Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni del National Defense Medical College e da una borsa di ricerca per la salute e le scienze del lavoro per la ricerca sulle malattie intrattabili del Ministero della Salute, del Lavoro e del Welfare, Giappone.

Il protocollo sperimentale fu approvato dal Animal Research Committee del National Defense Medical College (n. 16058). Gli animali sono stati mantenuti su chow di laboratorio standard (CLEA Japan Inc, Tokyo, Giappone). Gli animali da laboratorio sono stati trattati in conformità con le linee guida degli Istituti Nazionali di Salute.
1. Raccolta e separazione dei linfociti
NOTA: Poiché i linfociti devono essere freschi e non possono essere conservati, devono essere raccolti dai ratti per ogni esperimento. Inoltre, i linfociti intestinali-tropici devono essere raccolti direttamente dal dotto toracico dove circolano. Tutte le procedure dovrebbero essere completate entro 6 ore e tutti gli strumenti, i guanti e le superfici sono puliti. Al fine di mantenere gli animali in uno stato fisiologicamente stabile, tutti i fluidi salini e altri fluidi utilizzati nell'esperimento devono essere tenuti al caldo.
<ol><li>Formare un tubo di cannula (1 mm di diametro) come una curva di eparina (un raggio di circa 5 mm) dopo averlo imperniato in acqua calda (circa 80-90 °C) e fissarlo a una tavola di plastica usando nastro adesivo con qualche ora di anticipo.</li>
	<li>Anestetizzare un ratto Wistar maschio (8-12 settimane) con iniezione intraperitoneale di una miscela di Midazolam (2 mg / kg), Domitor (0,15 mg / kg) e Betulphar (2,5 mg / kg) e tagliare i peli del corpo dell'addome usando un tagliacapelli. Rimuovere saldamente i capelli dopo la rasatura in modo che i capelli non entrino nella cavità addominale.</li>
	<li>Dopo aver confermato che la profondità stabile dell'anestesia richiesta per la procedura si ottiene con il pizzico, fare un'incisione con forbici chirurgiche orizzontalmente dalla linea mediana all'area sottocostale sinistra. Fare attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni nel peritoneo parietale osservando i vasi sotto la luce.</li>
	<li>Avvolgere lo stomaco con garza bagnata e spostare delicatamente lo stomaco a destra all'esterno del corpo per rivelare gli organi retroperitoneali. Inserire una tacca tra i muscoli dell'eretore della colonna vertebrale e il tessuto adiposo usando forbici chirurgiche e separarli senza mezzi termini con le dita.</li>
	<li>Togliere con cura il tessuto connettivo attorno al dotto toracico. Il tessuto connettivo in eccesso aumenta con l'età. Esporre il condotto toracico da appena sotto i cru a sinistra del diaframma caudally fino a quando non era visibile una lunghezza di 20 mm del condotto toracico. Separare delicatamente le aderenze tra il dotto toracico e l'aorta utilizzando pinzette di precisione o tamponi di cotone bagnati.<ol>
<li>Eseguire attentamente questo processo perché alcuni ratti hanno arteriole ramificate dall'arteria addominale che attraversano il dotto toracico o un dotto toracico corto a causa di una posizione più elevata del plesso linfatico (piccoli dotti toracici che si diffondono come ragnatele). Evitare il contatto non necessario con il dotto toracico per evitare di indurre edema.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Applicare una legatura di una corda (seta 3-0) sul condotto toracico appena sotto i cru a sinistra del diaframma. Il dotto toracico caudale viene disteso.</li>
	<li>Fare un foro (5 mm di diametro) nella parete addominale pugnalando il tagliente delle forbici chirurgiche, passare il tubo di cannula curva a forcina e ligare il tubo sul muscolo iliopsoas in un certo punto. Riempire il tubo di cannula con soluzione salina normale contenente 10 U/mL di eparina.</li>
	<li>Dopo aver posizionato una corda (seta 3-0) sotto il dotto toracico disteso, pugnalare il dotto toracico con il bordo affilatamente tagliato di un tubo di cannula, cannularlo verso la coda di circa 5 mm e ligare il dotto toracico con tubo di cannula per la fissazione.</li>
	<li>Per fornire salina per prevenire la disidratazione, creare un foro (3 mm di diametro) sulla parete anteriore dell'antro dello stomaco usando pinzette di precisione e passare il tubo di silicio (2 mm di diametro) al duodeno attraverso l'anello pilorico. Dopo aver ricucito una ferita e mantenuto gli animali nelle gabbie di Bollman, inizia a infondere saline cariche di zucchero nel duodeno di ogni topo dal tubo di silicio ad una portata di 3 mL / h. Coprire l'intera gabbia con un tovagliolo di carta per tenerlo caldo.</li>
	<li>Fissare il tubo di cannula al foro al centro del coperchio di un tubo conico da 50 ml su ghiaccio contenente 6 Eparina U/ml, siero bovino fetale al 10% e mezzo RPMI 1640 (pH 7.4; vedi tabella dei materiali) e raccogliere linfociti del dotto toracico (TDL) sul ghiaccio. Fare attenzione a non contattare la punta del tubo alla parete del tubo conico per evitare l'occlusione del tubo cannulato a causa della formazione di coaguli di fibrina all'interno del tubo. Il liquido linfatico (circa 20 mL) di cui circa 1,0 x 108~ 109 linfociti può essere ottenuto in 6 ore. Per ottenere i linfociti in anestesia completa, viene monitorato il piano di anestesia e il flusso linfatico viene osservato in modo appropriato. Gli stessi anestetici vengono aggiunti alla stessa dose circa 3 ore dopo che i ratti sono stati messi nella gabbia di Ballman per ottenere continuamente anestesia profonda per 6 ore.</li>
</ol>2. Etichettatura dei linfociti con carbossifluoresceina diacetato succinimidil estere (CFDSE)
