JAL è stato supportato dalla sovvenzione NIH K08EY030923; Il CMC è stato supportato da una sovvenzione K01 (5K01AR060169) del NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases e da un Novel Research Grant (637405) della Lupus Research Alliance.

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Northwestern University. I topi C57BL/6 erano alloggiati in una struttura barriera presso il Center for Comparative Medicine della Northwestern University (Chicago, IL). Tutti gli animali sono stati ospitati in un ciclo chiaro /scuro di 12/12 ore con libero accesso a cibo e acqua.
1. Raccolta del tessuto oculare
<ol><li>Sacrifica topi C57BL/6J di 10-12 settimane di entrambi i sessi usando la somministrazione regolamentata di anidride carbonica fino a quando il topo non risponde e non inala più. Eseguire la lussazione cervicale o altro metodo secondario approvato per garantire l'eutanasia. NOTA: La perfusione transcardica può essere eseguita per rimuovere i leucociti circolanti che non si trovano nei tessuti oculari. In questo esperimento, la perfusione sistemica non riduce il numero di microglia, monociti, macrofagi o cellule dendritiche rilevate in interi occhi non trattati o trattati al laser. Pertanto, la maggior parte di questi tipi di cellule si trova nei tessuti oftalmici e questo passaggio è facoltativo.</li>
	<li>Per enucleare gli occhi, spingere verso il basso vicino all'orbita oculare mentre si posiziona un paio di forcette curve delicatamente sotto l'occhio mentre si distingue dalla presa. Pizzicare le plesse chiuse sotto l'occhio senza spremere l'occhio reale. Dislodge l'occhio dalla congiuntiva circostante (si veda la pubblicazione preliminare)23.</li>
	<li>Tirare l'occhio lateralmente fino a quando il nervo ottico è l'unica connessione rimasta per staccare l'occhio. Il nervo ottico spesso si taglia con tensione, ma una piccola forbice è talvolta necessaria per tagliare il nervo ottico. Mettere l'occhio in freddo 1x Hank's Buffered Saline Solution (HBSS) con calcio e magnesio in tubo microcentrifugo da 1,7 ml.</li>
</ol>2. Digestione del tessuto oculare
<ol><li>Preparare il tampone di digestione contenente 0,1 mg/mL di digestione enzima e 0,2 mg/mL di DNasi in HBSS freddo. Ricostituire inizialmente 5 mg di enzima di digestione in 2 mL di acqua sterile. Preparare una diluizione iniziale di 10 mg/mL di DNasi in HBSS. Per ogni 10 mL del tampone di digestione (sufficiente per 3 animali) mescolare 9,4 mL di HBSS freddo con 0,4 mL di enzima di digestione ricostituito e 0,2 mL di DNasi I diluita. NOTA: Queste concentrazioni sono state determinate empiricamente su più esperimenti per fornire livelli ottimali di colorazione degli anticorpi di singole cellule, riducendo al contempo la morte cellulare. La collagenasi D è stata provata come alternativa all'enzima di digestione con ridotta vitalità cellulare e diminuzione delle celluleCD45 +. Si prega di vedere Discussione per ulteriori dettagli sul processo iterativo per ottimizzare la digestione.</li>
	<li>Al microscopio sezionato con ingrandimento totale 10x, rimuovere la congiuntiva rimanente e il nervo ottico utilizzando forcep fini e forbici a molla in HBSS freddo.</li>
	<li>Spostare gli occhi puliti su un piatto di sezionatura asciutta o su una piccola barca di pesatura. Iniettare 0,15-0,20 mL/occhio del tampone di digestione tramite siringa dotata di ago da 30 G nella cavità vitrea dopo che due ferite perforate sono fatte nell'occhio attraverso l'asse visivo e a 90° di distanza da questa prima ferita per l'uscita del tampone di digestione.</li>
	<li>Tritare gli occhi interi usando forbici a molla e forcep fini con tutti i pezzi più piccoli di 0,5 mm x 0,5 mm. Dissociare il tessuto delle lenti con interruzione meccanica smussata tramite forcep per evitare l'intasamento delle punte delle pipette nei passaggi successivi. Per ogni campione, sciacquare le forcep e le forbici ognuna con 0,75 mL di tampone di digestione in un piccolo piatto. Utilizzare un nuovo piatto per ogni campione.</li>
	<li>Trasferire il contenuto del piatto in un tubo di dissociazione sul ghiaccio utilizzando pipetta P1000 facendo attenzione a non perdere alcun materiale nel trasferimento della pipetta. Risciacquare il piatto con ulteriori 1,5 ml di tampone di digestione portando il volume totale nel tubo di dissociazione a 3,25-3,50 ml.</li>
	<li>Posizionare il tubo di dissociazione invertito sul dissociatore elettronico e eseguire il ciclo "m_brain_03_01", costituito da una rotazione unidirezionale di 1 min a 200 giri/min a temperatura ambiente, che è un programma precaricato. Assicurarsi che tutto il tessuto si trova nella parte inferiore del tubo di dissociazione a contatto con il tampone di digestione e il rotore per questo e tutti i passaggi rimanenti.</li>
	<li>Posizionare il tubo di dissociazione nell'incubatore di scuotimento per 30 minuti a 200 giri/min a 37 °C.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.6 e 2.7 una volta in più. Dopo la seconda incubazione di 30 minuti eseguire un'ultima digestione meccanica utilizzando dissociatore elettronico come nella fase 2.6.</li>
	<li>Interrompere la reazione aggiungendo 10 ml di tampone di flusso freddo e posizionare i tubi sul ghiaccio.</li>
</ol>3. Preparazione della sospensione cellulare
<ol><li>Per creare una sospensione a cella singola, versare la reazione di digestione oculare interrotta attraverso un filtro da 40 μm posto sulla parte superiore di un tubo di centrifuga conico da 50 ml. Utilizzando lo stantuffo da una siringa da 2,5 ml, spingere tutti i restanti pezzi di tessuto oculare non digerito attraverso il filtro.</li>
