の寄与を理解するために研究者によって利用することができる。この遺伝モデルによる遺伝子のアップレギュレーションは、抗体染色法またはRT-PCRの使用を介してその場で研究することができる。 Oneはまた、遺伝子質問またはRNAi試薬における遺伝子についての突然変異体との組み合わせでこのモデルを利用して、腫瘍の進行のために必要であるかどうかを理解しようと試みることができる。例えば、腫瘍抑制について試験される遺伝子のためのRNAi試薬は、 ^第3染色体上に存在し得る。この場合、テスターと2番染色体のための株式の組み合わせをテストして、RNAiベアリング3 ^番目の染色体がテストストックに横切った後にのみ、（ 表2）を使用することができる。そして、これは、テスターを達成し、2番染色体のために株式をテストされていたら、交差させ、浸潤性腫瘍の抑制をアッセイすることができる。浸潤性腫瘍表現型の抑制は、侵襲的な過程で遺伝子の関与を示唆している。しかしながら、浸潤性の表現型の抑制が完全に浸透できない場合があり、それはこの理由からであるIVNC（ 図2）上の腫瘍の移動の程度に基づいて、浸潤性腫瘍の分類体系を提示する。 1は簡単に侵入に関与していることが疑われる遺伝子がノックダウンされた浸潤性腫瘍に浸潤性腫瘍を比較することができ、この分類方式を利用。いくつかの頭部複合体の分析は、侵襲的な行動抑制の程度はより深い洞察を与える可能性があります。

ここで紹介するプロトコルは、腫瘍の進行上の遺伝子」効果を研究するために、1つまたは2つの遺伝子のノックダウンと組み合わせて使用​​することができるが、二つ以上の遺伝子の同時のノックダウンを達成することは技術的に困難であろう。最後に、この技術の変形例は、細胞極性遺伝子の変異体である細胞に対して細胞を発現する活性化癌遺伝子を並置の効果を理解するためにWu ら ³⁹によって利用された。 Wu らによる手法は、 遺伝的な試薬hのレベルで修正した腫瘍の可視化のための頭部の複合体の実験利用解剖をowever。従ってここに提示頭部複合体を分析するための方法は、ウーらによって提示修飾技術を利用しようとしている科学者にとって有用であり得る。ならびに。

私は、開示することは何もありません。

私の研究室での研究はWKU研究財団RCAPは-Iは、生物学のスタートアップ資金のWKU省によってサポートされている＃11から8032を付与し、国民の協会の総合医科学研究所から親の許可によって資金を供給KBRINエリア助成金健康の賞番号5P20GM103436-13アンダー。私はまた、その実験室の私が最初に徐実験室で、この手法を確立し、この技術博士レイモンドPagliariniに導入された博士ティアン徐を承認したいと思います。