Le interazioni biomolecolari, comprese le interazioni proteina-proteina e proteina-DNA, sono essenziali nella ricerca biochimica. In questo studio utilizziamo l'interferometria a biostrati, o BLI, una tecnica efficiente per analizzare queste interazioni. Ci concentriamo sulla proteina di replicazione A e sulla sua affinità di legame per un singolo filamento di DNA per mostrare i principi e le capacità di BLI.
L'interferometria a biostrati è un metodo semplice ed economico per studiare la cinetica delle proteine. Consente un rapido monitoraggio in tempo reale delle interazioni proteiche e offre un flusso di lavoro semplice con meno complessità rispetto ad altre tecniche. Nel nostro laboratorio, studiamo l'impatto delle modifiche post-traduzionali sulla struttura e la funzione delle proteine che sono essenziali per il mantenimento della stabilità del genoma.
Queste modifiche possono avviare effetti a cascata attraverso i percorsi di replicazione e riparazione. Studiando le interazioni proteiche, miriamo a scoprire i meccanismi sottostanti che salvaguardano l'integrità del genoma. Per iniziare, preparare 12,5 nanomolari di tre substrati di esche in polietilene dT 32 a filamento singolo prime bio e quattro concentrazioni di RPA utilizzando il tampone BLI.
Utilizzando una pipetta, aggiungere 250 microlitri di tampone BLI in due provette per microfugi da 0,5 millilitri ed etichettarle come AND. In una piastra separata da 96 pozzetti, pipettare 200 microlitri di tampone BLI in un unico pozzetto. Posizionare il vassoio dei biosensori sulla piastra a 96 pozzetti in modo che un biosensore si immerga nel tampone BLI.
Sul software, fai clic sull'opzione idrata e imposta il timer su 10 minuti. Regolare le impostazioni di esecuzione per ogni passo, linea di base, associazione e dissociazione. Premi Esegui sul software e segui le istruzioni nel messaggio di richiesta.
Posizionare due alloggiamenti nel supporto della provetta e collegare il biosensore idrato al sistema BLI. Far scorrere il supporto della provetta sotto il biosensore in posizione A e monitorare la linea di base del biosensore. Dopo aver completato la linea di base iniziale, aprire il coperchio e aggiungere quattro microlitri di tampone BLI al supporto per gocce.
Far scorrere il portagocce verso destra sotto lo stesso biosensore in posizione B.Una volta chiuso il coperchio, monitorare la curva BLI sul software. Quindi aprire il coperchio e sostituire il tubo A con il tubo D.Far scorrere il nuovo tubo sotto il biosensore in posizione A prima di chiudere il coperchio e analizzare la fase di dissociazione nell'interfaccia. Posizionare il tubo A nel supporto del tubo.
Collegare il biosensore idrato al sistema BLI e far scorrere il supporto del tubo sotto il biosensore come mostrato in precedenza. Quindi fare clic su Esegui sull'interfaccia del software per la configurazione di base. Dopo aver aggiunto quattro microlitri di esca di DNA a filamento singolo da 12,5 nanomolari al portagocce e averla fatta scorrere sotto il biosensore per la fase di associazione, monitorare la curva BLI sul software.
Quindi aprire il coperchio per sostituire il tubo A con D.Farlo scorrere sotto il biosensore e procedere con la fase di dissociazione. Una volta completata la fase di dissociazione, aprire il coperchio e staccare il biosensore. Quindi posizionare il biosensore nel vassoio contenente il tampone BLI.
Utilizzando una pipetta, aggiungere 250 microlitri di tampone BLI a 10 provette per microfuge nere da 0,5 millilitri. Etichettare i tubi come da A1 a A5 e da D1 a D5. Compila i dettagli dell'esperimento sull'interfaccia del software e premi il pulsante di calcolo per elaborare le informazioni. In una piastra separata da 96 pozzetti, pipettare 200 microlitri di tampone di stripping nel pozzetto corrispondente alla posizione del biosensore idratato.
Dopo aver posizionato il tubo A1 nel supporto del tubo, aver collegato il biosensore rivestito di esca al sistema BLI e aver fatto scorrere il tubo sotto il biosensore, premere Esegui sul software. Una volta completato il passaggio iniziale della linea di base, aprire il coperchio e aggiungere quattro microlitri di tampone BLI al supporto per gocce. Far scorrere il supporto della goccia sotto il biosensore e monitorare la fase di associazione sull'interfaccia BLI.
Sostituire il tubo A1 con D1. Farlo scorrere sotto il biosensore e chiudere il coperchio. Quindi monitorare la fase di dissociazione sull'interfaccia BLI. Una volta completata la fase di dissociazione, aprire il coperchio, rimuovere il biosensore e riporlo nel vassoio contenente il tampone BLI.
Quindi collegare il biosensore rivestito di esca e posizionare il tubo A2 nel supporto del tubo. Far scorrere il tubo sotto il biosensore e fare clic su Esegui sul software. Dopo il passaggio di base, aggiungere quattro microlitri di RPA a cinque nanomolari sul supporto per gocce.
Far scorrere il portagocce sotto il biosensore e chiudere il coperchio. Monitorare la curva di associazione sull'interfaccia del software. Rimuovere il biosensore e immergerlo nel tampone di strippaggio per 30 secondi.
Quindi immergere il biosensore nel tampone BLI per tre minuti. Nella tabella etichettata Run List, selezionare la casella di riferimento per la concentrazione dell'analita di zero nanomolari che funge da curva di riferimento, selezionare la casella analizza per tutte le concentrazioni dell'analita. Selezionare sia l'inizio dell'associazione che l'inizio della dissociazione per la correzione del passo, scegliere l'adattamento globale per il saggio.
Quindi, fai clic su Analizza per elaborare i dati. Per esportare i dati adattati, fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico generato dai dati analizzati. Seleziona Esporta dati, quindi scegli testo o dati, fai clic su File e quindi sfoglia per salvare i dati in formato DAT.
Apri il software e seleziona Cinetica avanzata dal pannello di sinistra. Dopo aver posizionato una piastra da 96 pozzetti nel vassoio del biosensore e aver aggiunto 200 microlitri di tampone BLI a cinque pozzetti, inserire il vassoio del biosensore nella piastra per idratare i sensori. Mentre i biosensori sono idratanti, pipettare 250 microlitri di tampone BLI in 10 provette da centrifuga nere da 0,5 millilitri.
Compila i dettagli dell'esperimento sull'interfaccia del software e premi il pulsante di calcolo per elaborare le informazioni. Dopo aver fatto scorrere il supporto del tubo con il tubo A1 sotto il biosensore, fare clic su Esegui per ottenere la linea di base iniziale. Aggiungere quattro microlitri di tampone BLI al portagocce.
Far scorrere il supporto della goccia sotto il biosensore, chiudere il coperchio e monitorare la curva per il caricamento nel software. Lo spostamento spettrale durante il legame RPA utilizzando la cinetica di base ha dimostrato un aumento dose-dipendente della forza di legame con saturazione raggiunta a 40 nanomolari. Lo spostamento spettrale durante il legame RPA utilizzando una cinetica avanzata ha mostrato in modo simile un legame dose-dipendente, ma con biosensori individuali utilizzati per concentrazione per una maggiore precisione.