	<li>Lavare il tubo di dissociazione con 10 ml di flow buffer e risciacquare il filtro prima di utilizzare lo stesso pistone per passare nuovamente pezzi di tessuto oculare non digeriti attraverso il filtro.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.2 utilizzando 5 mL di Flow buffer.</li>
	<li>Lavare il tubo di dissociazione e filtrare con un buffer di flusso finale di 10 ml. NOTA: Il volume totale della digestione e del buffer di flusso è di circa 38-40 mL per ogni campione.</li>
	<li>Centrifugare il tubo conico a 400 x g per 10 min a 4 °C. Decantare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Preparare una soluzione di lysing 1x aggiungendo una soluzione di lysing 10x all'acqua sterile. Rompere il pellet sfarfallando il tubo contro un altro tubo. Per lyse globuli rossi, aggiungere 1 mL di soluzione di lysing 1x per 30 s con vorticoso a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Interrompere la reazione con 20 mL di flow buffer.</li>
	<li>Centrifugare il tubo conico a 400 x g per 10 min a 4 °C. Decantare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Dissociare il pellet sfarfallando il tubo contro un altro tubo. Aggiungere 5 ml di HBSS freddo 1x per tubo.</li>
	<li>Tubi di centrifuga a 400 x g per 10 min a 4 °C. Aspira il supernatante.</li>
</ol>4. Colorazione della sospensione cellulare per fagociti mononucleari
<ol><li>Preparare 0,5 mL di macchia Viva/Morta per campione diluire il colorante Vivo/Morto 1:5.000 in HBSS freddo.</li>
	<li>Aggiungere la macchia Live/Dead a ciascun campione utilizzando una pipetta P1000 assicurandosi di dissociare completamente il pellet. Trasferire campioni in tubi microtitolo da 1,2 ml.</li>
	<li>Prendere una piccola aliquota (10 μL) per contare le cellule usando un emocitometro o un contatore automatico delle celle (vedere 4.4). Incubare campioni con macchia viva / morta per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Contare le celle usando Trypan blue per determinare il numero di celle vive per campione. NOTA: In genere, 2 occhi di un topo C57BL/6J di 10-12 settimane contengono meno di 2 x 106 cellule viventi.</li>
	<li>Lavare i campioni aggiungendo 400 μL di tampone di flusso freddo. Tubi di centrifuga in un micro portatubi a 400 x g per 10 min a 4 °C. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Resuspend cellule completamente in 500 μL di tampone di flusso freddo. Tubi di centrifuga in un micro portatubi a 400 x g per 10 min a 4 °C. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Bloccare fino a 5 x 106 cellule viventi in 50 μL di blocco Fc (diluizione 1:50 nel tampone di flusso freddo del CD16/CD32 del ratto purificato). Se più di 5 x 106 cellule viventi, aumentare i volumi in modo appropriato.</li>
	<li>Aggiungere il blocco Fc al pellet assicurandosi di dissociare completamente il campione. Incubare per 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di soluzione di colorazione degli anticorpi (vedere la tabella 1 per la scelta e la quantità di ciascun anticorpo incluso nella soluzione) per 5 x 106 cellule viventi direttamente alle cellule in blocco Fc e mescolare completamente. Incubare per 30 min a 4 °C. NOTA: Le quantità di anticorpi dipendono dalla configurazione del citometro del flusso e devono essere titole indipendentemente per ogni laboratorio e strumento. Cfr. tabella 2 per la configurazione dello strumento di filtri e specchi. Per titolare gli anticorpi, inizia con la raccomandazione del produttore e calcola l'indice di colorazione. Eseguire una prova di concentrazioni di anticorpi variabili (sia al di sopra che al di sotto della raccomandazione del produttore) e scegliere la concentrazione più bassa di anticorpi in cui viene mantenuto l'indice di colorazione. Inoltre, assicurarsi che la colorazione positiva sia meno luminosa del controllo monocolore. Utilizzare celle non macchiate per assicurarsi che le celle macchiate negativamente siano in scala e abbiano un picco a o meno di 1 x 102. Utilizzare una fluorescenza meno un controllo per definire le celle macchiate positivamente.</li>
	<li>Lavare i campioni aggiungendo 700 μL di tampone di flusso freddo. Tubi di centrifuga in un micro portatubi a 400 x g per 10 min a 4 °C. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Opzionalmente, dopo la colorazione degli anticorpi, i campioni possono essere fissati con 500 μL di paraformaldeide al 2% nel tampone di flusso. Fissare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, eseguire un lavaggio come descritto nella 4.10. Conservare campioni fissi a 4 °C. Le perline di conteggio devono essere aggiunte il giorno della raccolta dei dati della citometria del flusso. I campioni fissi devono essere eseguiti sul citometro di flusso in 1-2 giorni. ATTENZIONE: La paraformaldeide è corrosiva e un pericolo per la salute.</li>
	<li>Lavare nuovamente i campioni utilizzando 500 μL di tampone di flusso freddo. Tubi di centrifuga in un micro portatubi a 400 x g per 10 min a 4 °C. Aspirare metà del supernatante senza disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Resuspend pellets e trasferire in un pozzo 96, piastra di dosaggio con fondo a U. Piastra di centrifuga a 400 x g per 5 min a 4 °C. Per decantare il supernatante, capovolgere la piastra e in un forte shake sganciare il liquido in un lavandino, senza disturbare il pellet.</li>
