Con l'esplosione di nuovi materiali per applicazioni mediche, lo screening iniziale dovrebbe essere effettuato sistematicamente, quindi questo protocollo può essere uno strumento fondamentale per i ricercatori che mirano a sviluppare e caratterizzare nuovi biomateriali. La metodologia consente la valutazione quantitativa e qualitativa della citotossicità e della bioattività di biomateriali e formulazioni farmaceutiche, sia solide che liquide. Dopo l'esposizione cellulare, possono essere eseguiti diversi test complementari.
L'istituzione della citotossicità dei biomateriali può avere implicazioni rilevanti per la pratica clinica. Ad esempio, questa conoscenza può consentire al clinico di scegliere il biomateriale più appropriato per un paziente o una condizione specifica. Questo protocollo consente la caratterizzazione di nuovi biomateriali in diverse aree come odontoiatria, ortopedia, chirurgia, oftalmologia, cardiologia, tra gli altri.
Le prestazioni della valutazione dovrebbero consentire di trarre conclusioni sulla bioattività dei biomateriali nei tessuti viventi oltre alla citotossicità. Il più vicino possibile all'inizio dell'esperimento, utilizzare una spatola per caricare il biomateriale appena preparato negli stampi in PVC e lasciare che il materiale si depositi per il periodo di tempo appropriato a temperatura ambiente. Quando il materiale si è solidificato, rimuovere i pellet dagli stampi e metterli in un contenitore di dimensioni appropriate.
Quindi sterilizzare i pellet sotto una lampada a luce ultravioletta per 20 minuti per lato. Per estrarre i biomateriali dai pellet, posizionare i pellet sterilizzati in un tubo da 50 millilitri e aggiungere il mezzo di coltura cellulare appropriato ai pellet. Posizionare i tubi a 37 gradi Celsius per 24 ore.
Il giorno successivo, utilizzare il terreno fresco per diluire l'estratto ai volumi di interesse appropriati. Per valutare la morfologia cellulare in risposta all'esposizione al biomateriale, utilizzare pinzette sterili per posizionare un coprivetro sterile di dimensioni appropriate in ciascun pozzetto di una piastra multi-pozzetto. Aggiungere cellule a ciascun coprislip ad una concentrazione adeguata e metterle nell'incubatrice durante la notte.
Aggiungere il volume appropriato della diluizione dell'estratto di interesse a ciascun pozzetto e restituire le cellule all'incubatore di coltura cellulare per il periodo di incubazione appropriato. Al termine dell'incubazione, aspirare il surnatante da ciascun pozzetto per consentire ai vetrini di asciugare a temperatura ambiente. Quando i campioni si sono asciugati, coprire ciascun foglietto con un volume sufficiente di soluzione di May-Grunwald per un'incubazione di tre minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver rimosso il colorante, lavare i vetrini con un volume appropriato di acqua distillata per un minuto, seguito da un'incubazione di 15 minuti in un volume sufficiente di soluzione di Giemsa. Alla fine dell'incubazione, lavare i vetrini di copertura in acqua corrente e visualizzare le cellule al microscopio ottico. Per valutare la funzione cellulare mediante valutazione dell'espressione proteica dopo l'esposizione al biomateriale di interesse, come dimostrato, lavare ogni pozzetto di cellule con PBS prima di fissare le cellule con paraformaldeide al 3,7% per 30 minuti a temperatura ambiente.
Alla fine dell'incubazione, lavare le cellule due volte con PBS e permeabilizzare le cellule con 0,5% di Tritone in PBS per 15 minuti. Alla fine della permeazione, bloccare la perossidasi con perossido di idrogeno allo 0,3% in PBS per cinque minuti, seguita da due lavaggi con PBS. Dopo il secondo lavaggio, lavare le cellule due volte con 0,5% BSA prima di bloccare il legame non specifico con 2% BSA per 45 minuti.
