تقنية التنميط ريبوسوم، وتسمى أيضا ريبو-seq، هي حاليا الأداة الأكثر فعالية لدراسة عملية تخليق البروتين في الجسم الحي. وميزة هذه الطريقة هي قدرتها على رصد الترجمة عن طريق رسم خرائط دقيقة لموقف وعدد من الريبوسومات. ويستند ريبو-seq على حقيقة أن الريبوسوم، عن طريق ربط جزيء مرنا، يحمي جزء مدفون من النص على الهضم ريبونوكليز.
يمكن تسلسل الشظايا التي تم الحصول عليها ، وتسمى آثار أقدام ريبوسومية ، ورسم خرائط لها على النص الذي نشأت منه ، مما يؤدي إلى تحديد الموقف الدقيق للريبوسومات. في وقت واحد إلى ريبو-seq، يتم تنفيذ تسلسل إجمالي إنتاجية عالية مرنا لتوفير نقطة مرجعية وتمكين مقارنة البيانات من كل من ريبو-seq و RNA-seq أثناء تحليل البيانات. قبل حصاد الخلايا، يمكنك إضافة الكلورامفينيكول اختياريا إلى الثقافة البكتيرية، إلى التركيز النهائي من 100 ميكروغرام لكل ملليلتر، لمنع الترجمة.
احتضان الثقافة بالمضادات الحيوية لمدة دقيقة واحدة. هذه الخطوة مهمة إذا كان الحصاد يستغرق وقتا أطول من المعتاد، حيث يسمح تثبيط الترجمة بتمديد وقت جمع العينات. جمع العينات مع نظام الترشيح قبل الحارة.
يمكنك إدخال اهتزاز من أجل محاكاة ظروف النمو. توقف عن التصفية عندما تمر جميع الوسائط عبر الغشاء ، ولكن لا تسمح للمرشح بالجفاف تماما. جمع الكريات البكتيرية عن طريق كشط بسرعة الخلايا من قرص التصفية باستخدام مغرفة مطهرة مسبقا.
ضع على الفور ملعقة كاملة مع الخلايا حصادها في أنبوب 50 ملليلتر مليئة النيتروجين السائل. يجب تغطية بيليه حصادها بالكامل في النيتروجين السائل. دع الكريات تتجمد جيدا، وإزاحة الخلايا المجمدة باستخدام مغرفة تم تبريدها مسبقا.
أغلق الغطاء وتأكد من ثقبه. وهذا أمر مهم، حيث يمكن أن يتسبب النيتروجين السائل في انفجار الحاويات المغلقة بسبب تغير الضغط عند التبخر. إعداد GMPP، مسحة الحمض النووي، وأنابيب إيبيندورف الطازجة المخصصة لليساز.
إعداد تحلل العازلة مع إضافة الكلورامفينيكول إذا لزم الأمر. تخصيص 500 ميكرولتر من العازلة تحلل لكل عينة في أنابيب منفصلة Eppendorf، ووضعها على الجليد. إزالة التلوث هاون والحشرات مع مطهر مختبر و 70٪ الإيثانول.
هاون بارد والحشرات عن طريق صب النيتروجين السائل في قذائف الهاون. نقل بيليه البكتيرية المجمدة في هاون المبردة مسبقا وطحنها إلى مسحوق. إضافة ما يقرب من حجم واحد من أكسيد الألومنيوم ومواصلة طحن.
الحفاظ على هاون، والحشرات، والخلايا باردة عن طريق صب النيتروجين السائل عند الحاجة، لعدم السماح لمحتويات هاون لذوبان. قبل الاستخدام مباشرة ، أضف GMPPNP ومسحة الحمض النووي إلى aliquot العازلة للتحلل. نقل الحل إلى هاون ومواصلة طحن.
دع ال ليساز يذوب ببطء أثناء الطحن. عندما يذوب ال ليساز تماما، نقل الخليط إلى أنبوب إيبيندورف المبردة مسبقا والعودة إلى الجليد. الطرد المركزي lysase في 20، 0000 G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
نقل المضادات العملاقة إلى أنابيب إيبيندورف الطازجة المبردة مسبقا ووضعها على الجليد. قياس تركيز الحمض النووي الريبي في كل عينة مخففة مع NanoDrop. تقسيم كل lysate إلى قسمين، 0.5 إلى 1 ملليغرام من الحمض النووي الريبي لريبو-seq، والباقي لRNA-seq.