	<li>In un nuovo tubo di micro mento da 1,2 ml, posizionare 50 μL di perline di conteggio ben vortexate.</li>
	<li>Resuspend pellets in 96 piastra di pozzo in 200 μL di tampone di flusso freddo. Aggiungere la miscela cellulare sulla parte superiore delle perline del passaggio precedente. Eseguire su citometro di flusso in volume totale di 250 μL / micro tubo di formicolio.</li>
</ol>5. Raccolta dei dati di citometria del flusso
<ol><li>Accendere e preparare il citometro a flusso. Le istruzioni qui elencate sono per un citometro laser modificato(tabella 2).</li>
	<li>Eseguire un campione di test, che include una piccola aliquota per ogni campione, per assicurarsi che tutte le celle siano in scala per ogni rilevatore. Regolare le tensioni in modo che tutte le celle siano in scala.</li>
	<li>Eseguire controlli a colori singoli (SCC) per ogni fluoroforo utilizzato nel cocktail di colorazione (Tabella 3). Posizionare il tubo del micro titer in un tubo di polistirolo da 5 ml più grande per posizionarlo sullo stadio del citometro di flusso. NOTA: I fluorofori delle radici come BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) e Alexa700 non richiedono lo stesso anticorpo del cocktail (ad esempio, CD19 PE per CD64 PE). Tuttavia, i fluorofori tandem come PE-CF594, PE-Cy7 o APC-Cy7 richiedono lo stesso anticorpo per scc come cocktail a causa della potenziale dissociazione dei fluorofori coniugati.<ol>
<li>Creare l'SCC per BV421 aggiungendo 2 gocce di perline di compensazione a un tubo di piastrellatura da 1,2 ml insieme a 1 μL di CD11c BV421 anti-mouse del criceto. Le perline di compensazione sono usate perché CD11c BV421 è un sottotipo lambda IgG piuttosto che kappa come descritto al 5.3.3. Incubare per 15 minuti a 4 °C. Aggiungere 0,2 mL di buffer di flusso.</li>
		<li>Crea l'SCC per il colorante Live/Dead aggiungendo una goccia di perline di colorazione positive (cappuccio verde) dalle perline reattive dell'ammina, seguita da 1 μL di colorante Vivo/Morto. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Aggiungere una goccia delle perline negative (tappo bianco) dalle perline reattive dell'ammina. Aggiungere 0,2 mL di buffer di flusso.</li>
		<li>Creare i restanti SCC aggiungendo una goccia di perline di colorazione positive (cappuccio verde) dal set di perline Ig kappa anti-ratto e anti-criceto, seguito dalla quantità di anticorpi elencata(tabella 3)in un tubo di tattuccio da 1,2 ml. Incubare per 15 min a 4 °C. Aggiungi una goccia delle perline negative (berretto bianco) dal set di perline Ig kappa anti-ratto e anti-criceto. Aggiungere 0,2 mL di buffer di flusso.</li>
		<li>Vortice tutte le miscele di perline completamente. Conservare scc a 4 °C per un massimo di 3 giorni. NOTA: L'SCC per topi reporter fluorescenti è cellule non contaminate.</li>
		<li>Quando si eseguono SCC, impostare tensioni tali che il campione SCC abbia un picco maggiore di qualsiasi fluorescenza per un campione di celle nello stesso canale del rivelatore. Inoltre, le tensioni devono essere impostate in modo che qualsiasi SCC abbia almeno una differenza di log 0,5 tra il picco dell'istogramma nel canale di interesse rispetto a qualsiasi altro canale (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esegui esempi su eventi di mantenimento "Basso" al secondo sotto 4000. Se la portata non può essere abbassata in modo appropriato, diluire i campioni con un buffer di flusso freddo aggiuntivo. Registrare il volume aggiunto in quanto ciò sarà necessario per il calcolo del conteggio (vedere i risultati rappresentativi).</li>
	<li>Raccogli almeno 3 x 106 eventi per esempio. Questo può essere superiore al numero di cellule a causa di granuli di pigmento e detriti che contano come eventi sul citometro.</li>
	<li>Registrare una fluorescenza Meno Uno (FMO) per ogni fluoroforo diverso da Live/Dead per una corretta strategia di gating nella sezione 6.4. Un FMO è un campione che è stato macchiato con tutti i fluorofori tranne uno.</li>
	<li>Pulire e arrestare il citometro di flusso secondo le istruzioni del produttore o della struttura.</li>
</ol>6. Annotazione dei dati di citometria del flusso
<ol><li>Aprire un nuovo foglio di lavoro utilizzando il software di analisi. Importare file FCS dal citometro per tutti i campioni e i controlli a colori singoli.</li>
	<li>Utilizzare le SCC per creare una matrice di retribuzione.</li>
	<li>Applicare la matrice di compensazione ai campioni macchiati e alle FMO.</li>
	<li>Utilizzare le FMO per determinare la colorazione positiva per disegnare cancelli.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La citometria a flusso multi-parametro consente l'analisi quantitativa di più tipi di cellule in un tessuto complesso. In questo rapporto, descriviamo il rilevamento citometrico del flusso delle popolazioni di fagociti mononucleari, inclusi monociti, cellule dendritiche e sottoinsiemi di macrofagi, dopo lesioni laser nell'occhio del topo. Liyanage et al ha recentemente riportato una strategia di gating simile per rilevare neutrofili, eosinofili, linfociti, PC, macrofagi, macrofagi infiltrati e monociti27. La nostra strategia di gating differisce principalmente dall'aggiunta di CD64. Liyanage et al identifica DC come celle CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c+ e macrofagi come CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- celle. Identifichiamo DC come CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD11c+CD64- celle e macrofagi come CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD64+ celle. L'uso di CD64 per discriminare dc dai macrofagi è benconsolidato 6e questa strategia ci consente di identificare l'eterogeneità dei macrofagi, inclusi i macrofagi CD11c+. La principale limitazione di questo metodo è che non fornisce dati sull'architettura dei tessuti o sulla posizione di cellule specifiche all'interno dell'occhio. Per determinare se queste cellule si trovano nella retina, nel coroide, nell'iride o in un'altra struttura oculare, il nostro protocollo può essere combinato con metodi istologici o modificato per includere una dissezione oftalmica più estesa per eseguire individualmente la citometria del flusso multi-parametro su ogni sottocompartito oculare.
