Il nostro protocollo è significativo in quanto consente la creazione di malattie in idrogel che assomigliano molto alla natura del tessuto cartilagineo. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di produrre malattie in idrogel con evidente attività biologica nella struttura spaziale, bassa immunogenicità e funzione biologica industriale. Per iniziare, taglia la cartilagine raccolta usando un bisturi in pezzi di uno o due millimetri cubi di dimensione.
In una provetta da centrifuga da 50 millimetri, immergere 20 grammi di cartilagine tritata in 20 millilitri di tampone ipotonico Tris-cloridrato. Metti il tubo a 80 gradi Celsius per tre ore, quindi in forno a 37 gradi Celsius per tre ore. Agitare la provetta da centrifuga per 30 secondi a 1000 giri/min.
Quindi filtrare la cartilagine decellularizzata utilizzando un setaccio di plastica posto su una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Lavare la cartilagine tre volte con PBS sterile prima di raccoglierla. Aggiungere 10 millilitri di soluzione di tripsina alla cartilagine raccolta e incubarla su uno shaker a 37 gradi Celsius per 24 ore, sostituendo la tripsina ogni quattro ore.
Dopo aver filtrato la sospensione, lavare la cartilagine tripsinizzata con tampone ipertonico. Una volta che la cartilagine è preservata, aggiungere 10 millilitri di soluzione di nucleasi e metterla su uno shaker a 37 gradi Celsius per quattro ore. Dopo il lavaggio con PBS sterile, aggiungere una soluzione ipertonica di Tris-cloridrato alla cartilagine e posizionarla sullo shaker come dimostrato.
Una volta lavato con PBS sterile, immergere il tessuto in una soluzione di Triton X-100 all'1% per 24 ore. Dopo aver rimosso il Triton X-100, sciacquare la cartilagine decellularizzata con acqua distillata per tre giorni, cambiando l'acqua ogni 12 ore. Dopo tre giorni, aggiungere una soluzione di acido peracetico alla cartilagine e immergerla per quattro ore.
Una volta lavata con PBS, raccogliere la cartilagine utilizzando un setaccio di plastica come precedentemente dimostrato. Utilizzando azoto liquido, preparare la polvere di cartilagine decellularizzata. Aggiungere 80 millilitri di acido acetico molare 0,5 e 20 milligrammi di pepsina a due grammi di polvere di cartilagine e digerire la miscela per 24 ore a 37 gradi Celsius.
Dopo la digestione, centrifugare la sospensione a 400 G per 10 minuti e raccogliere il surnatante, che ora è chiamato soluzione DC-ECM Per conservare la soluzione DC-ECM, aggiungere un millilitro della soluzione a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti e metterlo in un liofilizzatore. Una volta che la soluzione è liofilizzata, trasferirla in una provetta da centrifuga. Per formare un idrogel, sciogliere 20 milligrammi di soluzione DC-ECM liofilizzata in un millilitro di acqua distillata sterile.
Una volta vortexato, aggiungere un milligrammo di vitamina B2 alla soluzione DC-ECM. Dopo l'incubazione, irradiarlo con luce UV per tre minuti. Aggiunga il tampone GTL e la proteinasi K a 20 milligrammi di polvere di cartilagine DC-ECM e mescoli accuratamente usando l'oscillazione del vortice.
Per una completa dissoluzione della cartilagine, incubare la miscela a 56 gradi Celsius per quattro ore. Una volta vortexato, aggiungere 200 microlitri di tampone GTL seguito da etanolo anidro. Dopo il vortex, centrifugare il campione a 6000 G per un minuto a quattro gradi Celsius.
Quindi raccogli e quantifica il DNA come descritto nel manoscritto. Per analizzare il collagene, acidificare cinque milligrammi di polvere DC-ECM in acido cloridrico a 100 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi neutralizzarlo con cinque millilitri di soluzione di idrossido di sodio a sei molari.
Calcolare il contenuto di idrossiprolina del campione neutralizzato utilizzando l'assorbanza a 570 nanometri rispetto allo standard di idrossiprolina. Aggiungere 500 microlitri di reagente A a 200 milligrammi di polvere DC-ECM dopo la miscelazione. Incubare il campione a quattro gradi Celsius per 16 ore.
Una volta centrifugato, raccogliere 50 microlitri di soluzione del campione e aggiungere 50 microlitri di reagente B, seguiti dal reagente C. Dopo aver incubato il campione per 10 minuti, aggiungere 750 microlitri di reagente D e incubare per 30 minuti al buio. Dopo la centrifugazione, aggiungere un microlitro di reagente E al pellet e mescolare bene prima della centrifugazione. Quindi dissociare il campione prima della misurazione del contenuto di GAG.
Nella cartilagine DC-ECM preparata, il contenuto di DNA è stato significativamente eliminato. Tuttavia, il contenuto di collagene e GAG è stato mantenuto rispetto alla cartilagine nativa. L'analisi SEM e TEM ha dimostrato l'ultrastruttura del DC-ECM preparato.
L'idrogel preparato nel tubo rovesciato non è fluito sul fondo, dimostrando così la gelificazione. Inoltre, rispetto alla sola soluzione DC-ECM, l'aggiunta di vitamina B2 ha ridotto il tempo di gelificazione a causa della reticolazione indotta durante la formazione dell'idrogel DC-ECM. La viscosità dell'idrogel DC-ECM era superiore alla viscosità della soluzione e l'aumento della velocità di taglio ha ridotto la viscosità della soluzione.
Inoltre, l'elevato modulo di conservazione della soluzione DC-ECM e dell'idrogel indicava che entrambi avevano proprietà gelatinose piuttosto che liquide. L'analisi SEM ha dimostrato che la dimensione dei pori della soluzione DC-ECM è stata significativamente ridotta nella forma di idrogel dopo la reticolazione e la liofilizzazione. Il protocollo prevede una combinazione di disgregazione fisica e chimica e digestione enzimatica per rimuovere il materiale cellulare preservando la struttura e la conversazione dell'ECM.