Alla fine dell'incubazione, lavare le cellule una volta con 0,5% BSA prima di incubare le cellule con un anticorpo primario contro la proteina di interesse per 60 minuti a temperatura ambiente, seguito da cinque lavaggi con 0,5% BSA fresco. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare le cellule con l'anticorpo secondario appropriato di interesse per 90 minuti a temperatura ambiente, seguito da cinque lavaggi di un minuto in 0,5% BSA. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare le cellule con un substrato appropriato e una miscela di cromogeno a 20 microlitri di cromogeno per millilitro di concentrazioni di substrato per 25 minuti.
Alla fine dell'incubazione, lavare le colture due volte con 0,5% BSA in PBS e controcolorare le cellule con ematossilina per 15 minuti. Lavare le cellule controcolorate per cinque minuti con 0,037 moli per litro di ammoniaca. Quindi lavare per cinque minuti con acqua distillata per rimuovere il colorante in eccesso e utilizzare il glicerolo per montare i coperchi sui vetrini.
Per valutare la formazione di depositi mineralizzati all'interno delle colture cellulari trattate con estratto, lavare ogni pozzetto tre volte con PBS prima di fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'ultimo lavaggio, colorare le cellule con un volume appropriato di soluzione colorante rosso alizarina per 20 minuti a 37 gradi Celsius al buio. Alla fine dell'incubazione, lavare i pozzetti con PBS fino a quando il colorante in eccesso è stato completamente rimosso e visualizzare le cellule al microscopio ottico.
Quindi aggiungere la soluzione di estrazione a ciascun pozzetto per un'incubazione di 40 minuti con agitazione a temperatura ambiente e misurare l'assorbanza in ciascun pozzetto su uno spettrofotometro a una lunghezza d'onda di 490 nanometri. Un test MTT può essere utilizzato per ottenere una panoramica della citotossicità dei materiali in modo rapido e diretto misurata dai suoi effetti sull'attività metabolica. Le analisi di vitalità cellulare consentono anche di valutare la citotossicità di un materiale di interesse, poiché i materiali con citotossicità più elevata inducono una percentuale più elevata di morte cellulare alla stessa concentrazione.
Riduzioni superiori al 30% sono considerate critiche e definiscono i materiali come a rischio di bassa biocompatibilità. Inoltre, più materiali citotossici sono caratterizzati da un'accentuata diminuzione della vitalità cellulare e da un profilo di morte cellulare tardiva di apoptosi e necrosi, mentre materiali meno citotossici inducono meno morte cellulare e un profilo più apoptotico e tardivo. La valutazione morfologica completa la valutazione della vitalità cellulare, poiché i cambiamenti nella morfologia cellulare possono indicare un profilo apoptotico o necrotico, oltre a rivelare la presenza di particelle materiali.
Inoltre, gli effetti dei materiali di interesse sull'espressione proteica possono essere osservati indipendentemente dagli effetti sulla vitalità. Ad esempio, in questa analisi, un materiale ha indotto un aumento dell'espressione proteica, mentre l'altro ha promosso una diminuzione significativa. In entrambi i casi, la concentrazione degli estratti ha influenzato direttamente l'espressione proteica.
Nella preparazione degli estratti, è fondamentale un adeguato rapporto tra superficie e volume medio del biomateriale. Inoltre, i campioni devono essere sterilizzati utilizzando metodi che non alterino le loro proprietà. Un altro dettaglio da ricordare sono gli estratti di pH, che dovrebbero essere registrati senza regolazioni.
Se necessario, eseguire controlli aggiuntivi. Gli estratti di biomateriali possono essere utilizzati per studi di chimica e biochimica, nonché per diverse altre tecniche di biologia molecolare. I risultati ottenuti forniscono la base per futuri test di biocompatibilità in vivo.
La valutazione della citotossicità è fondamentale per lo sviluppo di qualsiasi materiale destinato all'uso medico. Pertanto, questo protocollo fornisce un approccio sistematico e completo per valutare nuovi biomateriali o nuove applicazioni di altri già esistenti in diverse aree mediche.
