腸神経系ではα-シヌクレインの介在物の強制経口および画像解析を用いたロテノンの経口投与

パーキンソン病は、農薬への暴露に関係している。ここでは、所望の濃度と腸神経系ではα-シヌクレインの蓄積で、その効果を分析する方法で胃管を使って殺虫剤を提供する方法を示しています。

パーキンソン病（PD）患者では、関連する病理学は、腸神経系^{（ENS）1,2、}嗅球（OB）、迷走神経背側運動核^{（DMV）3、}中間外側とりわけ関与する特徴的なパターンに従います。脊髄の⁴と黒質の核^、4,5病の神経病理学的ステージングの基礎を提供する。 ENSとOBが最も露出神経の構造と影響を受ける最初のものです。興味深いことに、PDは、農薬暴露^6-8関係している。ここでは詳細に私たちの以前の研究⁹で使用される2つの方法を示しています。 ENSで局所的に作用するロテノンの影響を分析するために、我々は1歳C57/BL6マウスに強制経口投与を使用してロテノンを投与。ロテノンは強くミトコンドリア複合体のI ^10を阻害^する広く使用されている農薬です。それは非常に親油性と胃腸管¹¹に吸収される。我々の結果は、ロテノンの5 mg / kgの投与は、筋肉や脳内のミトコンドリア複合体Iの活性を阻害しなかったこと。示したしたがって、我々の投与方法のロテノンを使用すると、肝門脈のシステムを横断しておらず、もっぱらENSに作用していたことを示唆している。ここでは、ENSにおけるα-シヌクレインの蓄積で、農薬の効果を分析するために使用される強制経口投与し、画像解析のプロトコルを使用して農薬を管理する方法を示しています。最初の部分は、目的の正確な濃度で殺虫剤（ロテノン）の胃内投与を可能にする方法を示しています。第二の方法は、画像解析ソフトウェアを使用してENSにα-シヌクレインの蓄積を分析するために半自動画像解析のプロトコルを示しています。

ロテノンの1）胃内投与

1. 動物を秤量する。
2. 必要なロテノン/車両溶液の総容量を計算します。動物の重量のグラムあたりこの場合は0.01ミリリットル。
3. 以前に計算されたロテノン溶液の体積（0.625 mg / mLのロテノン、4％カルボキシメチルセルロースおよび1.25％のクロロホルム）または車両の溶液（4％カルボキシメチルセルロースおよび1.25％のクロロホルム）で1 mLシリンジを充電してください。このケースでは、5 mg / kgのロテノンの投与量に相当する。
4. マウスをピックアップし、片手でマウスの尾を持って、他の手の最初の二つの指でそれを引いて、首の皮膚を伸ばす。
5. ヘッドは2本の指で固定されると、手のひらに対してそれを傾くと逆さまそれを回す。第四および第五の指を使って尾を修正。
6. 背面に向かって頭にしておくと、マウスの口を開くために口蓋を押してください。ゆっくりと口の中で強制経口投与を紹介。強制経口投与針ではなく、通常の針を使用することが重要です。ゆっくりと、十分胃の方向に強制経口投与を移動する。これは、肺になっ物質を避けることができます。
7. 優しく塞栓を押して、ロテノンのソリューションや車両を管理する。完了すると、徐々に強制経口投与を抽出する。
8. oneケージからすべての動物が終了するまで戻って別のケージで動物を置きます。

2）免疫染色の手順

1. 治療後、マウスは、ケタミンは100 mg / kgウントXylazin 10 mg / kgをipおよびintracardially PBS中4％パラホルムアルデヒドで灌流を使用して麻酔する。
2. ガッツはその後、解剖によって抽出され、一晩15％ショ糖に配置されます。翌日、組織が30％スクロースに転送し、4で再び一晩インキュベート℃に
3. 組織は、組織- TEKに配置し、使用するまで-80℃の冷凍庫に保存されます。
4. クライオスタットを用いて、20ミクロンの小腸の断面積はSuperfrostスライドに転送されます。
5. 抗βIII-チューブリンと抗α-シヌクレイン抗体を使用してプロシージャをブロックして免疫染色することはその後、前述の⁹として実行されます。