إلى ملليغرام واحد من الحمض النووي الريبي، إضافة 3.8 ميكرولتر من MNase في تريس pH 8، وأعلى ذلك مع عازلة تحلل إلى الحجم الإجمالي لل500 ميكرولتر. حضانة في 25 درجة مئوية، 300 طلقة في الدقيقة الواحدة، لمدة 45 دقيقة. عند الانتهاء من الحضانة، قم بتنظيف العينات باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريا.
إعداد 15٪ بولياكريلاميد TBE هلام مع ثمانية اليوريا الضرس، ووضعها في خزان مع مخزن مؤقت TBE. قبل تشغيل لمدة لا تقل عن 10 دقائق في الجهد المستمر من 200 فولت. خلط العينات مع مخزن مؤقت عينة TBE-Urea.
النشوة في 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ووضعها على الفور على الجليد. غسل اليوريا عن طريق حقن TBE العازلة في آبار هلام باستخدام حقنة. تحميل العينات، وترك مسافة بئر واحدة بينهما لفصل كل عينة ومنع التلوث المتبادل.
استخدام 29 النيوكليوتيدات طويلة القلة، ومزيج من 26 و 32 أوليغو النيوكليوتيدات طويلة كعلامات. تشغيل الكهربائي في الجهد المستمر من 180 فولت. إعداد العازلة العقيمة لاحتضان بين عشية وضحاها.
بمجرد الانتهاء من الكهربائي، وصمة عار الجل مع الذهب SYBR. أجزاء المكوس من هلام بين 26 و 32 النيوكليوتيدات مع إبرة معقمة أو شفرة حلاقة، ووضع شظايا هلام في أنابيب منفصلة Eppendorf. تغيير الإبرة أو شفرة الحلاقة بين العينات.
إضافة 200 ميكرولتر من العازلة حضانة بين عشية وضحاها إلى كل Eppendorf واحتضان العينات في 10 درجة مئوية، 1000 طلقة في الدقيقة الواحدة، بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تنظيف العينات مع عدة تنظيف الحمض النووي الريبي، وeeute لهم في 18 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز. آثار أقدام ريبوسومات التي تم الحصول عليها جاهزة لإعداد المكتبة.
أداء استنفاد الحمض النووي الريبي ريبوسومال لعينات من الحمض النووي الريبي-seq باستخدام عدة المتاحة تجاريا. بعد ذلك، تنظيف العينات مع RNA تنظيف عدة. إجراء التحلل المائي القلوية على النحو التالي؛ إعداد العازلة التحلل المائي القلوية، إضافة حجم واحد من العازلة إلى حجم واحد من العينة، واحتضان في 95 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.
إضافة خمسة ميكرولترات من 3 مولار خلات الصوديوم درجة الحموضة 5.5 إلى كل عينة من أجل وقف رد الفعل. تنظيف العينات مع RNA تنظيف عدة، وeeute لهم في 18 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز. الحمض النووي الريبي المجزأ عشوائيا الذي تم الحصول عليه جاهز لإعداد المكتبة.
إضافة 10 ميكرولتر من العازلة رد فعل 10x وخمسة ميكرولترات من كيناز البولي كلوكليوتيد T4 إلى كل عينة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة ونصف الساعة. بعد هذا الوقت، إضافة ثلاثة ميكرولتر من ATP ملليمولار واحد واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
بعد ذلك، تنظيف العينات مع RNA تنظيف عدة. قم بإعداد المكتبة باستخدام المجموعة المتاحة تجاريا، وفقا للبروتوكول المقدم هنا. تنفيذ الصفحة باستخدام هلام البولي أكريلاميد 6٪.
وصمة عار الجل مع الذهب SYBR. أجزاء هلام المكوس التي تحتوي على المكتبات. وبالنسبة لعينات الحمض النووي الريبي- سيك، تتراوح المكتبة بين 135 و180 نيوكليوتيدات، وبالنسبة لريبو-سيك، بين 135 و170 نيوكليوتيدات.
استخدام الإبر العقيمة أو شفرات الحلاقة ووضع شظايا هلام مقتطعة في أنابيب Eppendorf منفصلة. تذكر لتغيير إبرة أو شفرة الحلاقة بين العينات. إضافة 100 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز إلى كل جزء هلام مقتطع.
