Questo protocollo di isolamento degli epatociti di ratto si basa sulla resezione epatica prima dell'approccio digestivo. Il protocollo introduce un sistema di perfusione integrato compatto e portatile per l'isolamento cellulare. Questa tecnica prevede il ricircolo della collagenasi che riduce il volume di utilizzo della collagenasi e fornisce una maggiore flessibilità nell'estensione del tempo di digestione, garantendo al contempo un'elevata resa per gravità e una funzione specifica degli epatociti.
Metti il topo nel cappuccio. Dopo aver tagliato i muscoli addominali, spingere l'intestino a destra con la parte posteriore della pinza curva. Rompere la membrana sotto il dotto biliare con la punta della pinza curva per avvolgere la sutura attorno alla vena porta e al dotto biliare.
Utilizzare una sutura chirurgica di seta per creare una legatura molto sciolta attorno alla vena porta vicino al fegato, poco prima che la vena si ramifichi a sinistra ea destra in diversi lobi del fegato. Circa due o tre centimetri a monte della prima legatura, poco prima che la vena gastrica si dirama dalla vena porta, crei un foro attraverso il tessuto sotto la vena porta con le punte di due paia di pinze curve. Quindi allungare il foro per sostenere la vena porta durante la cannulazione.
Prevenire l'accumulo di pressione nel fegato riducendo la velocità della pompa a quattro RPM per una portata di circa tre millilitri al minuto. E assicurarsi che il deflusso del tampone privo di calcio dal catetere endovenoso sia ridotto a una lenta flebo. Mentre si sostiene delicatamente la vena porta con una pinza, tenere il catetere endovenoso con la smussatura dell'ago rivolta verso l'alto.
E inserire l'ago nella vena porta con un angolo da 10 a 20 gradi. Quindi avanzare lentamente fino a quando l'intera smussatura è all'interno della vena. L'inserimento corretto dovrebbe comportare lo sbiancamento del colore del fegato.
Avanzare la cannula sopra l'ago e ritrarre l'ago dietro la cannula tirando indietro l'ala con l'indice mentre si tiene il catetere con il pollice e il dito medio. Fissare la vena porta sul catetere con una clip venosa e clip sotto la vena porta per evitare l'interruzione del flusso di perfusing. Quindi, tagliare la vena cava inferiore infraepatica per prevenire l'accumulo di pressione nel fegato e osservare gli impulsi di spurgo del sangue per garantire il taglio corretto.
Aumentare la velocità della pompa a 38 RPM per una portata di circa 33 millilitri al minuto. E lavare il fegato tre volte chiudendo la vena cava inferiore infraepatica con una pinza per due o tre secondi, e poi riaprendola. Per perfondere tutti i lobi del fegato, regolare la posizione della punta della cannula e assicurarsi che sia posizionata prima che la vena porta si ramifichi in diversi lobi del fegato.
Quindi, stringere la legatura sciolta attorno alla vena porta, leggermente a monte del punto di ramificazione, e fissare la posizione della cannula nella vena porta per impedire il riflusso del tampone facendo tre nodi nel punto in cui l'ago duro sostiene la cannula, tra la smussatura e il foro laterale. Dopo la resezione epatica lasciare che il fegato si perfonda con il tampone privo di calcio per 12 minuti. Quindi, stringere il morsetto a rulli del tampone privo di calcio e allentare il morsetto del rullo del tampone di collagenasi per cambiare il tampone di perfusione.
Dopo che il tampone della collagenasi raggiunge il fegato, lavare il fegato tre volte chiudendo la vena cava inferiore sopraepatica per due o tre secondi e riaprendola. Spostare con attenzione il fegato sullo stadio sopra il becher per il ricircolo del tampone della collagenasi tenendo il diaframma con una pinza mentre si sostiene il catetere, facendo attenzione a non tirare il catetere per evitare il distacco accidentale. Digerire il fegato per 12 minuti e interrompere la perfusione quando il fegato perde la sua consistenza marrone liscia e diventa molle.
Prolungare il tempo di digestione, se necessario. Dopo la digestione del fegato tagliare la vena porta rimuovere con cura la cannula. E poi trasferire il fegato in DMEM freddo per isolare gli epatociti.
Picchiettare delicatamente il fegato usando il retro della pinza curva per rompere e staccare la capsula di luccichio. E rilasciare le cellule del fegato ondeggiando delicatamente il fegato in DMEM fino a quando le cellule sono completamente dissociate nel mezzo. La vitalità degli epatociti era compresa tra l'88 e il 94,8%, come determinato dal trip e dal conteggio blu.
La resa di epatociti da ratti di peso compreso tra 200 e 300 grammi era fino a cinque volte 10 all'ottava cellula per isolamento. Le immagini rappresentative mostrano sospensione di cellule epatiche non purificate e sospensione epatocitaria purificata. La purezza degli epatociti isolati era di circa il 96,8%, che è stata quantificata contando le cellule colorate fluorescenti positive all'albumina in relazione al numero totale dei nuclei cellulari.
Nelle immagini rappresentative mostrate in falso colore, il verde rappresenta l'albumina e il blu indica i nuclei cellulari con albumina. I nuclei cellulari senza albumina sono evidenziati in rosso. Gli epatociti in coltura sandwich formavano canalicoli biliari distinti e avevano un buon contatto cellulare cellulare.
Come dimostrato dai saggi di albumina, urea e citocromo P450, gli epatociti hanno mostrato un'elevata secrezione di urea e albumina. Il terzo giorno, gli epatociti hanno mostrato un'elevata attività enzimatica per CYP1A2, CYP2B1/2 e CYP3B2. Essere mentalmente preparati prima di inserire l'ago nella vena porta.
Al momento dell'inserimento, un chirurgo dovrà continuare senza impulso fino a quando la velocità della pompa non è stata aumentata dopo aver tagliato l'IVC.