Abbiamo ottimizzato il protocollo per la digestione di interi occhi del mouse per prevenire qualsiasi varianza creata dalla dissezione. Ad esempio, la dissezione delle coppe oculari posteriori con rimozione di cornea, iris e lente potrebbe creare variabilità dall'iride trattenuta o dal materiale corneale (sottosezione) o un aumento della lesione laser alla normale area della coppa oculare posteriore (sovrasezione). Il nostro confronto tra il controllo degli occhi non laserati e laserati rileva l'infiltrazione di fagociti mononucleari a causa di lesioni retinochoridali. Per l'analisi degli effetti delle malattie sistemiche sull'occhio, vale a dire uveite e diabete, è essenziale l'analisi individuale del sottocommento oculare. Il metodo di digestione, nella sezione 2 del protocollo, è il più critico, mentre altri passaggi nelle sezioni 3 - 5 sono stati utilizzati con successo su più tipi ditessuto 24. Siamo arrivati alle nostre condizioni di digestione attraverso un metodo iterativo che ha comportato: (1) test del metodo di digestione chimica (collagenasi D vs enzima di digestione), (2) determinazione della lunghezza della digestione chimica (30, 60 e 90 minuti) e (3) aggiunta di digestione meccanica (nessuna, una, due, tre volte). Ad ogni fase abbiamo giudicato il successo delle condizioni di digestione in base alla vitalità cellulare e al numero di cellule CD45HiCD64+ (infiltrandosi nei macrofagi). La Corte ha riscontrato che l'enzima di digestione (vedi Tabella supplementare dei materiali) ha recuperato più cellule vive della collagenasi D e il tentativo della metà della concentrazione enzimatica di digestione ha comportato meno macrofagi infiltrati. Successivamente, 60 minuti di digestione chimica con digestione meccanica hanno quasi raddoppiato le popolazioni di macrofagi infiltrati. Tre digestione meccanica erano ottimali con il 25-30% di cellule vive di singoletti e le popolazioni di macrofagi più infiltrate. Infine, condizioni di digestione meccanica più veloci hanno causato una grave perdita sia di cellule vive che di macrofagi.
In futuro, proponiamo di estendere il metodo rimuovendo la cornea, l'iride e la lente seguite dalla digestione separata della retina e della coppa oculare posteriore (sclera, coroide ed epitelio pigmentato retinico). Con questa modifica, ci aspettiamo di ridurre le condizioni di digestione a causa delle caratteristiche proteiche e dense della lente e della cornea rispettivamente. Queste riduzioni potrebbero includere una ridotta concentrazione enzimatica di digestione, il passaggio alla collagenasi, una diminuzione del tempo di digestione o una minore quantità di digestione meccanica. Prevediamo condizioni di digestione ridotte complessive per la tazza posteriore degli occhi e ulteriori condizioni di digestione ridotte solo per la retina.
Ulteriori direzioni future includono l'espansione del nostro tradizionale pannello di citometria a flusso multi-parametro a uno strumento laser convenzionale a 6 o citometria a flusso spettrale. La citometria del flusso spettrale consente il rilevamento del fluoroforo su tutto lo spettro, piuttosto che determinato dai filtri disponibili. La citometria del flusso spettrale si traduce in un rilevamento del colore più specifico. Tuttavia, la citometria del flusso spettrale richiede una serie completamente nuova di considerazioni da seguire ed è al di fuori dell'ambito di questo manoscritto. Per maggiori dettagli, si prega di consultare questo recente articolo jove28. I 6 strumenti laser includono un laser ultravioletto, che aggiunge 6-9 rivelatori. Quando si aggiungono marcatori a un pannello di citometria del flusso oculare del mouse, si consiglia il rilevamento di tipi di cellule più oculari. Ad esempio, il cancello di lignaggio potrebbe essere separato per rilevare neutrofili, eosinofili, mastociti, cellule NK e linfociti in modo indipendente. Non è consigliabile aumentare il rilevamento del sottoinsieme dei fagociti mononucleari a causa del piccolo numero di macrofagi allo stato stazionare. Quando aggiungiamo nuovi anticorpi, suggeriamo un'attenta titolazione degli anticorpi.
In sintesi, abbiamo presentato un metodo adattabile e robusto per l'individuazione delle popolazioni di fagociti mononucleari nell'occhio del topo. A causa dei marcatori di superficie cellulare altamente sovrapposti di monociti, cellule dendritiche, macrofagi e microglia, la citometria a flusso multi-parametro è il metodo migliore per rilevare queste popolazioni cellulari. La citometria del flusso può essere utilizzata per l'analisi dei tipi di cellule, la mappatura del destino e/o lo smistamento cellulare per la valutazione trascritomica o proteomica. La sua principale limitazione è la mancanza di architettura tissutale e i risultati chiave possono essere confermati usando l'istologia tradizionale.