واحتضانهم في 10 درجات مئوية، 450 طلقة في الدقيقة، بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تنظيف العينات مع مجموعة تنظيف الحمض النووي. المكتبات التي تم الحصول عليها جاهزة للتحكم في الجودة والكمية مع حساسية عالية ، الحمض النووي على رقاقة الكهربائي ، ومن ثم لتسلسل الجيل القادم.
مكتبات cDNA الناتجة تقدم كمية ونوعية مناسبة مطلوبة لتسلسل الجيل التالي ، كما تم التحقق منها من خلال الحساسية العالية ، الحمض النووي على رقاقة الكهربائي. العصابات والقمم التي تمثل مكتبات ريبو-seq هي أكثر ضيقا وأفضل تعريفا، مقارنة مع هذا يمثل مكتبات RNA-seq. وفقا ل electrophoresis على رقاقة ، والمكتبات لديها العدسة المتوقعة.
قمم إضافية أقرب إلى 200 أزواج قاعدة موجودة في مكتبات ريبو-seq قد تشير إلى ريبوسومات السبات، وليس تماما هضم آثار أقدام ريبوسومية، أو القطع الأثرية، على سبيل المثال، rRNA، ويمكن التخلص منها أثناء التحليل المعلوماتية الحيوية عندما يتم اقتطاع البيانات التي تم الحصول عليها من التسلسل ويتم تصفية الحمض النووي الريبي rRNA. ويبلغ متوسط كمية الأقراص المدمجة المتولدة في إعداد المكتبة 32 نانوغراما، مما يوفر كمية كافية من المواد اللازمة لتسلسل الجيل التالي. بعد مراقبة الجودة عن طريق الكهربائي على رقاقة، تم سحب المكتبات لتسلسل زوج واحد و 50 قاعدة على منصة NextSeq 500 في Illumina.
وأدى تشذيب المحولات والتسلسلات ذات النوعية الرديئة إلى 25 إلى 47 مليون قراءة لكل عينة لعينات الحمض النووي الريبي- seq، و25 إلى 50 مليون قراءة لكل عينة لعينات ريبو- سيك. تم فحص البيانات التي تم الحصول عليها مع FastQC مراقبة الجودة. وقدم كل من RNA-seq وريبو-seq عينات ذات نوعية جيدة جدا.
وأسفر رسم خرائط المكتبات المعدة وفقا للبروتوكول الموصوف عن 2.4 إلى 9.6 مليون من القراءات المرسومة بشكل فريد لكل عينة لعينات الحمض النووي الريبي - سيك، و 2.3 إلى 10.4 مليون من القراءات المرسومة بشكل فريد لعينات ريبو- سيك. تظهر بيانات RIBO-seq ثلاث مرات دورية وذروة طويلة وضيقة ، تتوافق مع الريبوسومات البادئة وخصائص آثار أقدام الريبوسومات ، والتي لا يلاحظها بيانات الحمض النووي الريبي- seq. وعلاوة على ذلك، تكشف المؤامرة التي تبين ملامح متوسط تغطية آثار أقدام الريبوسومات وشظايا الحمض النووي الريبي على تسلسل الترميز عن ارتفاع نسبة القراءات المرسومة إلى CDS في مجموعة بيانات ريبو-سيك، كما هو متوقع.
أظهر تصور آثار أقدام الريبوسومات المرسومة أنماطا متشابهة جدا مقارنة بالنتائج التي تم الحصول عليها من نفس التجربة التي أجريت وفقا لإجراء RIBO-seq القياسي ، والذي يتضمن استردادا أحاديا عن طريق الطرد الفائق الانحدار من السكروز. وقد استخدم بروتوكولنا للتحقيق في تنظيم الترجمة في ظروف النمو المختلفة، ولكن يمكن تطبيقه لدراسة جوانب أخرى من الترجمة، مثل الكشف عن مواقع بدء الترجمة وجينات ترميز البروتين الجديدة. ويؤدي تسلسل المكتبات المعدة وفقا للمبادئ التوجيهية إلى بيانات كافية لإجراء تحليل معلوماتي حيوي شامل.
البروتوكول الذي نقدمه هنا سريع وسهل وفعال من حيث التكلفة، ويمكن تنفيذه بمعدات مختبرية قياسية.
