La valutazione delle discinesie indotte da L-DOPA nel modello di ratto 6-idrossidopamina della malattia di Parkinson è un importante strumento preclinico per identificare efficaci interventi antidiscinei. Questo modello è relativamente semplice, presenta un basso costo e ha somiglianze con ciò che accade nella clinica. La procedura sarà dimostrata da Danilo Leandro Ribeiro, dottorando in laboratorio.
Inizia l'esperimento con ratti maschi Sprague-Dawley, del peso di 200-250 grammi. Ospitare da due a tre animali per gabbia nelle condizioni standard di laboratorio con cibo e acqua disponibili ad libitum. Prima dell'intervento chirurgico, somministrare l'inibitore del trasportatore della noradrenalina, imipramina, al ratto per via intraperitoneale.
Dopo aver confermato l'anestesia dalla mancanza di risposta al pizzico del piede, posizionare il ratto in posizione prona nell'apparato stereotassico sulla parte superiore della piastra riscaldante. Una volta posizionato il ratto, utilizzare un bisturi per praticare un'incisione lunga un centimetro nella regione in cui si verificherà la microiniezione. Quindi, pulire la regione del cranio con tamponi di cotone e assicurarsi che il bregma e la lambda siano esposti.
Prendi il fascio mediale del proencefalo, o MFB, coordinate stereotassiche dal bregma a 4,3 millimetri anteriormente, 1,6 millimetri lateralmente al lato destro e 8,3 millimetri ventrale dal durometro. Quando vengono decise le coordinate, somministrare la 6-idrossidopamina, o 6-OHDA, unilateralmente ad una velocità di 0,4 microlitri al minuto nella MFB destra, con una siringa di vetro Hamilton da 50 microlitri. Al termine dell'intervento, suturare l'incisione del cuoio capelluto e reidratare l'animale con soluzione salina calda e sterile allo 0,9% per via sottocutanea, alla dose di 10 millilitri per chilogrammo.
Rimuovere l'animale dalla cornice stereotassica e metterlo in una gabbia di recupero calda, mentre si monitora fino a quando la coscienza non viene riacquistata. A quattro settimane dopo la lesione, misurare l'efficacia della lesione dopaminergica utilizzando un test stepping, valutando l'acinesia dell'arto anteriore controlaterale alla lesione. I ratti che presentano tre o meno fasi di regolazione con l'arto anteriore controlaterale devono essere inclusi nello studio come ratti putativi con lesioni 6-OHDA.
Quattro settimane dopo le lesioni 6-OHDA, iniziare il trattamento cronico il lunedì e registrare movimenti involontari anomali mercoledì. Per fare ciò, posizionare il ratto all'interno di un cilindro trasparente con 20 centimetri di diametro e 40 centimetri di altezza e lasciarlo acclimatare per almeno 15 minuti. Assicurarsi che il pavimento sia coperto con il materiale della lettiera e che gli specchi siano posizionati dietro il cilindro per osservare l'animale da tutte le angolazioni possibili.
Posizionare una videocamera ad alta risoluzione per consentire la visualizzazione di movimenti involontari anomali assiali, degli arti e orolinguali. Gli specchi dietro il cilindro consentiranno di tracciare movimenti involontari anomali con un angolo di 360 gradi. La telecamera può essere posizionata leggermente al di sotto del piano con un angolo di 15 gradi rispetto agli animali per osservare movimenti involontari anomali orolinguali.
Quando la posizione è decisa, fissare la fotocamera direttamente al banco. Una volta che l'animale è acclimatato per 15 minuti, rimuovere l'animale dal cilindro e somministrare cinque milligrammi per chilogrammo di L-dopamina o L-dopa appena preparato combinato con 12,5 milligrammi per chilogrammo di benserazide, per via sottocutanea. Rimetti l'animale nel cilindro e avvia un timer per tracciare movimenti involontari anomali.
Utilizzare una videocamera per registrare i movimenti involontari anomali per 180 minuti dopo l'iniezione, a intervalli di 30 minuti, per eseguire il punteggio offline. Dopo i sei periodi di osservazione, i punteggi devono essere assegnati in epoche di uno o due minuti e classificati come assiali, arto o orolinguali. Assicurati di non includere comportamenti normali.
Il trattamento con l-dopa e benserazide deve essere continuato per tre settimane, una volta al giorno, dal lunedì al venerdì. Nell'analisi rappresentativa del corso del tempo, vengono mostrati i punteggi applicati ai movimenti involontari anormali assiali, degli arti e orolinguali nell'arco di tre settimane di somministrazione cronica di l-dopa. È stato notato che le discinesie di picco indotte da L-DOPA, si verificano tra 30 e 90 minuti, con una diminuzione graduale dopo 120 minuti dopo l'iniezione.
Inoltre, la somma dei movimenti anormali assiali, degli arti e orolinguali è stata presentata sugli individui, segnando giorni e settimanalmente per tre settimane di somministrazione cronica di L-DOPA. Il protocollo dei movimenti involontari anomali è di solito per la ricerca di nuovi strumenti terapeutici con potenziale traslazionale antidiscinetico.
