Die orale Verabreichung von Rotenon mit einem Gavage und Bildanalyse von Alpha-Synuclein Einschlüsse in den enterischen Nervensystem

Parkinson-Krankheit ist die Exposition gegenüber Pestiziden in Zusammenhang gebracht. Hier zeigen wir eine Methode, um Pestizide mit einer Magensonde in der gewünschten Konzentration und eine Methode, um ihre Wirkung in alpha-Synuclein Anreicherung zu analysieren, die enterale Nervensystem liefern.

In der Parkinson-Krankheit (PD)-Patienten, folgt der damit verbundenen Pathologie ein charakteristisches Muster mit unter anderem die enterale Nervensystem (ENS) ^1,2, der Riechkolben (OB), der Nucleus dorsalis des Vagus (DMV) ^3, die intermediolateralen Kern des Rückenmarks ⁴ und der Substantia nigra, die die Grundlage für die neuropathologischen Inszenierung der Krankheit ^4,5. Die ENS und der OB sind die am stärksten exponierten Nerven Strukturen und die ersten, die betroffen sein. Interessanterweise hat PD um Pestizidbelastung ^6-8 in Verbindung gebracht. Hier zeigen wir im Detail zwei Methoden in unserer vorherigen Studie ⁹ verwendet. Um die Effekte von Rotenon lokal handeln auf der ENS zu analysieren, wir Rotenon mit einer Magensonde zur einjährigen C57/BL6-Mäusen verwaltet. Rotenon ist eine weit verbreitete Pestizid, das stark hemmt mitochondrialen Komplex I ^10. Es ist sehr lipophilen und schlecht im Magen-Darm-Trakt ¹¹ absorbiert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Gabe von 5 mg / kg Rotenon nicht hemmen mitochondrialen Komplex I-Aktivität in den Muskeln oder dem Gehirn. So, was darauf hindeutet, dass die Verwendung unserer Verwaltung Methode Rotenon nicht über die hepatoportal und war ausschließlich auf die ENS tätig. Hier zeigen wir eine Methode, um Pestizide mit Hilfe eines Magensonde und die Bildanalyse-Protokoll verwendet, um die Auswirkungen des Pestizids in alpha-Synuclein Anreicherung in der ENS analysieren zu verwalten. Der erste Teil zeigt eine Methode, intragastrische Verabreichung von Pestiziden (Rotenon) ermöglicht bei einer gewünschten genaue Konzentration. Die zweite Methode ist eine semi-automatische Bildanalyse-Protokoll zu alpha-Synuclein Anreicherung in der ENS analysieren mit Hilfe eines Bildanalyse-Software.

1) Intragastric Verwaltung von Rotenon

1. Wiegen des Tieres.
2. Berechnen Sie das Gesamtvolumen der Rotenon / Fahrzeug-Lösung benötigt. In diesem Fall 0,01 ml pro Gramm des Tieres Gewicht.
3. Laden Sie eine 1 ml-Spritze mit den zuvor berechneten Volumen von Rotenon Lösung (0,625 mg / mL Rotenon, 4% Carboxymethylcellulose und 1,25% Chloroform) oder Vehikel-Lösung (4% Carboxymethylcellulose und 1,25% Chloroform). In diesem Fall entspricht es einem 5 mg / kg Rotenon Dosis.
4. Pick-up mit der Maus und die Maus am Schwanz mit einer Hand, erstrecken sich die Haut des Halses, indem Sie es mit den ersten zwei Fingern der anderen Hand.
5. Sobald der Kopf zwischen den beiden Fingern fixiert ist, lehnen sie gegen die Handfläche und drehen Sie ihn auf den Kopf. Fix der Schwanz mit dem vierten und fünften Finger.
6. Keeping den Kopf nach hinten, drücken Sie den Gaumen mit der Maus in den Mund zu öffnen. Vorsichtig einführen Magensonde in den Mund. Es ist wichtig, eine Magensonde Nadel und nicht einer regulären Nadel verwenden. Langsam bewegen sich die Sonde in Richtung des Magens weit genug. Dadurch wird vermieden, Material immer in der Lunge.
7. Verwalten Sie die Rotenon Lösung oder Fahrzeug durch sanftes Drücken der Embolus. Wenn Sie fertig sind, langsam extrahieren Sie die Magensonde.
8. Legen Sie das Tier wieder in einem anderen Käfig, bis alle Tiere aus einem Käfig fertig sind.

2) Immunfärbung Procedures

1. Nach der Behandlung werden die Mäuse betäubt mit Ketamin 100 mg / kg und Xylazin 10 mg / kg ip und intrakardial mit 4% Paraformaldehyd in PBS perfundiert.
2. Die Eingeweide werden dann durch Dissektion extrahiert, und in 15% Saccharose über Nacht. Am nächsten Tag wird das Gewebe auf 30% Saccharose überführt und erneut über Nacht bei 4 ° C.
3. Das Gewebe wird dann in Tissue-tek gelegt und in einem -80 ° C Gefrierschrank bis zur Verwendung.
4. Mit einem Kryostaten, 20 micron Darm Querschnitte Superfrost Objektträger übertragen.
5. Blocking und Immunfärbung Verfahren mit anti-βIII-Tubulin-und anti-alpha-Synuclein-Antikörper sind dann wie zuvor beschrieben ⁹ durchgeführt.