Il sistema immunitario innato include più tipi di cellule che stimolano l'attivazione e l'infiammazione del complemento. Le cellule immunitarie innate includono cellule killer naturali (NK), mastociti, basofili, eosinofili, neutrofili e fagociti mononucleari. I fagociti mononucleari, che sono composti da monociti, macrofagi e cellule dendritiche, sono stati implicati nella fisiopatologia di molteplici condizioni oftalmiche tra cui uveite, retinopatia diabetica e degenerazione maculare legata all'età (AMD)1. In questo protocollo, ci concentreremo sull'identificazione dei fagociti mononucleari utilizzando l'analisi citometrica del flusso multi-parametro in un modello di topo di AMD2 neovascolare. Questo protocollo è adattabile per i modelli di topo di retinopatia diabetica e / o uveite, ma è raccomandata una dissezione oculare più estesa a causa della natura sistemica di queste malattie.
I fagociti mononucleari esprimono marcatori di superficie cellulare sovrapposti. Macrofagi e microglia residenti nel tessuto di lunga durata provengono dal progenitore eritemicomieloide derivato dal sacco del tuorlo 3 ,mentreil riciclaggio di macrofagi e cellule dendritiche si differenzia dal progenitore di cellule dendritiche a midollo osseo4. I marcatori di superficie delle celle del mouse comuni a monociti, macrofagi e celle dendritiche includono CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17e il marcatore intracellulare Iba18. Per superare questa sfida, l'analisi trascrittamica di macrofagi, monociti e cellule dendritiche provenienti da più tessuti definisce il CD64 come un marcatore di superficie cellulare specifico del macrofago6. I macrofagi sono stati descritti nell'iride, nella coroide, nel corpo ciliare e nel nervo ottico negli occhi sani3. In alternativa, l'identificazione delle cellule dendritiche è più difficile; il metodo più specifico di identificazione delle cellule dendritiche richiede la mappatura del destino utilizzando il mouse reporter Zbtb46-GFP9. Indipendentemente da questa linea di reporter, l'espressione di CD11c e MHCII in combinazione con l'assenza di CD64 può identificare potenziali cellule dendritiche6,10. Le cellule dendritiche sono state identificate in cornea, congiuntiva, iride e coroide negli occhi normali11. Le microglia sono macrofagi specializzati situati nella retina, protetti dalla barriera emato-retinica e derivati dalle cellule progenitrici del sacco tuorlo12. Di conseguenza, le microglia retiniche possono essere differenziate dai macrofagi derivati dai monociti per i loro livelli fiochi di espressione CD4513 e alti livelli di Tmem119, che è disponibile come anticorpo di citometria aflusso 14. All'attivazione delle microglia, tuttavia, CD45 può essereregolato 15 e Tmem119 può essere regolato verso il basso3, dimostrando la complessità della biologia delle microglia e questo è probabilmente rilevante sia nell'AMD che nel suo modello di mouse. Infine, i monociti possono essere divisi in almeno due sottotipi, inclusi classici e non classici. I monociti classici mostrano CCR2+Ly6Caltaespressione bassa CX3CR1, e monociti non classici dimostrano CCR2-Ly6CbassoCX3CR1marcatori alti5.
A causa della necessità dell'analisi quantitativa dell'espressione marcatore, cioè livelli alti rispetto a bassi/ fiochi, la citometria del flusso multi-parametro è il metodo ideale per la discriminazione tra monociti, macrofagi, microglia e cellule dendritiche nell'occhio e in altri tessuti. Ulteriori vantaggi includono l'identificazione delle sotto-popolazioni, la possibilità di utilizzare lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per ordinare le popolazioni cellulari per l'analisi trascri o proteomica e la mappatura del destino. Il principale svantaggio della citometria a flusso multi-parametro è la mancanza di architettura tissutale. Questo può essere superato dalla dissezione oftalmica nei vari sottocomparti oculari: cornea, congiuntiva, iris, lente, retina e complesso coroide-sclera. Inoltre, è possibile eseguire l'imaging di immunofluorescenza di conferma, ma è limitato dal numero di marcatori e dalla mancanza di una quantificazione robusta.
Studi di associazione a livello genomico hanno collegato più geni di complemento con AMD16. L'attivazione del complemento porta alla produzione di anafilatossina, al reclutamento di leucociti e alla conseguenza infiammazione. Nei topi carenti del recettore del complemento, la lesione laser riduce il reclutamento di fagociti mononucleari e l'area di neovascolarizzazione coroiroidale indotta dal laser (CNV)17. Allo stesso modo, il recettore della chemiochina con motivo C-C 2 (CCR2) topo knockout, che è carente nel reclutamento di monociti nel tessuto, dimostra sia la diminuzione del reclutamento di fagociti mononucleari che l'area CNV indotta dal laser18. Questi dati collegano complementi e fagociti mononucleari con CNV sperimentale e possibilmente AMD neovascolare. A sostegno di questa associazione, i recettori del complemento sono disregolati sui monociti del sangue periferico in pazienti con AMD neovascolare19,20. Questi dati dimostrano una forte associazione tra AMD e fagociti mononucleari.
In questo manoscritto, useremo il modello sperimentale CNV indotto dal laser per caratterizzare le popolazioni di fagociti mononucleari nell'occhio del topo usando citometria a flusso multi-parametro. La CNV indotta dal laser è il modello standard di topo dell'AMD neovascolare, che ha dimostrato l'efficacia dell'attuale terapia amd neovascolare di primalinea 21. Questo protocollo descriverà l'enucleazione degli occhi del topo, la dissezione oculare, la digestione in una singola sospensione cellulare, la colorazione degli anticorpi, la determinazione delle tensioni laser utilizzando controlli a colori singoli e la strategia di gating utilizzando controlli di fluorescenza meno uno (FMO). Per una descrizione dettagliata del modello CNV indotto dal laser, si veda una pubblicazione precedente22. Utilizzando questo protocollo, definiremo microglia, monociti, cellule dendritiche e popolazioni di macrofagi. Inoltre, utilizzeremo MHCII e CD11c per definire ulteriormente sottoinsiemi di macrofagi all'interno del modello CNV indotto dal laser.

