تعد تفاعلات الجزيئات الحيوية بما في ذلك تفاعلات البروتين والبروتين والبروتين والحمض النووي ضرورية في أبحاث الكيمياء الحيوية. في هذه الدراسة نستخدم قياس تداخل الطبقة الحيوية ، أو BLI ، وهي تقنية فعالة لتحليل هذه التفاعلات. نحن نركز على بروتين النسخ المتماثل A وتقاربه المرتبط بالحمض النووي لخيط واحد لعرض مبادئ وقدرات BLI.
قياس تداخل الطبقات الحيوية هو طريقة سهلة وفعالة من حيث التكلفة لدراسة حركية البروتين. يسمح بمراقبة سريعة في الوقت الفعلي لتفاعلات البروتين ويوفر سير عمل مباشرا بتعقيد أقل من التقنيات الأخرى. في مختبرنا ، ندرس تأثير التعديلات اللاحقة للترجمة على بنية ووظيفة البروتينات الضرورية للحفاظ على استقرار الجينوم.
يمكن أن تبدأ هذه التعديلات تأثيرات متتالية عبر مسارات النسخ المتماثل والإصلاح. من خلال دراسة تفاعلات البروتين ، نهدف إلى الكشف عن الآليات الأساسية التي تحمي سلامة الجينوم. للبدء ، قم بإعداد 12.5 نانومولار من ثلاثة ركيزة طعم حيوية أحادية الشريطة poly dT 32 وأربعة تركيزات من RPA باستخدام المخزن المؤقت LI.
باستخدام ماصة، أضف 250 ميكرولترا من المخزن المؤقت BLI في أنبوبين من أجهزة الطرد الدقيقة سعة 0.5 ملليلتر وقم بتسميتها باسم AND. في صفيحة منفصلة سعة 96 بئرا ، قم بتعبئة 200 ميكرولتر من BLI المؤقت في بئر واحد. ضع صينية المستشعرات الحيوية على اللوحة المكونة من 96 بئرا بحيث ينخفض أحد المستشعرات الحيوية في المخزن المؤقت ل LI.
في البرنامج ، انقر فوق خيار الهيدرات واضبط المؤقت على 10 دقائق. اضبط إعدادات التشغيل لكل خطوة وخط أساس واقتران وتفكك. اضغط على تشغيل على البرنامج واتبع التعليمات الواردة في الرسالة السريعة.
ضع فتحتين في حامل الأنبوب وقم بتوصيل المستشعر الحيوي المائي بنظام BLI. حرك حامل الأنبوب أسفل المستشعر الحيوي في الموضع A وراقب خط الأساس للمستشعر الحيوي. بعد الانتهاء من خط الأساس الأولي ، افتح الغطاء وأضف أربعة ميكرولترات من المخزن المؤقت BLI إلى حامل الإسقاط.
حرك حامل الإسقاط إلى اليمين أسفل نفس المستشعر الحيوي في الموضع B.بمجرد إغلاق الغطاء، راقب منحنى BLI على البرنامج. ثم افتح الغطاء واستبدل الأنبوب A بالأنبوب D.حرك الأنبوب الجديد أسفل المستشعر الحيوي في الموضع A قبل إغلاق الغطاء وتحليل خطوة التفكك في الواجهة. ضع الأنبوب A في حامل الأنبوب.
قم بتوصيل المستشعر الحيوي المطفأ بنظام BLI وحرك حامل الأنبوب أسفل المستشعر الحيوي كما هو موضح سابقا. ثم انقر فوق تشغيل على واجهة البرنامج لإعداد خط الأساس. بعد إضافة أربعة ميكرولترات من طعم الحمض النووي أحادي الشريطة 12.5 نانومولار إلى حامل السقوط وتحريكه أسفل المستشعر الحيوي لخطوة الارتباط ، راقب منحنى BLI على البرنامج.
ثم افتح الغطاء لاستبدال الأنبوب A ب D.حركه أسفل المستشعر الحيوي واستمر في خطوة التفكك. بمجرد اكتمال خطوة التفكك ، افتح الغطاء وافصل المستشعر الحيوي. ثم ضع المستشعر الحيوي في الدرج الذي يحتوي على المخزن المؤقت LI.
