La tecnica di profilazione ribosoma, chiamata anche RIBO-seq, è attualmente lo strumento più efficace per studiare il processo di sintesi proteica in vivo. Il vantaggio di questo metodo è la sua capacità di monitorare la traduzione mappando con precisione la posizione e il numero di ribosomi. RIBO-seq si basa sul fatto che il ribosoma, legando alla molecola di mRNA, protegge il frammento sepolto della trascrizione sulla digestione della ribonucleasi.
I frammenti ottenuti, chiamati impronte ribosomiali, possono essere sequenziati e mappati sulla trascrizione da cui hanno avuto origine, determinando l'esatta posizione dei ribosomi. Contemporaneamente al RIBO-seq, viene eseguito il sequenziamento totale dell'mRNA ad alta velocità effettiva per fornire un punto di riferimento e consentire il confronto dei dati sia da RIBO-seq che da RNA-seq durante l'analisi dei dati. Prima della raccolta delle cellule, è possibile aggiungere facoltativamente il cloramfenicolo alla coltura batterica, alla concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro, per inibire la traduzione.
Incubare la coltura con l'antibiotico per un minuto. Questo passaggio è importante se la raccolta richiede più tempo del solito, poiché l'inibizione della traduzione consente di prolungare il tempo di raccolta del campione. Raccogliere i campioni con un sistema di filtrazione prerifapidito.
È possibile introdurre lo scuotimento per imitare le condizioni di crescita. Interrompere il filtraggio quando tutti i supporti sono passati attraverso la membrana, ma non lasciare asciugare completamente il filtro. Raccogliere pellet batterici raschiando rapidamente le cellule dal disco filtrante utilizzando una scoopula preri warmed e disinfettata.
Posizionare immediatamente l'intera scoopula con le cellule raccolte in un tubo da 50 millilitri riempito con azoto liquido. Il pellet raccolto deve essere completamente ricoperto di azoto liquido. Lasciare congelare accuratamente il pellet e spodedare le cellule congelate utilizzando una scoopula precedentemente raffreddata.
Chiudere il coperchio e assicurarsi che sia perforato. Questo è importante, poiché l'azoto liquido può causare l'esplosione di contenitori chiusi a causa del cambiamento di pressione all'evaporazione. Preparare tubi GMPP, DNA e Eppendorf freschi dedicati alla llysase.
Preparare il tampone di lysis con l'aggiunta di cloramfenicolo, se necessario. Assegnare 500 microlitri di tampone di lisi per campione in tubi Eppendorf separati e metterli sul ghiaccio. Mortaio decontaminato e pestello con disinfettante da laboratorio e 70% di etanolo.
Raffreddare malta e pestello versando azoto liquido nella malta. Trasferire il pellet batterico congelato in una malta prerimente refrigerata e macinarlo in polvere. Aggiungere circa un volume di ossido di alluminio e continuare la macinazione.
Mantenere malta, pestello e le cellule raffreddare versando azoto liquido quando necessario, per non lasciare che il contenuto della malta si scongeli. Poco prima dell'uso, aggiungere GMPPNP e tampone di DNA nell'aliquota del tampone di lisi. Trasferire la soluzione nella malta e continuare la rettifica.
Lasciare che la llysase si scongeli lentamente durante la macinazione. Quando la llysase si scongela completamente, trasferire la miscela nel tubo Eppendorf pre-refrigerato e tornare sul ghiaccio. Centrifuga la lisasi a 20.0000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Trasferire i supernatanti in tubi Eppendorf freschi e pre-refrigerati e metterli sul ghiaccio. Misurare la concentrazione di RNA in ogni campione diluito con NanoDrop. Dividere ogni lisato in due porzioni, da 0,5 a 1 milligrammo di RNA per RIBO-seq e il resto per RNA-seq.
A un milligrammo dell'RNA, aggiungere 3,8 microlitri di MNasi in Tris pH 8 e completarlo con tampone di lysis al volume totale di 500 microlitri. Incubare a 25 gradi Celsius, 300 colpi al minuto, per 45 minuti. Al termine dell'incubazione, pulire i campioni con un kit di pulizia dell'RNA disponibile in commercio.
Preparare il gel TBE poliacrilammide al 15% con otto urea molare e posizionare in un serbatoio con tampone TBE. Pre-eseguire per un minimo di 10 minuti ad una tensione costante di 200 volt. Mescolare i campioni con il buffer di esempio TBE-Urea.
Denaturare a 95 gradi Celsius per un minuto e metterli immediatamente sul ghiaccio. Lavare l'urea iniettando il tampone TBE in pozzi di gel usando una siringa. Caricare i campioni, lasciando uno spazio ben tra di loro per separare ogni campione e prevenire la contaminazione incrociata.
Usa 29 oligo lunghi 29 nucleotidi e un mix di oligo lunghi 26 e 32 nucleotidi come marcatori. Eseguire l'elettroforesi ad una tensione costante di 180 volt. Preparare tampone sterile per l'incubazione notturna.
Una volta terminata l'elettroforesi, macchiare il gel con SYBR Gold. Asportare frammenti del gel tra 26 e 32 nucleotidi con un ago sterile o una lama di rasoio, e posizionare i frammenti di gel in tubi Eppendorf separati. Cambiare l'ago o la lama del rasoio tra i campioni.
