I neutrofili sono cellule terminalmente differenziate e attualmente non ci sono linee cellulari per ricapitolare completamente la biologia dei neutrofili. Quindi è necessario ottenere neutrofili puri, inattivati, sani e freschi per studiare la loro biologia. Questo metodo di aggiornamento combina gradiente di densità, sedimentazione, lisi delicata per ottenere una preparazione neutrofila pura.
È facile da configurare, richiede attrezzature semplici e poca pratica. L'aspetto tecnico, come la stratificazione del gradiente, di questo metodo richiederà un po 'di pratica da padroneggiare, ma una volta perfezionato il gradiente gli altri passaggi dovrebbero venire come un gioco da ragazzi. Inizia sterilizzando il cappotto buffy, la confezione e il cappuccio laminare.
Quindi aggiungere 10 millilitri di sangue in un tubo da 50 millilitri. Per diluire il sangue per un detergente di gradiente, aggiungere il 5% FBS / HBSS e truccare il volume fino a 35 millilitri. Dopo aver chiuso il coperchio, capovolgere il tubo più volte per la miscelazione e quindi tenere il tubo capovolto per ottenere il fondo privo di globuli rossi.
Aggiungere 10 millilitri del mezzo gradiente di densità direttamente sotto il sangue, assicurandosi che il mezzo e il sangue non si mescolino e l'interfaccia rimanga nitida. Ruotare il tubo a 400 volte g per 30 minuti a temperatura ambiente, assicurandosi di disabilitare il freno. Dopo la rotazione, osservare il gradiente separato in uno strato plasmatico sierico superiore, un anello bianco medio di cellule mononucleate del sangue periferico, uno strato medio gradiente di densità nuvolosa e un pellet inferiore costituito da una sottile banda neutrofila bianca sopra i globuli rossi.
Per rimuovere PBMC, far emergere la pipetta di aspirazione direttamente nello strato PBMC e aspirare completamente mentre lo strato plasmatico sierico viene ridotto man mano che l'anello viene rimosso. Raschiare il lato del tubo con la pipetta di aspirazione per massimizzare la rimozione del PBMC. Rimuovere con attenzione lo strato medio sfumato di densità nuvolosa tra l'anello PBMC e il pellet neutrofilo/RBC.
Per la sedimentazione degli eritrociti, utilizzare una pipetta da 10 millilitro per trasferire il pellet di neutrofili / RBC in un tubo pulito. Quindi aggiungere il 5% FBS/HBSS a un volume finale di 25 millilitri. Aggiungere direttamente nel tubo 25 millilitri della soluzione preriscalata contenente il 3% di destrano/0,9% di NaCl in acqua e mescolare delicatamente per inversione.
Posizionare il tubo su una superficie livellata e non vibrante per 15 minuti. Dopo aver riposto il tubo nella cappa, immergere leggermente la pipetta nel liquido e raccogliere circa 30 millilitri dello strato superiore seguendo la superficie del liquido verso il basso. Ruotare il tubo per ottenere un pellet rosso senza particelle galleggianti nel mezzo.
Per la lisi del RBC residuo, aspirare delicatamente il surnatante senza interrompere il pellet. Aggiungere 25 millimetri di acqua ultrapura sterile direttamente nel tubo e mescolare delicatamente invertendo il tubo per 28 secondi per lisire l'RBC. Quindi, aggiungere immediatamente 25 millilitri di soluzione sterile all'1,8% di NaCl preparata in acqua nel tubo e riportare la soluzione in condizioni isotoniche mescolando delicatamente.
Ruotare il tubo a 200 volte g per tre-cinque minuti con un freno basso per ridurre al minimo la sedimentazione di globuli e piastrine con neutrofili. Per riutilizzare il pellet neutrofilo bianco, aggiungere direttamente il terreno di coltura sul pellet ma non pipettare su e giù. Quindi, scuotere il tubo orizzontalmente da un lato all'altro per ridurre al minimo l'attivazione della cella.
Se si osserva aggregazione o aggregazione cellulare, filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di 70 micrometri per scartare i neutrofili raggruppati. Per valutare la qualità del preparato di neutrofili isolati, colora le cellule con marcatori specifici per neutrofili, eosinofili e un marcatore di attivazione. Dopo aver acquisito 20.000 cellule mediante citometria a flusso, analizzare la purezza e l'attivazione cellulare utilizzando le strategie di gating e determinare la vitalità cellulare utilizzando Annexin V / ioduro di propidio come descritto nel manoscritto di testo.
Il gradiente di densità con una bassa velocità ha prodotto neutrofili con maggiore purezza, mentre un'alta velocità ha comportato un aumento della resa a scapito della purezza. Utilizzando lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, la distribuzione cellulare da sola ha fornito una stima della qualità dell'isolamento cellulare, ma dovrebbe essere preferito l'uso di marcatori cellulari specifici. Le popolazioni cellulari contaminanti identificate erano monociti, linfociti ed eosinofili.
L'enorme resa dei neutrofili è stata raggiunta utilizzando questo protocollo. È stata valutata l'espressione di CD62L. L'intensità fluorescente media per CD62L è diminuita nelle cellule di controllo positive, indicando lo spargimento di CD62L e l'attivazione dei neutrofili.
La salute dei neutrofili deve essere valutata prima di eseguire il test poiché i neutrofili hanno un'emivita relativamente breve e l'attivazione accorcia ulteriormente la vita. Dopo la purificazione dei neutrofili utilizzando il gradiente di densità e le microsfere commerciali, le cellule sono state coltivate per 24 ore e la sopravvivenza cellulare è stata analizzata mediante citometria a flusso. La quantificazione delle cellule vitali ha indicato che la purificazione del gradiente di densità ha portato a cellule più vitali dopo 24 ore rispetto alla purificazione con un kit.
È importante che le fasi di stratificazione sfumata e centrifugazione siano eseguite nel modo più possibile in quanto ciò influirà notevolmente sulla qualità della preparazione. Esperimenti in vitro e saggi biochimici possono essere eseguiti seguendo questa procedura. Inoltre, la selezione negativa potrebbe essere eseguita se sono necessarie cellule ultrapure come negli esperimenti di espressione di citochine e proteine.