باستخدام ماصة، أضف 250 ميكرولترا من مخزن BLI المؤقت إلى 10 أنابيب ميكروفوج سوداء سعة 0.5 ملليلتر. قم بتسمية الأنابيب على أنها A1 إلى A5 و D1 إلى D5. املأ التفاصيل التجريبية على واجهة البرنامج واضغط على زر الحساب لمعالجة المعلومات. في ماصة منفصلة ذات 96 بئرا ، قم بتخزين 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتجريد في البئر المقابل لموضع المستشعر الحيوي الرطب.
بعد وضع الأنبوب A1 في حامل الأنبوب ، وربط المستشعر الحيوي المطلي بالطعم بنظام BLI وتحريك الأنبوب أسفل المستشعر الحيوي ، اضغط على تشغيل على البرنامج. بمجرد اكتمال الخطوة الأساسية الأولية ، افتح الغطاء وأضف أربعة ميكرولترات من المخزن المؤقت BLI إلى حامل الإسقاط. حرك حامل الإسقاط أسفل المستشعر الحيوي وراقب خطوة الاقتران على واجهة PLI.
استبدل الأنبوب A1 ب D1. حركه أسفل المستشعر الحيوي وأغلق الغطاء. ثم راقب خطوة التفكك على واجهة PLI. بمجرد اكتمال خطوة التفكك، افتح الغطاء وقم بإزالة المستشعر الحيوي وضعه مرة أخرى في الدرج الذي يحتوي على مخزن BLI المؤقت.
ثم قم بتوصيل المستشعر الحيوي المطلي بالطعم وضع الأنبوب A2 في حامل الأنبوب. حرك الأنبوب أسفل المستشعر الحيوي وانقر فوق تشغيل على البرنامج. بعد الخطوة الأساسية ، أضف أربعة ميكرولترات من خمسة نانومولار RPA إلى حامل الإسقاط.
حرك حامل السقوط أسفل المستشعر الحيوي وأغلق الغطاء. راقب منحنى الاقتران على واجهة البرنامج. قم بإزالة المستشعر الحيوي واغمسه في المخزن المؤقت للتجريد لمدة 30 ثانية.
ثم اغمس المستشعر الحيوي في المخزن المؤقت BLI لمدة ثلاث دقائق. في الجدول المسمى قائمة التشغيل ، حدد مرجع المربع لتركيز التحليل صفر نانومولار ليكون بمثابة منحنى مرجعي ، حدد المربع ، وقم بتحليله لجميع تركيزات المادة التحليلية. حدد كل من بداية الاقتران وبداية التفكك لتصحيح الخطوة ، واختر الملاءمة العمومية للمقايس.
بعد ذلك ، انقر فوق تحليل لمعالجة البيانات. لتصدير البيانات الملائمة ، انقر بزر الماوس الأيمن على الرسم البياني الذي تم إنشاؤه من تحليل البيانات. حدد تصدير البيانات ، ثم اختر نصا أو بيانات ، وانقر فوق ملف ثم تصفح لحفظ البيانات بتنسيق DAT.
افتح البرنامج وحدد الحركية المتقدمة من اللوحة اليسرى. بعد وضع صفيحة سعة 96 بئرا في صينية المستشعر الحيوي وإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت BLI إلى خمسة آبار ، أدخل صينية المستشعر الحيوي في اللوحة لترطيب المستشعرات. بينما تعمل المستشعرات الحيوية على الترطيب ، تقوم الماصة بتخزين 250 ميكرولترا من BLI في 10 0.5 مليلتر أنابيب طرد مركزي سوداء
املأ التفاصيل التجريبية على واجهة البرنامج واضغط على زر الحساب لمعالجة المعلومات. بعد تحريك حامل الأنبوب مع الأنبوب A1 أسفل المستشعر الحيوي ، انقر فوق تشغيل للحصول على خط الأساس الأولي. أضف أربعة ميكرولترات من المخزن المؤقت BLI إلى حامل الإسقاط.
حرك حامل الإسقاط أسفل المستشعر الحيوي ، وأغلق الغطاء وراقب المنحنى للتحميل في البرنامج. أظهر التحول الطيفي أثناء ربط RPA باستخدام الحركية الأساسية زيادة تعتمد على الجرعة في قوة الارتباط مع التشبع الذي تم تحقيقه عند 40 نانو مولار. أظهر التحول الطيفي أثناء ربط RPA باستخدام الحركية المتقدمة بالمثل ارتباطا يعتمد على الجرعة ، ولكن مع أجهزة الاستشعار الحيوية الفردية المستخدمة لكل تركيز لتحسين الدقة.