<ol><li>Sciogliere il CFDSE(Tabella dei Materiali)nel solfossido di dimetile (DMSO) a 15,6 mM (500 μg di CFDSE sciolto in 60 μL di DMSO).</li>
	<li>Incubare i linfociti (1 x 108~109) in 50 mL di RPMI 1640 con 50 μL di soluzione CFDSE per 30 min a 37 °C come descritto in precedenza10.</li>
</ol>3. Configurazione sperimentale per studi microvascolari
<ol><li>Anestetizzare ratti riceventi (8-12 settimane) con iniezione intraperitoneale di una miscela di Midazolam (2 mg/kg), Domitor (0,15 mg/kg) e Betulphar (2,5 mg/kg) e confermare la profondità dell'anestesia con il pizzico. Bagnare l'addome prima di toeleggiare la pelliccia per ridurre al minimo la contaminazione dei capelli. Quindi aprire l'addome del ratto Wister ricevente tramite un'incisione della linea mediana.</li>
	<li>Metti un topo su una piastra portatile in acciaio inossidabile (circa 120 x 300 mm) con un foro rettangolare intorno al centro coperto da uno scivolo di vetro (24 x 50 mm). Scegli circa 10 cm del segmento ileale inclusi i PP per l'osservazione.</li>
	<li>Mantenere l'intestino il più caldo possibile e umido con soluzione salina tamponata di fosfato (PBS) riscaldata a 37 °C. Immergere la garza che viene utilizzata per coprire l'intestino tenue con PBS.</li>
	<li>Pur dando anestesia continua con isoflurane al 2 % (vedi tabella dei materiali), mettere lo scivolo sul palco del microscopio e scegliere le aree adatte per l'osservazione del microcircolo nei PC in cui alcuni veicoli pesanti attraversano il serosa. Le dimensioni dei PC variano; quelli più grandi sono adatti per l'osservazione del microcircolo utilizzando CLSM. L'intestino tenue non è dritto in alcuni punti; un segmento rettilineo lungo almeno 2 cm senza alcuna tensione è adatto per l'osservazione.</li>
	<li>Coprire il segmento intestinale adiacente e mesentere con cotone assorbente imbevuto di PBS. Posizionare il segmento intestinale tra due batuffoli di cotone arrotolati e posizionarlo il più lontano possibile dal corpo del topo per evitare che venga vibrato dal battito cardiaco e dalla respirazione del topo.</li>
	<li>Utilizzando una siringa da 1 ml, iniettare lentamente (oltre 1 minuto) TDL con etichetta CFSE (1 x 108 cellule) nella vena giugulare dei ratti riceventi. Una rapida iniezione endovenosa può influenzare la circolazione sistemica.</li>
</ol>4. Microcircolazione dei linfociti
<ol><li>Monitorare continuamente i TDL nella microvascolarizzazione dei PC utilizzando il CLSM e registrare su un computer per 3 ore utilizzando la fotografia time-lapse a intervalli di 30 s. La profondità dal serosa all'HEV dei PS è di circa 25 μm, consentendo l'osservazione dello stroma e dei vasi linfatici capillari a una profondità di 30 μm.</li>
	<li>Iniettare Texas Red-dextran (25 mg/kg) nella vena giugulare di ogni ratto ricevente per macchiare il flusso sanguigno e Hoechest 33342 (5 mg/kg) per macchiare i nuclei cellulari.</li>
	<li>(Facoltativo) Per quantificare la dinamica dei linfociti, definire i linfociti aderenti agli HEV per più di 30 secondi come "linfociti adesivi" e linfociti che emigrano dagli HEV allo stroma come "linfociti migratori". Quindi calcolare la percentuale media di migrazione (linfociti migratori / linfociti adesivi + linfociti migratori) per campo visivo (circa 0,3 mm2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking.">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li><li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking:+a+general+overview.">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li><li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li><li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate.">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li><li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+collection+of+lymph+from+the+liver,+small+intestine,+or+thoracic+duct+of+the+rat.">Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat.</a> The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).</li><li>Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer's+Patches.">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer's+Patches.">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li><li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+"Kaede"+transgenic+mice.">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+of+Infected+Peyer's+Patches+Arises+From+Global,+Interferon-Receptor,+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress.">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li><li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice.">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li><li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer's+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor.">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li><li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy:+Visualizing+Immunity+in+Context.">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity:+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues.">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui abbiamo descritto un protocollo per la raccolta di linfociti intestinali-tropici ingenui e l'osservazione della loro migrazione nei PC di ratto. Queste procedure possono rivelare come i linfociti si muovono nella microvascolarizzazione dei PC e consentire di confrontare visivamente la loro dinamica in una condizione normale o medicata. L'osservazione diretta di queste dinamiche ha molto merito di ottenere un indizio per la modifica immunologica da parte di alcuni farmaci, anche se il periodo osservazionale è limitat...