<table><tbody><tr><td>0.6 ml microcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>431031</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conicals</td><td>ThermoFisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>2.5 ml syringe</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>7886-1</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyde solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>431032</td><td></td></tr><tr><td>30 G needle</td><td>Exel</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>3ml luer lock syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955457</td><td></td></tr><tr><td>41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conicals</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-well, U-bottom assay plate without lid</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>Amine reactive beads</td><td>ThermoFisher</td><td>A10628</td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>FlowJo</td><td>v 10</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Compensation beads</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>Count beads</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-123</td><td></td></tr><tr><td>Digestion enzyme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>National Optical and Scientific Instruments, Inc.</td><td>DC3-420T</td><td></td></tr><tr><td>Dissociation tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Electronic dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Integra Miltex</td><td>17035X</td><td></td></tr><tr><td>Flow buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow tubes</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Hamster anti-mouse CD11c BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562782</td><td></td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-123</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead dye</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Lysing solution, 10x solution</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Micro titer tube and rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-380</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-mouse CD64 PE</td><td>BioLegend</td><td>139304</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562864</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipet tips</td><td>Denville Scientific</td><td>P2404</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipet tips</td><td>eppendorf</td><td>22491806</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>P20 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipet tips</td><td>Denville Scientific</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipet man</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse B220 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562313</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700</td><td>BD Biosciences</td><td>557958</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD19 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553786</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD4 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562314</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD45 FITC</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552848</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD8 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562315</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Ly6C</td><td>BD Biosciences</td><td>561085</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Ly6G PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562700</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700</td><td>BioLegend</td><td>107622</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Siglec F PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647</td><td>BD Biosciences</td><td>564178</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Labnet</td><td>311DS</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>A12873-01</td><td></td></tr><tr><td>Swinging bucket centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4% solution</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