3) Alpha-Synuclein Inclusion Image Analysis

Es wird empfohlen, eine externe Person nicht bewusst images 'Herkunft der Analyse durchführt. Daher sollten die Daten zu kodifizieren. Die Bildanalyse erfolgte mit FIJI Software.

1. Öffnen Sie die konfokale Bilddatei. Dann teilen Sie die Kanäle, so dass es möglich ist, auf jedem Kanal unabhängig voneinander arbeiten.
2. Schließen Sie die Kanäle, die nicht gehen, um zu verwenden, und wählen Sie Analyse> Set Scale und setzen Sie die Pixelgröße auf 1. Setzen Sie die bekannte Strecke bis 0,13 (dieser wird auf der objektiven und der Auflösung abhängen) und klicken Sie auf global. Die Größe des Bildes wird nun in Mikron gezeigt werden.
3. Wählen Sie Alpha-Synuclein-Kanal und wählen Ganglion, stellen Sie sicher, dass die Auswahl das Ganglion umschließt in allen Schichten.
4. Drücken Sie Bild> Duplizieren, um das Bild zu duplizieren. Mit dem Ganglion gewählt, nur ein Bild der Größe des Ganglion dupliziert werden.
5. Drücken Sie Bearbeiten> Löschen Outside. Der Teil des Bildes außerhalb der gewählten Region wird schwarz.
6. Duplizieren Sie das Bild erneut in späteren Schritten, wie gut die Verfahren ging zu bestimmen. Bilder, die ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis in den Hintergrund haben, sollten nicht für die Bildanalyse verwendet werden.
7. Wählen Sie Bild> Anpassen> Schwellenwert und wählen Sie dann MaxEntropy. Dann über die Scheiben in das freigestellte Bild und das Original zu bewegen, um sicherzustellen, dass das Verfahren gut gelaufen ist. Die entropischen Schwelle wählt eine Intensität Signalpegel auf das Bild Histogramm und nur die Pixel mit Intensitäten größer als dieser Schwellenwert wird in einem weißen über schwarzes Bild angezeigt basiert.
8. Wählen Sie Prozess, dann auf glatte klicken. Dieser Schritt wandelt die pixeligen Kanten der Bilder in glatte Kanten.
9. Wählen Sie Prozess, dann auf Binary klicken, und wählen Sie Binary. Das Bild wird als ein schwarzer über Weiß-Bild angezeigt werden.
10. Duplizieren Bild zum nächsten Schritt auf dem duplizierten Bild durchzuführen.
11. Klicken Sie auf Analysieren> Analyze Partikel. Dann wählen Sie Zeigen: Outlines und klicken Sie auf Auswerten. Der Rest der Einstellungen sollten leaved in Verzug ist. Diese Funktion erkennt die Gesamtzahl der Pixel mit einem Signal und diejenigen, die gruppiert werden. Die Gesamtfläche der Pixel mit Signal plus der Anzahl der Gruppen von Pixeln und die mittlere Größe gemeldet werden.
12. Vergleichen Sie und wählen Sie das größte Segment, das gut passt. Die Scheibe markiert.
13. Kopieren Sie die Daten-Tabelle mit der gesamten Alpha-Synuclein Oberfläche, die Anzahl der Einschlüsse und die mittlere Partikelgröße. Fügen Sie die Daten in eine Excel-Tabelle oder Anmerkungen an anderer Stelle.
14. Return to FIJI und finden Sie die zuvor ausgewählten Slice in der β-Tubulin-Kanal, und wählen Sie es.
15. Wählen Ganglion Bereich und klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie dann messen. Eine andere Tabelle erscheint und zeigt dieGesamtfläche des Ganglion.
16. Entpacken Sie die Daten aus der Tabelle der Excel-Tabelle in der Nähe des Alpha-Synuclein-Messung oder kopieren Sie es an anderer Stelle.
17. Mit Excel, teilen sich die verschiedenen Parameter in der alpha-Synuclein Messung durch das Ganglion Oberfläche erhalten, um insgesamt alpha-Synuclein Oberfläche und die Einbeziehung Anzahl von Ganglienzellen Größe normiert zu erhalten.

4) Repräsentative Ergebnisse

Wenn eine Magensonde Verwaltung Protokoll korrekt durchgeführt wird, die Nachteile für das Tier sind minimal. Die Behandlung mit dieser Konzentration von Rotenon ermöglicht eine lokale Wirkung von Rotenon auf die ENS ohne Rotenon-Spiegel im Blut und keine Hemmung des Muskel oder Gehirn mitochondrialen Komplex I auch nach 1,5 Monaten der Behandlung (siehe Abbildung 1). Wenn Bildanalyse korrekt durchgeführt wird, eine strenge Analyse von Alpha-Synuclein-Muster sollte möglich sein. Es gibt verlässliche Daten über den Gesamtbetrag von Alpha-Synuclein (Gesamtfläche), alpha-Synuclein-Muster in der Zelle (Anzahl der Einschlüsse) und das Vorhandensein von Alpha-Synuclein Einschlüsse (Einbeziehung Größe) (Abbildung 2).