Le chiazze di Peyer (PPs) sono costituite da centinaia di follicoli linfoidi nella lamina propria dell'intestino tenue. I PP sono divisi in follicoli, la regione interfollicolare e centri germinali situati nella parte inferiore dei follicoli, dove i linfociti sono stimolati dalla presentazione dell'antigene. Non ci sono vasi linfatici afferenti e gli antigeni invadono la lamina propria dal lume intestinale attraverso lo strato cellulare epiteliale. La regione epiteliale che copre i follicoli linfoidi è chiamata epitelio associato al follicolo, all'interno del quale le cellule M intervallate specializzate assuppongono gli antigeni mucosi. Le cellule M assupiscono antigeni dal lato luminale e gli antigeni vengono quindi catturati dalle cellule dendritiche e presentati verso linfociti ingenui che fluiscono nei PPs attraverso l'endotelio di alte venute endoteliali (HEV)1. I PP svolgono un ruolo importante nell'immunità intestinale e sono correlati con la fase iniziale dell'infiammazione. Molte interazioni molecolari coinvolgono l'ingresso di linfociti agli organi linfoidi secondari (SLO), comprese le molecole di adesione, le chemiochine2,3e la sfingosina-1-fosfato4; pertanto, ci sono molti obiettivi terapeutici attesi. Pertanto, osservare la dinamica dei linfociti all'interno dei PPs ci consente di intravedere la fase molto precoce dell'infiammazione ed esaminare l'utilità di diversi farmaci promettenti.
Il metodo qui si concentra sulla migrazione dei linfociti nei PS, che include diverse procedure (cannulazione nel dotto toracico5 e raccolta di linfociti e osservazione a lungo termine dopo l'iniezione nei linfociti raccolti). Poiché queste procedure sono complesse ed è stato difficile capire esattamente come ogni procedura è stata eseguita nelle relazioni precedenti, abbiamo menzionato qui alcuni suggerimenti per ottenere un'osservazione di successo. Ad esempio, la cannulazione dei tubi nel condotto toracico era molto difficile e il tasso iniziale di successo della cannulazione era inferiore al 50%. Tuttavia, abbiamo migliorato il metodo e raggiunto un tasso di successo superiore all'80%. Abbiamo menzionato alcuni altri suggerimenti in questo manoscritto che sono necessari per l'osservazione riuscita per consentire la valutazione quantitativa della migrazione transendoteliale dei linfociti in diverse condizioni.
Nei rapporti precedenti, era difficile comprendere i cambiamenti tridimensionali nel tempo, come l'iniezione endovenosa di inchiostro indiano per macchiare la struttura vascolare di PPs6, o il microscopio era monofocale7. Negli ultimi anni, un metodo osservazionale che utilizza alcuni animali transgenici proteici a fluorescenza fotoconvertibili come i topi Kaede ha chiarito i movimenti cellulari sistematici in vivo8. L'altro studio ha chiarito l'arresto indipendente del CD69 dell'uscita dei linfociti dai PPs9. Abbiamo utilizzato la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) a causa della sua elevata capacità analitica. Ora possiamo facilmente ottenere immagini ad alta risoluzione e usarle per analizzare la dinamica dei linfociti.
In questa relazione, abbiamo dimostrato una serie di metodi per valutare la migrazione dei linfociti nei PC. In primo luogo, abbiamo mostrato metodi raffinati di cannulazione del dotto toracico per raccogliere i linfociti. In secondo luogo, abbiamo migliorato i metodi osservativi in diversi modi per mantenere organi oggettivi ogni volta che è possibile sotto osservazione microscopica, consentendoci di ottenere immagini di alta qualità per 3 ore. In terzo luogo, abbiamo quantificato i movimenti cellulari della migrazione dei linfociti per valutare gli effetti di alcuni farmaci. Questi protocolli modificati contribuiranno allo sviluppo di valutazioni dell'immunologia mucosa.