digestion of whole mouse eyes for multi-parameter flow cytometric analysis of mononuclear phagocytes

Il sistema immunitario innato svolge ruoli importanti nella fisiopatologia oculare tra cui uveite, retinopatia diabetica e degenerazione maculare legata all'età. Le cellule immunitarie innate, in particolare i fagociti mononucleari, esprimono marcatori di superficie cellulare sovrapposti, il che rende l'identificazione di queste popolazioni una sfida. La citometria a flusso multi-parametro consente l'analisi simultanea e quantitativa di marcatori di superficie a più celle al fine di differenziare monociti, macrofagi, microglia e cellule dendritiche negli occhi del topo. Questo protocollo descrive l'enucleazione di interi occhi del topo, la dissezione oculare, la digestione in una singola sospensione cellulare e la colorazione della sospensione a singola cella per marcatori cellulari mieloidi. Inoltre, spieghiamo i metodi appropriati per determinare le tensioni utilizzando controlli a colori singoli e per delineare cancelli positivi utilizzando la fluorescenza meno un controllo. La principale limitazione della citometria a flusso multi-parametro è l'assenza di architettura tissutale. Questa limitazione può essere superata dalla citometria a flusso multi-parametro dei singoli compartimenti oculari o dalla colorazione gratuita dell'immunofluorescenza. Tuttavia, l'immunofluorescenza è limitata dalla sua mancanza di analisi quantitativa e dal numero ridotto di fluorofori sulla maggior parte dei microscopi. Descriviamo l'uso della citometria a flusso multi-parametrico per fornire un'analisi altamente quantitativa dei fagociti mononucleari nella neovascolarizzazione coroiroidale indotta dal laser. Inoltre, la citometria a flusso multi-parametro può essere utilizzata per l'identificazione di sottoinsiemi di macrofagi, mappatura del destino e smistamento delle cellule per studi trascritomici o proteomici.