3）α-シヌクレインのインクルージョン画像解析

それは画像の起源を知らない外部の人が分析を行うことをお勧めします。したがって、データが体系化されるべきである。画像解析は、フィジーのソフトウェアを用いて行った。

1. 共焦点画像ファイルを開きます。それは各チャネル独立に動作させることが可能になるようにし、チャネルを分割する。
2. 解析]を使用して選択する>スケールを設定し、1ピクセルサイズを設定するつもりはないそれらのチャネルを閉じます。 0.13（これは使用目的や解像度に依存します）に既知の距離を設定し、グローバルをクリックしてください。画像のサイズは現在、ミクロン単位で表示されます。
3. α-シヌクレインチャンネルを選択して、神経節を選択し、選択はすべてのスライスに神経節を囲むことを確認してください。
4. プレス画像>画像を複製する重複。神経節を選択した状態で、画像のみが神経節の大きさが複製されます。
5. 編集>クリア外側を押してください。選択された領域の外側で画像の一部が黒になります。
6. 手順が行ったどれだけ後の手順で決定するイメージを再度複製する。バックグラウンド比のノイズへの高い信号を持っている画像は、画像解析には使用しないでください。
7. イメージ>調整>しきい値を選択し、[MaxEntropy]を選択します。その後の手順がうまくいったことを保証するためにトリミングされた画像と元のスライス上に移動。エントロピーのしきい値は、輝度信号レベルの画像のヒストグラムに基づいており、この閾値よりも高い強度を持つピクセルだけが黒の画像の上に白で表示されますを選択します。
8. プロセスを選択して、滑らかにします。このステップでは、滑らかなエッジの画像のpixeledエッジを変換します。
9. プロセスを選択し、[バイナリ]をクリックし、バイナリを作成]を選択します。画像は白画像上に黒として表示されます。
10. 重複した画像上で次のステップを実行するためにイメージを複製する。
11. 解析>粒子を分析をクリックしてください。 [表示]を選択します：アウトラインをし、集計]をクリックしてください。残りの設定は、デフォルトで葉のはずです。この関数は、信号と一緒にグループ化されているものを持つピクセルの合計数を認識します。信号に加えてピクセルのグループの数と平均サイズと画素の全表面が報告されています。
12. うまく調整する最大のスライスを比較して選択します。スライスがマークされます。
13. トータルα-シヌクレインの表面、介在物の数と、平均粒径を持つデータテーブルをコピーします。他のExcelスプレッドシートまたは注釈付きにデータを貼り付けます。
14. フィジーに戻るとβ-チューブリンのチャンネルで以前に選択したスライスを見つけ、そしてそれを選択します。
15. 神経節の領域を選択して、測定を選択し、[分析]をクリックします。別のテーブルが表示されます神経節の全表面。
16. α-シヌクレインの測定の近くにExcelシートにテーブルからデータを抽出したり、他の場所にそれをコピーします。
17. エクセルを使用して、総α-シヌクレインの表面と神経節の大きさで正規化された包接数を取得するために神経節の表面からα-シヌクレインの測定で得られたさまざまなパラメータを分割。

4）代表者の結果

強制経口投与プロトコルが正しく実行されると動物のための不便は最小限です。ロテノンのこの濃度を使って治療は、血液中のロテノン濃度なしENS上ロテノンの局所効果を可能にし、筋肉や脳ミトコンドリア複合体の阻害、私も治療の1.5ヶ月（図1参照）の後。画像解析が正しく行われている場合、α-シヌクレインのパターンの厳密な分析が可能なはずです。それは、α-シヌクレイン（合計面）、α-シヌクレインのセルのパターン（封入体の数）とα-シヌクレイン封入体の存在（介在物寸法）（図2）の合計額に信頼性の高いデータを提供します。