<table><tbody><tr><td>A1R+</td><td>Nikon</td><td></td><td>Comfocal Laser Scanning Microscopy</td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Hoechest 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>099-06571</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>GIBCO</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red&amp;ndash;dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1863</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches

I linfociti ingenui ricircolano dal sangue ai tessuti linfoidi in condizioni fisiologiche ed è comunemente riconosciuto come un fenomeno importante nell'immunità intestinale. Lo stroma degli organi linfoidi secondari, come le chiazze di Peyer (PS) o i linfonodi mesenterici, sono dove i linfociti ingenui percepisce gli antigeni. I linfociti ingenui circolano attraverso il flusso sanguigno per raggiungere alte venute endoteliali, il portale di ingresso nei PC. Si stima che alcuni immunomodulatori influenzino la migrazione dei linfociti, ma la valutazione precisa della dinamica del microcircolo è molto difficile e stabilire un metodo per osservare la migrazione dei linfociti in vivo può contribuire al chiarimento dei meccanismi precisi. Abbiamo perfezionato il metodo di raccolta dei linfociti dal condotto linfatico e osservando la dinamica dettagliata dei linfociti intestinali-tropici nei PC di ratto. Abbiamo scelto la microscopia a scansione laser confocale per osservare i PC di ratto in vivo e l'abbiamo registrata utilizzando la fotografia time-lapse. Ora possiamo ottenere immagini chiare che possono contribuire all'analisi della dinamica dei linfociti.

Raccolta di linfociti dalla linfa Per preparare il ratto alla cannulazione del dotto toracico, fare un'incisione nel dotto toracico teso, come mostrato nella figura 1, quindi mantenere il ratto nella gabbia di Un Bollman, come mostrato nella figura 2.
Quando i linfociti sono ben raccolti, possiamo ottenere circa 20 mL / 6 h di liquido linfatico contenente circa 107~ 108/ mL linfociti. Tra i TD...

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Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Qui descriviamo un metodo preciso per raccogliere linfociti del dotto toracico e osservare la migrazione dei linfociti intestinali-tropici nelle chiazze del ratto Peyer per 3 ore usando la fotografia time-lapse. Questa tecnica può chiarire come la dinamica dei linfociti sia influenzata in condizioni infiammatorie.