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Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

Digestione di interi occhi di topo per l'analisi citometrica a flusso multi-parametro dei fagociti mononucleari

Questo protocollo fornisce un metodo per digerire interi occhi in una singola sospensione cellulare ai fini dell'analisi citometrica del flusso multi-parametro al fine di identificare specifiche popolazioni fagocitiche mononucleari oculari, inclusi monociti, microglia, macrofagi e cellule dendritiche.

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

digestion-whole-mouse-eyes-for-multi-parameter-flow-cytometric

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4.8K Views.  Northwestern University. Questo protocollo fornisce un metodo per digerire interi occhi in una singola sospensione cellulare ai fini dell'analisi citometrica del flusso multi-parametro al fine di identificare specifiche popolazioni fagocitiche mononucleari oculari, inclusi monociti, microglia, macrofagi e cellule dendritiche.

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Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

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Neuroscienze

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

La valutazione della retina microglia fagocitaria Funzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando un test citometria a flusso basato su

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Immunologia e infezioni

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Retinal Pericytes Visualization Using Tissue-Clearing and Fluorescent Labeling

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal vasculature. To provide a detailed view of the morphological characteristics of pericytes, this study described a new approach combining the retro-orbital injection of a fluorescent agent, immunofluorescent-staining, and tissue-clearing treatment. Firstly, the fluorescent tomato lectin was injected into the retro-orbital sinus of the live mouse to label the retinal vasculature. After 5 min, the mouse was sacrificed, and its intact retina was carefully removed from the retinal cup and immunofluorescently stained with platelet-derived growth factor receptor &#946; to reveal the pericytes. Additionally, the stained retina was treated with tissue-clearing reagent and whole mounted on the microscope slide. Through these approaches, the retinal vasculature and pericytes were clearly observed in the transparent retina. Under a confocal microscope, we obtained more opportunities to take high-resolution images for further reconstructing and analyzing the morphological characteristics of pericytes along the retinal vascular tree in a three-dimensional view. Methodologically, this protocol offers an effective approach for visualizing pericytes within the retinal vasculature, providing valuable insights into their role under both physiological and pathological conditions.

The pericytes in retinal vasculature were examined by immunofluorescent staining with platelet-derived growth factor receptor &#946; after retro-orbital injection of fluorescent tomato lectin. The labeled retina was further treated with the tissue-clearing method and whole mounted for visualizing the three-dimensional views of pericytes surrounding retinal vasculature under a confocal microscope.

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

Biochimica

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Digestione del fegato murino per un'analisi citofluorimetrica delle cellule endoteliali linfatiche

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

Utilizzando Enhanced fluorescenza verde che esprimono proteine Escherichia Coli per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del Mouse

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Quantificazione di basata su citometria a flusso multicolor dei mitocondri e lisosomi in cellule di T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Measuring Microglial Uptake of Intravitreally-Delivered Fluorescent Particles Using Flow Cytometry

Source: Murinello, S. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54677">Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates flow cytometry for measuring microglial uptake of fluorescent bioparticles after intravitreal delivery in a mouse eye. Flow cytometry detects live cells expressing CD11b and distinguishes phagocytic microglia cells exhibiting green fluorescence from other myeloid cells, including Ly6C-expressing monocytes and Ly6G-expressing neutrophils.

Misurazione dell'assorbimento microgliale di particelle fluorescenti erogate per via intravitreale mediante citometria a flusso

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Digestione di interi occhi di topo per l'analisi citometrica a flusso multi-parametro dei fagociti mononucleari

Riepilogo

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Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi

La valutazione della retina microglia fagocitaria Funzione