Aggiungere 200 microlitri di tampone di incubazione notturno a ogni Eppendorf e incubare i campioni a 10 gradi Celsius, 1000 colpi al minuto, durante la notte. Il giorno dopo, pulire i campioni con il kit di pulizia dell'RNA ed eluirli in 18 microlitri di acqua priva di nucleasi. Le impronte ribosomiali ottenute sono pronte per la preparazione della biblioteca.
Eseguire l'esaurimento dell'RNA ribosomiale per campioni per RNA-seq utilizzando un kit disponibile in commercio. Quindi, pulire i campioni con il kit di pulizia dell'RNA. Eseguire l'idrolisi alcalina come segue;preparare il tampone di idrolisi alcalina, aggiungere un volume del tampone a un volume del campione e incubare a 95 gradi Celsius per 25 minuti.
Aggiungere cinque microlitri di 3 molare acetato di sodio pH 5,5 a ciascun campione per interrompere la reazione. Pulire i campioni con kit di pulizia dell'RNA ed eluirli in 18 microlitri di acqua priva di nucleasi. L'RNA frammentato casualmente ottenuto è pronto per la preparazione della libreria.
Aggiungere 10 microlitri di tampone di reazione 10x e cinque microlitri di polinucleotidi chinasi T4 a ciascun campione. Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora e mezza. Dopo questo tempo, aggiungere tre microlitri di un ATP millimolare e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora.
Quindi, pulire i campioni con il kit di pulizia dell'RNA. Eseguire la preparazione della biblioteca utilizzando il kit disponibile in commercio, secondo il protocollo qui fornito. Eseguire PAGE utilizzando il gel di poliacrilammide al 6%.
Macchiare il gel con SYBR Gold. Frammenti di gel di accisa contenenti le biblioteche. Per i campioni di RNA-seq, la libreria è compresa tra 135 e 180 nucleotidi, e per RIBO-seq, tra 135 e 170 nucleotidi.
Utilizzare aghi sterili o lamette da barba e posizionare i frammenti di gel asportati in tubi Eppendorf separati. Ricordarsi di cambiare l'ago o la lama del rasoio tra i campioni. Aggiungere 100 microlitri di acqua priva di nucleasi a ogni frammento di gel accisa.
E incubarli a 10 gradi Celsius, 450 colpi al minuto, durante la notte. Il giorno dopo, pulisci i campioni con il kit di pulizia del DNA. Le librerie ottenute sono pronte per il controllo della qualità e della quantità con alta sensibilità, elettroforesi dna su chip e quindi per il sequenziamento di nuova generazione.
Le librerie cDNA risultanti presentano una quantità e una qualità adeguate richieste per il sequenziamento di nuova generazione, come verificato da alta sensibilità, elettroforesi dna su chip. Le bande e i picchi che rappresentano le librerie RIBO-seq sono più stretti e meglio definiti, rispetto a questo che rappresentano le librerie RNA-seq. Secondo l'elettroforesi su chip, le librerie hanno l'obiettivo previsto.
I picchi aggiuntivi più vicini a 200 coppie di basi presenti nelle librerie RIBO-seq possono indicare ribosomi ibernanti, impronte ribosomiali non completamente digerite, o artefatti, ad esempio, rRNA, e possono essere scartati durante l'analisi bioinformatica quando i dati ottenuti dal sequenziamento vengono tagliati e il tRNA rRNA viene filtrato. La quantità media di cDNA generata nella preparazione della libreria è di 32 nanogrammi, fornendo una quantità sufficiente di materiale necessaria per il sequenziamento di nuova generazione. Dopo il controllo di qualità mediante elettroforesi su chip, le librerie sono state tirate per il sequenziamento a coppia singola e a 50 basi sulla piattaforma NextSeq 500 di un Illumina.
Il taglio degli adattatori e delle sequenze di scarsa qualità ha comportato da 25 a 47 milioni di letture per campione per campioni di RNA-seq e da 25 a 50 milioni di letture per campione per campioni RIBO-seq. I dati ottenuti sono stati controllati con FastQC. Sia i campioni di RNA-seq che ribo-seq hanno presentato un'ottima qualità.
La mappatura delle librerie preparate secondo il protocollo descritto ha prodotto da 2,4 a 9,6 milioni di letture mappate in modo univoco per campione per campioni RNA-seq e da 2,3 a 10,4 milioni di letture mappate in modo univoco per campioni RIBO-seq. I dati RIBO-seq mostrano una periodicità triplicata e un picco alto e stretto, corrispondente ai ribosomi di avvio e caratteristico delle impronte ribosomiche, che non è osservato nei dati RNA-seq. Inoltre, il grafico che mostra i profili di copertura media delle impronte ribosomiali e dei frammenti di mRNA sulle sequenze di codifica rivela la maggiore proporzione di letture mappate ai CDS nel set di dati RIBO-seq, come previsto.
La visualizzazione delle impronte ribosomiche mappate ha mostrato modelli molto simili rispetto ai risultati ottenuti dallo stesso esperimento eseguito di conseguenza alla procedura RIBO-seq standard, che include il recupero monosoma per ultracentrifugazione del gradiente di saccarosio. Il nostro protocollo è stato utilizzato per studiare la regolazione della traduzione in varie condizioni di crescita, ma può essere applicato per studiare altri aspetti della traduzione, come il rilevamento di siti di iniziazione alla traduzione e nuovi geni codificanti proteine. Il sequenziamento delle biblioteche preparate secondo le nostre linee guida si traduce in dati sufficienti per un'analisi bioinformatica completa.
Il protocollo che presentiamo qui è rapido, facile ed economico e può essere eseguito con apparecchiature di laboratorio standard.