Osservazione microscopica della dinamica dei linfociti nelle patch di Rat Peyer

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

3.9K Views.  National Defense Medical College. Qui descriviamo un metodo preciso per raccogliere linfociti del dotto toracico e osservare la migrazione dei linfociti intestinali-tropici nelle chiazze del ratto Peyer per 3 ore usando la fotografia time-lapse. Questa tecnica può chiarire come la dinamica dei linfociti sia influenzata in condizioni infiammatorie.

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Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Applicazione di un mouse legatura Patch Peyer Assay intestinale Loop per valutare assorbimento da parte delle cellule batteriche M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense against pathogens. It is well established that Peyer&#39;s patches (PPs) have an essential role in the mucosal immune network by hosting several effector T and B cell subsets. A certain fraction of these effector cells, follicular T helper (TFH) and germinal center (GC) B cells are professionalized in the regulation of humoral immunity. Hence, the characterization of these cell subsets within PPs in terms of their differentiation program and functional properties can provide important information about mucosal immunity. To this end, an easily applicable, efficient and reproducible method of lymphocyte isolation from PPs would be valuable to researchers. In this study, we aimed to generate an effective method to isolate lymphocytes from mouse PPs with high cell yield. Our approach revealed that initial tissue processing such as the use of digestive reagents and tissue agitation, as well as cell staining conditions and selection of antibody panels, have great influence on the quality and identity of the isolated lymphocytes and on experimental outcomes.
Here, we describe a protocol enabling researchers to efficiently isolate lymphocyte populations from PPs allowing reproducible flow cytometry-based assessment of T and B cell subsets primarily focusing on&#160;TFH and GC B cell subsets.

In this study, we present a novel and effective protocol for the isolation of lymphocytes from Peyer&#39;s Patches (PPs), which can be subsequently used for in vivo and in vitro functional assays as well as flow cytometric studies of follicular T helper and germinal center B cells.

Unraveling i giocatori chiave di immunità umorale: avanzata e ottimizzata protocollo di isolamento del linfocita da Patches murino placche di Peyer

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

Ricerca sul cancro

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Imaging intravitale del Nodo poplitea Lymph mouse

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Isolare e Immunostaining linfociti e le cellule dendritiche da placche di Peyer murino di

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

Microscopia a forza di trazione per studiare l'attivazione dei linfociti B

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Bioingegneria

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the resolution of peripheral tissue responses. While a variety of methods are used to quantify leukocyte egress from non-lymphoid, peripheral tissues, the cellular and molecular mechanisms that govern context-dependent egress remain poorly understood. Here, we describe the use of in situ photoconversion for quantitative analysis of leukocyte egress from murine skin and tumors. Photoconversion allows for the direct labeling of leukocytes resident within cutaneous tissue. Though skin exposure to violet light induces local inflammatory responses characterized by leukocyte infiltrates and vascular leakiness, in a head-to-head comparison with transdermal application of fluorescent tracers, photoconversion specifically labeled migratory dendritic cell populations and simultaneously enabled the quantification of myeloid and lymphoid egress from cutaneous microenvironments and tumors. The mechanisms of leukocyte egress remain a missing component in our understanding of intratumoral leukocyte complexity, and thus the application of the tools described herein will provide unique insight into the dynamics of tumor immune microenvironments both at steady state and in response to therapy.

Here, we demonstrate the methods for in vivo quantification of leukocyte egress from na&#239;ve, inflamed, and malignant murine skin. We perform a head-to-head comparison of two models: transdermal FITC application and in situ photoconversion. Furthermore, we demonstrate the utility of photoconversion for tracking leukocyte egress from cutaneous tumors.

Quantificazione del leucocita Egress tramite vasi linfatici dalla pelle murina e tumori

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

Biologia

Isolation of Lymphocytes from a Mouse Peyer&#39;s Patch

Source: Yazicioglu, Y. F., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/58490">Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer&#39;s Patches.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we demonstrate the isolation of lymphocytes from a harvested mouse Peyer&#39;s patch. The isolated lymphocytes can be used for further analysis.

Isolamento dei linfociti da un cerotto di Peyer di topo

Source: Yazicioglu, Y. F., et al. Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer&#39;s ...