図1。ロテノンの運動機能障害は、血液や中枢神経系におけるロテノンの検出なしでマウスを処理した。 、標準（50 ng / mL）を、20、10および5 mg / kgを投与したマウスの脳試料からのクロマトグラム。BとC、ロテノンの血中濃度（B）およびCNS（C）の定量化。B、血中レベル1 、治療後の2と3時間。マウスは3つのグループ（N = 3）に分割し、2.5、5、10、20 mg / kgのロテノン（N = 3）で処理した、血液300μLのはロテノン投与後1、2、3時間を抽出し、一緒にプールしたHPLC分析。C、マウスは5（N = 3）、10（N = 3）および20（N = 1）mg / kgのロテノン、脳や脳幹で一日一回一週間の治療を受けていた1と2時間後に抽出した最後の管理およびHPLC分析。D、1.5カ月治療したマウスの筋肉および脳のサンプル中のミトコンドリア複合体I活性のために準備。

図2。ローカルで管理さロテノンは、ENS神経節における神経膠症とα-シヌクレインのリン酸化、蓄積して凝集を誘導する。（スケールバーは20μm）。、B、C、抗βIII-チューブリン、α-シヌクレインと十二指腸のDAPI染色（B）と回腸（は、C）のセクション。 3ヶ月のコントロール（）と比較するとBの矢印は、1.5ヶ月の治療は、腸神経系の神経節内の増加、α-シヌクレイン斑点状のパターンを誘発した。 Cの矢印、3ヶ月の治療は、より大きなα-シヌクレインのインクルージョン（ø> 6μm）の形成を誘導した。D、抗α-シヌクレイン、チオフラビンSとDAPIを用いて免疫蛍光染色。 Dの矢印、わずか3ヵ月投与したマウスは、これらの大規模なα-シヌクレインの蓄積の凝集を示した。E、E'、E ''、画像解析の定量化の手順。E、ENSの神経節を示す定量化に使用される画像の例は、示すαシヌクレインに対する免疫染色別のインクルージョン。E'、画像解析のプロトコルの後に得られた画像の例。E ''、オリジナルのインクルージョン（緑）とプロトコル（黄色の線）を実行後に得られる表現の一部との間のオーバーラップ。FG、に示すように実験の定量化ACは、自動セグメンテーションとエントロピーベースのスレッシュホールド法を用いて行った。シングルアスタリスク、P <0.05、および二重アスタリスク、P <0.01。F、各列が総α-シヌクレインの面/神経節面を表す。G、各列には、α-シヌクレイン封入体/神経節面の数の合計を表します。すべてのグラフは、平均± SEMを示す

胃内投与は、以前は^12を行われている。しかし、印伝の原稿によると、ロテノンは、0.5％カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩（CMSS）単独で溶解投与した。ロテノンは高いliphophylic物質です。したがって、ロテノンは、単独で0.5％のCMSSに溶解することができないので、行えば沈殿する。クロロホルムを使用すると、沈殿を避ける均等に分散さロテノン懸濁液を作成します。また、CMSSの農薬の高濃度のために、投与溶液の最終容積も大幅に減少しています。このように、行政の合併症を減らすことができます。

私たちは、ストレートgavagesの使用をお勧めします。マウスの食道は、直接胃の片側に終わる、まっすぐです。したがって、ストレートgavagesはこのタスクのためのより適切です。

共焦点画像の画像解析は、フィジーのソフトウェアを使用して行われました。このソフトウェアのプラグインがオンラインでダウンロードすることができます。画像解析のための免疫蛍光染色は、前述の⁹として実施した。画像は、LSM 510ツァイス共焦点顕微鏡を用いて取得した。画像は同じ信号/雑音比を用いて取得することが重要です。これは、買収前にゲインとオフセットを調整することによって達成することができます。

ペドロバリーデラマーサ財団は、この作業を支持した。