Abbildung 1. Motor Dysfunktion bei Rotenon behandelten Mäuse ohne Nachweis von Rotenon in Blut-oder ZNS. A, Standard (50 ng / mL) und Chromatogramm vom Gehirn Proben von 20, 10 und 5 mg / kg behandelten Mäuse. B und C, die Quantifizierung von Rotenon-Spiegel im Blut (B) und CNS (C). B-, Blut-Level 1 , 2 und 3 Stunden nach der Behandlung. Mäuse in drei Gruppen (n = 3) wurden geteilt und mit 2,5, 5, 10 und 20 mg / kg Rotenon (n = 3) wurden 300 ul Blut 1, 2 und 3 Stunden nach Rotenon Verwaltung extrahiert und zusammen gebündelt HPLC-Analyse. C, wurden die Mäuse für eine Woche behandelt werden einmal täglich mit 5 (n = 3), 10 (n = 3) und 20 (n = 1) mg / kg Rotenon, Gehirn und Hirnstamm 1 extrahiert wurden und 2 Stunden nach letzten Verabreichung und vorbereitet für die HPLC-Analyse. D, mitochondriale Komplex I-Aktivität in den Muskeln und Gehirn Proben von 1,5 Monate behandelten Mäuse.

Abbildung 2. Lokal verwaltete Rotenon induziert alpha-Synuclein Phosphorylierung, Akkumulation und Aggregation mit Gliose in ENS Ganglien. (Maßstab 20 mu m). A, B, C, anti βIII-Tubulin, alpha-Synuclein und DAPI-Färbung in Zwölffingerdarm (B) und Ileum ( A, C) Abschnitte. Pfeil in B, induziert 1,5 Monate der Behandlung eine erhöhte Alpha-Synuclein punktförmige Muster innerhalb enterale Nervensystem Ganglien, wenn bis 3 Monate kontrolliert (A) verglichen. Pfeil in C, 3 Monate Behandlung induzierte Bildung von größeren alpha-Synuclein Einschlüsse (ø> 6 um). D, Immunfluoreszenzfärbung mit anti-alpha-Synuclein, Thioflavin S und DAPI. Pfeil in D, nur 3 Monate behandelten Mäuse zeigten Aggregation dieser größeren alpha-Synuclein Ansammlungen. E, E ', E'', Bildanalyse Quantifizierung Schritte. E, immungefärbt Beispiel Bild in Quantifizierung zeigt eine ENS Ganglion eingesetzt gegen alpha Synuclein zeigen verschiedene Einschlüsse. E ', beispielsweise der Bild für Bild-Analyse-Protokoll erhalten. E'', Überschneidungen zwischen einigen der ursprünglichen Einschlüsse (grün) und die Darstellung nach der Durchführung des Protokolls (gelbe Linien) erhalten. FG, Quantifizierung des Experiments gezeigt, in AC wurde mit Hilfe der automatischen Segmentierung und Entropie-basierte Schwellwertverfahren. Single-Sternchen, P <0,05, und doppelklicken Sie Sternchen, P <0,01. F, jede Spalte entspricht insgesamt alpha-Synuclein Oberfläche / ganglion Oberfläche. G repräsentiert jede Spalte Gesamtzahl von Alpha-Synuclein Einschlüsse / ganglion Oberfläche. Alle Diagramme zeigen Mittelwerte ± SEM

Intragastric Verwaltung wurde bereits ¹² durchgeführt. Doch nach Inden Manuskript, Rotenon verabreicht wurde in 0,5% Carboxymethylcellulose-Natriumsalz (CMSS) allein aufgelöst. Rotenon ist ein High liphophylic Substanz. Daher kann Rotenon nicht in 0,5% CMSS aufgelöst allein sein und Niederschlag, wenn getan. Der Einsatz von Chloroform entsteht eine gleichmäßig verteilte Rotenon Federung vermeiden Niederschlag. Außerdem wird durch den höheren Konzentrationen des Pestizids in der CMSS ist das endgültige Volumen der verabreichten Lösung auch deutlich gesunken. So Verringerung der Komplikationen in der Verwaltung.

Wir empfehlen die Verwendung von geraden gavages. Die Speiseröhre der Maus ist gerade und endet direkt an einer Seite des Magens. Daher sind gerade gavages mehr ausreichend für diese Aufgabe.

Bildanalyse von konfokalen Bildern erfolgte mit FIJI Software. Die Plug-Ins für diese Software kann online heruntergeladen werden. Die Immunfluoreszenzfärbung für die Bildanalyse wurde wie zuvor beschrieben ⁹ durchgeführt. Bilder wurden mit einem LSM 510 Zeiss Konfokalmikroskop. Es ist wichtig, dass die Bilder erworben werden, mit dem gleichen Signal / Rausch-Verhältnis. Dies kann durch Einstellung von Gain und Offset erreicht werden bereits vor dem Erwerb.

Die Pedro Barrie de la Maza-Stiftung unterstützt diese Arbeit.